專利名稱：花毛茛的組織培養與快速繁殖方法
技術領域：
本發明涉及一種植物的組織培養及繁殖方法，具體涉及花毛茛的組織培養和快速繁殖方法。
背景技術：
花毛茛是毛茛科，毛茛屬的多年生宿根草本植物，具多個紡錘形的塊根，莖單生或少生分枝，有毛，很少有明顯的腋芽，葉腋間生長的基本為花芽。由于其花色鮮艷、色彩豐富、花型豐滿、瓶插壽命長，近年來在國內花卉市場上獲得了很好的效果，但目前種源仍只有依靠進口且進口價格昂貴。花毛茛常規的繁殖方法是采用種子和分株繁殖，但由于花毛茛是異花授粉植物，常規種子繁殖的雜種后代的分離嚴重，性狀不穩定，所以種子繁殖主要用于花毛茛的育種工作中。分株繁殖的后代性狀穩定，但繁殖系數低，難以進行規模化生產和優良品種的大面積推廣。目前花毛茛的組培研究，尤其是花毛茛大規模無性繁殖的的研究報告較少，只有馮莉等人(1997)利用花毛茛的種子為外植體培養獲得無菌苗。從實際操作上看，花毛茛組培的難度表現在由于生長階段無明顯的腋芽和莖尖，而剛從土內萌發的蕖芽又嫩又臟，難于消毒和建立無菌體系，并且在無菌體系建立后增殖率低，難在短時間內進行大規模的生產。
發明內容
本發明的目的是提供一種花毛茛組培快繁的方法，以便建立無菌快繁體系，并在無菌體系中提高增殖率，適宜大規模生產優質種苗。
本發明所述方法經過下列工藝步驟(本發明所用百分比為質量百分比)1、種球催芽種球先在清水中浸泡8-10小時，之后播種于含水量在20-30％的基質中，在10-12℃進行催芽培養，待萌芽長到1-2cM的錐形并未展葉時，將芽從種球基部取下，取完芽后的種球放入基質中繼續催芽；2、外植體滅菌將嫩芽依次在75％的酒精、0.15％的Hgcl2、1.5％的次氯酸鈉溶液中進行消毒滅菌處理，其時間依次是消毒20-40秒，滅菌10-30分鐘，再消毒10-20分鐘，最后用無菌水漂洗至少2次；
3、不定芽誘導培養將經過消毒滅菌后的上述嫩芽在無菌工作環境中接種于下列誘導培養基中MS培養基BA 0.5-2.0mg/LNAA 0.1-0.5mg/L糖 30-40g/L，瓊脂5.5g/L控制PH為6.0，光照時間10-12小時，光照強度為2000Lx，培養溫度為20-22℃，待錐形芽長成有葉的小苗后，將小苗去葉并在相同的培養基上進行繼代轉接2-3次后，在小苗的基部和葉腋間長出2-4個不定芽，繼代4-5代后可得叢生芽；4、不定芽繼代培養將上述叢生芽置于下列增殖培養基中進行繼代培養MS培養基BA 0.2-0.8mg/LNAA 0.1-0.5mg/L，糖 30-40g/L，瓊脂5.5g/L控制PH為6.0，光照時間為10-12小時，光照強度為2000Lx，培養溫度為20-22℃，每15天繼代一次，繼代5-6代；5、生根培養和過渡移栽將上述繼代增殖中得到的不定芽分切成單株，接種在下列生根培養基上MS培養基BA 0.1-0.4mg/L，NAA 0.1 0.4mg/L，糖 30-40g/L，瓊脂5.5g/L控制PH為6.0，光照時間為10-12小時，光照強度為2000Lx，培養溫度為20-22℃，培養15天后，小芽苗長大并生根，洗去附在生根苗上的瓊脂，放入濃度為0.2％的多菌靈溶液中消毒分鐘，直接移栽于腐殖土∶紅土＝10∶1的基質中，待苗葉色濃綠并產生大量須根時，進行移栽種植。
所述MS培養基成分為下表
在研究花毛茛的組培與高效快速繁殖方法的過程中，主要解決了下列難題在外植體的選擇上根據花毛茛的特性，通過種球直接產生錐形芽進行滅菌處理，并利用不同的培養基進行交替培養，同時采取降低培養溫度，加快轉接速度等技術措施，獲得了花毛茛高效快速繁殖的效果。
本發明通過采取種球的相對無菌催芽、取錐形嫩芽滅菌、建立無菌體系，并進行環境、激素、營養和過渡基質等調節，解決花毛茛無菌體系建立困難的問題，并達到了高效快速增殖的目的，實現了花毛茛的規模化生產。其優越性體現在1、提供花毛茛離體組培快繁的成套技術，實現了花毛茛的規模化生產。
2、用種球催芽并取錐形嫩芽作為外植體，對無菌體系的建立是一種新穎而且有效的方法。
3、針對花毛茛習性，利用種球低溫催芽技術，可以分批采芽，1個種球可獲得10-15個嫩芽，結合有效的滅菌技術，每年可獲提組培苗20-30萬株，通過培養基的交替使用可以保證種源在2年后還有很強的增殖率和較低的變異率。
