專利名稱：茶樹頂端幼芽中冬眠期間所表達和阻抑的新的基因序列的克隆的制作方法
技術領域：
本發明涉及Camellia sinensis L.(O.)Kuntze(以下稱作茶)樹的頂端幼芽中冬眠期間所表達和阻抑的新的基因序列的克隆。尤其是，本發明涉及茶的冬眠頂端幼芽中所表達和阻抑的基因[本發明基因是指脫氧核糖核酸(以下叫做DNA)]序列的新的引物3(以下稱作3’)末端的鑒別、克隆和分析。3’末端是指在DNA分子的碳水化合物部分的第3位置具有游離羥基的DNA的末端。
背景技術：
茶樹(Camellia sinensis L.(O.)Kuntze)是一種生長位于在45°N-30°S和150°E-60°W的31個國家的多年生植物。由于是多年生的，該植物經受了數個夏季、冬季和雨季的輪回。頂端幼芽和相連的兩片葉子(以下稱作BATS)被用于制茶。根據它們的可用性，在頻繁的間隙期收獲BATS。通常的環境條件(例如溫度、太陽光照時間以及土壤和大氣濕度等)和茶純系決定收獲的BATS的可用性。
一般認為30℃的溫度和13小時的白天時間對于植物的生長是理想的。當溫度下降低于13℃且白天時間短于11小時15分鐘時，BATS的生長和發育就停止了。BATS的這種生長暫停現象就叫做冬眠。與葉子凋落的植物不同，茶樹不會脫落任何葉子、并且休眠期間保持綠色[Barua，D.N.1989.《茶樹栽培的科學和實踐》(Science and practice in tea culture).茶研究委員會，加爾各答，印度.第509頁]。冬眠是出現在生長于上述環境條件下的茶樹作物中的一種普遍現象(Barua，D.N.1989.《茶樹栽培的科學和實踐》.茶研究委員會，加爾各答，印度.第509頁)。
下表1舉例說明了生長在全球國家的各種茶樹的冬眠期
表1
(數據來自Barua，D.N.1989.《茶樹栽培的科學和實踐》.茶研究委員會，加爾各答，印度.第509頁；Dudeja，V.1992.《今日茶樹》131-5)。
生長臨時暫停或休眠不僅限于茶樹的頂端幼芽、而且在下列其它小塊(plats)和系統中普遍可見a)紫杉屬種的頂端幼芽(Janes；Harry，W.；Gore；Gerald，E.；Wittman；Wayne，K.；Romen；Harry，T.1997.6.1；美國專利#5642587)、山毛櫸樹(Fagus sylvatica；Heide，O.M.1993.《植物生理學》(Physiol.Plant)89187-191)；葡萄樹(Vitus vinifera；Nir，G.，Shulman，Y.，Fanberstein，L.和Lavee，S.1986.《植物生理學》811140-1142；Or，E.，Vilozny，I.，Eyal，Y.和Ogrodovitch，A.2000.《植物分子生物學》(Plant Mol. Biol. 43483-494)；桃樹(Marquat，C.，Vandamme，M.，gendraud，M.和Petel，G.1999.《科學園藝(Hort.)》79151-162；Faye，F.和Floc’h，F.L.J.1999.《植物生理學》154471-476)；薔薇屬(Rosa hybrida；Bris，M.L.，Michaux-Ferrière，N.，Jacob，Y.，Poupet，A.，Barthe，P.，Guigonis，J-M.和Page-Degivry，M-T.L.1999.8月.《植物生理學雜志》26273-281)；楊屬(Populus)(Rohde，A.，Montagu，M.V.和Boerjan，W.1996(在Ahuja，M.R.，Boerjan，W.和Neale，D.B.編輯的《樹的體細胞遺傳學和分子遺傳學》(Somatic Cell Genetics and Molecular Genetics of Trees)中，Kluwer研究院出版，荷蘭，第183-188頁)；Jian，L-c.，Li，P.H.，Sun，L-h和Chen，T.H.H.1997.《實驗植物學雜志》(J.Exp.Bot.)481195-1207)。
b)道格拉斯樅樹的種子(Pseuditsuga menziesii；Taylor，M.A.，Davies，H.V.，Smith，S.B.Abruzzese，A.和Gosling，P.G.1993.《植物生理學雜志》142120-123；Jarvis，S.B.，Taylor，M.A.，Bainco，J.，Corbineau，F.和Davies，H.V.J.1997.《植物生理學》151457-464)；大麥(Hordeum vulgare；Aalen，R.B.Opsahl-Ferstad，H-G.，Linnestad，C.和Olsen，O-A.1994.《植物雜志》5385-396；Stacy，R.A.P.，Munthe，E.，Steinum，T.，Sharma，B和Aalen，R.B.1996.《植物分子生物學》311205-1216)；野燕麥(Avenafatua；Li，B.和Foley，M.，E.1995.《植物分子生物學》29823-831)；番茄(Groot，S.P.C.和Karssen，C.M.1992.《植物生理學》99952-958)；雀麥(Bromus secalinus；Goldmark，P.J.，Curry，J.，Morris，C.，F.和Walker-Simmons，M.K.1992.《植物分子生物學》19433-441)；擬南芥屬(Arabidopsis thaliana；Leon-Kloosterziel，K.M.，Gil，M.A.，Ruijs，G.J.，Jacobsen，S.E.，Olszewski，N.E.，Schwartz，S.H.，Zeevaart，J.A.D.和Koornneef，M.1996.《植物雜志》10655-661；Haslekas，C.，Stacy，R.A.P.，Nygaard，V.，Culiánez-Macià和Aalen 1998.《植物分子生物學》36833-845)；小麥(Triticum aestivum；Morris，C.F.，Anderberg，R.，J.，Goldmark，P.J.和Walker-Simmons，M.K.1991.《植物分子生物學》1995814-821)；
c)馬鈴薯的塊莖(Solanum tuberosum；Macdonald，M.M.和Osborne，D.J.1988.《植物生理學》73392-400)；d)gradiolus球莖(Gladious grndiflorus；Ginzberg，C.1973.《實驗植物學雜志》24558-566)，藏紅花粉(saffron crocus)(Crocus sativusL.；Chrungoo，N.K.和Farooq，S.1988，Acta Physiol Plant，10247-255)；e)洋蔥的球莖(Abdel-Rahman，M.和Isenberg，F.M.R.1974，J.agric.Sci.camb.，82113-116)；晚香玉(Polyanthus tuberosaL，Nagar，P.K.1995.《科學園藝》6377-82)；郁金香(Reea，A R.1981.《應用生物學年刊》98544-548)；薯蕷(Dioscorea spp；Hasegawa，K.和Hashimoto，T.1973.《植物細胞生理學》14369-377).