4、在培養過程中，進行20-22℃接近花毛茛生長環境低溫培養，并加快轉接速度使苗的不良生長情況得到改進。
5、進行不同培養階段的激素調節，采取激素混用和輪用，達到提高增殖率和減少變異的目的。
為了更好地說明本發明的實質內容，下面給出本發明的實施例，但本發明的內容并不僅限于這些。
實施例11、種球催芽種球先在清水中浸泡8小時，使種球充分吸水膨脹，然后播于塑料箱內的珍珠巖中，按照隔一層珍珠巖排一層種球的順序依次播入，并用塑料薄膜進行覆蓋保濕，基質的含水量控制在25％。在10-12℃下進行催芽培養，13天芽開始萌發，待萌芽長到1CM并呈錐形但未展葉時，將芽從種球基部取下，取完芽后的種球可以繼續埋于基質中再催芽，以便多次重復采芽；2、外植體滅菌嫩芽采取三步消毒法進行滅菌，先將芽在75％的酒精中表面消毒30秒，然后在0.15％的Hgcl2中滅菌20分鐘，最后再在1.5％的次氯酸鈉溶液中消毒12分鐘，之后用無菌水漂洗3次；3、不定芽誘導培養將經過消毒滅菌后的上述嫩芽在無菌工作環境中接種于下列誘導培養基中
MS培養基(同前)BA2.0mg/L，NAA 0.1mg/L，糖30g/L，瓊脂 5.5g/L控制PH為6.0，光照時間11小時，光照強度為2000Lx，培養溫度為20-22℃，20天后，有約20％的外植體無污染，并從錐形芽長成有葉的小苗，將小苗去葉后在相同的培養基上進行繼代轉接3次后，在小苗的基部和葉腋間長出2-4個不定芽，不定芽的發生與BA濃度呈正相關，但叢生和玻璃化的發生也隨BA濃度的增加而加劇，在誘導培養基上繼代4-5代，使之達到能轉入正常生產時的種源基數；4、不定芽繼代培養①將上述叢生芽置于下列增殖培養基中進行繼代培養MS培養基(同前)BA 0.2mg/LNAA 0.5mg/L糖 40g/L，瓊脂 5.5g/L控制PH為6.0，光照時間為10小時，光照強度為2000Lx，培養溫度為20-22℃，每15天繼代一次，增殖率可達2倍左右，在這個培養基上，既可以保證較高的增殖率，又可以保證組培苗的質量，叢生、變異和玻璃化的發生率很低，在繼代培養基上繼代5-6代后，取出；②置于與步驟3的誘導培養基(BA1.0+NAA0.2)相同的培養基上繼代1-2代；①、②交替使用，可讓一個種球一年生產種苗20-30萬株5、生根培養和過渡移栽將上述繼代增殖中得到的不定芽分切成單株，接種在下列生根培養基上MS培養基(同前)BA0.1mg/LNAA 0.4mg/L
糖 35g/L瓊脂 5.5g/L控制PH為6.0，光照時間為12小時，光照強度為2000Lx，培養溫度為20-22℃，小芽苗明顯長高并生根，不僅根系分布均勻，且根的數量及根粗適中，過渡成活率高，將出瓶后的生根苗洗去瓊脂放入低濃度多菌靈溶液中消毒片刻，直接移栽于腐殖土∶紅土＝10∶1基質中，前期注意保濕和遮陰，前7天加蓋雙層遮陰網，以后逐漸減少遮陰，半月后可完全去除遮陰并適當控水，此時可適當增加光照并輔助噴施葉面肥，待苗葉色濃綠并產生大量須根時，可進行移栽種植。
實施例2除培養基為下列培養基外，其余步驟均同實施例1誘導培養基中MS培養基(同前)BA 0.5mg/L，NAA 0.5mg/L，糖 40g/L，瓊脂 5.5g/L增殖培養基MS培養基(同前)BA 0.8mg/LNAA0.1mg/L糖 30g/L，瓊脂 5.5g/L生根培養基上MS培養基(同前)BA 0.4mg/LNAA0.1mg/L糖 30g/L瓊脂 5.5g/L。
本發明經試驗研究，其結果報告如下1、材料和方法 所用材料為云南省農科院園藝所花卉研究中心進口花毛茛品種“2059”的種球，進行低溫種球催芽后，在不同時期進行取材，分別用種球催芽萌發的嫩芽、栽培后的腋芽及花芽作為外植體進行組織培養。
2、培養基、培養條件、培養過程等均與實施例相同，其結果見表1、表2和表3。
表1不同外植體接種及生長表現
從表1可以看出以在無菌基質中從種球萌發的錐形嫩芽為最佳的外植體材料。
表2不同激素濃度及配比對花毛茛誘導的影響
表3不同生長素對花毛茛生根和成活的影響
從表2可以看出，隨BA濃度增加，增殖率逐步提高，在BA2.0時增殖率最高，但是隨培養代數的增加，變異明顯增加，主要表現為不定芽矮化、葉片不展開，皺縮及黃化。在前期的誘導培養中BA1.0+NAA0.2效果最好，是一種高效有用的誘導培育基，增殖率適中，變異率低。
從表3可見，在NAA0.1-1.0mg/L的培養基上，均會長根，長根時間無明顯差異，但以0.1-0.4mg/L時的生根效果較好，不僅根系分布均勻，且根的數量及根粗適中，過渡成活率高；生長素濃度過高則根系短粗，易脫落，過渡成活率低。幼苗移栽以春初及秋季節最好，此時幼苗成活率高，可達到90％以上，此時氣候涼爽，苗的生長良好。花毛茛在夏季高溫時會自然休眠，夏季移栽溫度太高苗的生長不良。
影響花毛茛快繁增殖的因素繼代時間在花毛茛的培養中，隨著培養時間的延長，小苗，特別是苗上比較老的葉片會褐化死亡，且汾泌物也會使培養基顏色變褐，褐色物的產生又加劇了小苗的死亡，針對這一問題，我們進行繼代周期試驗，結果表明，在12-15天及時進行轉瓶，可以減少或減輕褐化的發生。
溫度影響花毛茛是喜歡冷涼的花卉，過高的溫度會使植株休眠，在組培中，當溫度高時，小苗的長勢差，并伴有褐化發生，在20℃左右的培養溫度下，有利于苗的生長工，在30℃時，半數以上的苗會褐死，這與花毛茛的田間生長習性相一致，田間表現為5月份以后花毛茛開始枯萎死休眠。
權利要求
1.一種花毛茛的組織培養與快速繁殖方法，其特征在于經過下列工藝步驟A、種球催芽種球先在清水中浸泡8-10小時，之后播種于含水量在20-30％的基質中，在10-12℃進行催芽培養，待萌芽長到1-2cM的錐形并未展葉時，將芽從種球基部取下，取完芽后的種球放入基質中繼續催芽；B、外植體滅菌將嫩芽依次在75％的酒精、0.15％的Hgcl2、1.5％的次氯酸鈉溶液中進行消毒滅菌處理，其時間依次是消毒20-40秒，滅菌10-30分鐘，再消毒10-20分鐘，最后用無菌水漂洗至少2次；C、不定芽誘導培養將經過消毒滅菌后的上述嫩芽在無菌工作環境中接種于下列誘導培養基中MS培養基BA 0.5-2.0mg/LNAA 0.1-0.5mg/L糖 30-40g/L，瓊脂5.5g/L控制PH為6.0，光照時間10-12小時，光照強度為2000Lx，培養溫度為20-22℃，待錐形芽長成有葉的小苗后，將小苗去葉并在相同的培養基上進行繼代轉接2-3次后，在小苗的基部和葉腋間長出2-4個不定芽，繼代4-5代后可得叢生芽；D、不定芽繼代培養將上述叢生芽置于下列增殖培養基中進行繼代培養MS培養基BA0.2-0.8mg/LNAA 0.1-0.5mg/L，糖30-40g/L，瓊脂 5.5g/L控制PH為6.0，光照時間為10-12小時，光照強度為2000Lx，培養溫度為20-22℃，每15天繼代一次，繼代5-6代；E、生根培養和過渡移栽將上述繼代增殖中得到的不定芽分切成單株，接種在下列生根培養基上MS培養基BA 0.1-0.4mg/L，NAA 0.1-0.4mg/L，糖 30-40g/L，瓊脂 5.5g/L控制PH為6.0，光照時間為10-12小時，光照強度為2000Lx，培養溫度為20-22℃，培養15天后，小芽苗長大并生根，洗去附在生根苗上的瓊脂，放入濃度為0.2％的多菌靈溶液中消毒分鐘，直接移栽于腐殖土∶紅土＝10∶1的基質中，待苗葉色濃綠并產生大量須根時，進行移栽種植。
2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于在步驟4的不定芽繼代培養過程中，先在繼代培養基上繼代5-6代后，再在誘導培養基上繼代1-2代，如此交替使用。
全文摘要
本發明提供一種花毛茛的組織培養與快速繁殖方法，它采用種球催芽、外植體滅菌、不定芽誘導培養、不定芽繼代培養、生根培養和過渡移栽等工藝步驟，并在所對應的各培養基上進行培養，直至長成生根苗后直接移栽即可。該方法解決了花毛茛無菌體系建立的關鍵技術，同時通過激素、營養、培養環境的綜合調節，達到了進種效率高，增殖速度快，生產技術穩定目的。實現了花毛茛優良品種的規模化生產。
文檔編號A01H4/00GK1613298SQ20031011091
公開日2005年5月11日 申請日期2003年11月7日 優先權日2003年11月7日
發明者吳麗芳, 熊麗, 屈云慧, 王祥寧, 張素芳, 楊春梅, 蔣亞蓮 申請人:云南省農業科學院園藝作物研究所