因此，在內部或外部的不利條件下通過具有分生組織的植物部分表現出休眠。
在農業體系中休眠的調節已經且將要持續成為一個關鍵的話題。例如，如果種子或塊莖或球莖減少了休眠期，超前發芽將導致生長物損失，本發明就是用它們作為播種物。如果打算為人或動物消耗所用，則在營養和加工質量方面會有損失。在任一情況中，均沒有認識到經濟利益。與此相反，延長的休眠期可導致晚發芽或生長物地中的晚抽芽，這將影響農作物性能和農作物產量。
還有，茶工業的一個主要需求是在休眠普遍可見的地區需要沒有休眠期或至少是休眠期縮短的茶樹。Nakayama，A.和Harada，S.(《茶研究所公報》日本，1962.128-39)和Barua，1969(Two and A Bud.1641-45)指出低溫與短白天時間對誘導茶樹冬眠起作用。因此，建議使用一種植物生長調節劑——赤霉酸以阻斷休眠。但是赤霉酸的作用不是持久性的。而且，結果隨純系的不同而改變(Das，S.1997.博士論文，Gauhati University，Assam；Rustogi，P.N.1980.Two and A Bud.2133)。種子、塊莖和球莖中的研究也得到了同樣的結論(Aalen，R.B.，Opsahl-Ferstad，H-G.，Linnestad，C.和Olsen，O-A，1994，《植物雜志》5385-396；Bagni，N.，Malucelli，B.和Torrigiana，P.1980.《植物生理學》49341-345；DeBottini，G.A.，Bottini，R.和Tizio，R.1982.Oyton。42115-121；Bewley，J.D.和Black，M.1985.《發育和發芽的生理學》Plenum出版，紐約，190-192；Delvallee，I.，Paffen，A.，和deKlerk，G.J.1990.《植物生理學》80431-436；Djilinov，D.，Gerrits，M.，Ivanova，A.，Van Onikelen，H.A.和Dc Klerk，G.J.1994.《植物生理學》91639-644；Ginzberg，C.1973.《實驗植物學雜志》24558-566；Kurashi，S.，Daisuki，Y.，Naoki，S.和Shigeki，H.1998《植物生長調節雜志》83-10)。
上述結果描述了分子方法的使用。使用示差篩選已經從Bromus和Hordeum vulgare的種子克隆了與cDNA相關的一些休眠(Goldmark，P.J.，Curry，J.，Morris，C.F.和Walker-Simmons，M.K.1992《植物分子生物學》19433-441；Aalen，R.B.，Opsahl-Ferstad，H-G.，Linnestad，C.和Olsen，O-A.1994《植物雜志》5385-396)。克隆pBS128是從休眠的Bromus種子分離的，對無休眠種子使用ABA導致這種轉錄的增強表達(Goldmark，P.J.，Curry，J.，Morris，C.F.和Walker-Simmons，M.K.1992《植物分子生物學》19433-441)。已證實這種來自Bromussecalinus的pBS128，它在休眠的而不是無休眠的水合種子中保持高水平，在維持胚芽休眠中起作用。序列分析揭示了編碼蛋白質屬于新近發現的叫做peroxiredoxin的抗氧化劑(Li，B.和Forey，M.E.1997.《植物科學趨勢》2384-389)。序列分析沒有顯示其它報道基因的同源性。有趣的是，存在于發育的大麥種子的胚芽中的轉錄B15C顯示了與克隆pBS12895％的同源性(Aalen，R.B.Opsahl-Ferstad，H-G.，Linnestad，C.和Olsen，O-A.1994《植物雜志》5385-396)。
已經從休眠和無休眠的野燕麥胚芽中克隆了差異表達的部分cDNA片段(Johnson，R.R.，Cranston，H.J.，Chaverra，M.E.和Dyer，W.E.1995.《植物分子生物學》28113-122)。在這幾種克隆之外，發現叫做AFD4和AFN5的兩種克隆非常有趣。推測AFD4(蛋白質Z類似物)編碼的蛋白質是保持種子休眠狀態的發芽阻抑物。AFN5，它在吸入的非常早期已被表達，它可能編碼為信號或發芽的早期初始步驟所需的蛋白質(Johnson，R.R.，Cranston，H.J.，Chaverra，M.E.和Dyer，W.E.1996.《植物休眠、生理學、生物化學和分子生物學》，CAB International，Wallingford，UK.第293-300頁)。也已經鑒定了其它通過使用ABA而誘導的胚芽特異性基因(Hatzopoulos，P.，Fong，F.和Sung，Z.R.1990《植物生理學》94690-695；Vance，V.B.和Huang，A.H.C.1998.《生物化學雜志》2631476-1481)，但還未確定它們與休眠的關系。
下表2舉例說明了有關植物的休眠現象可獲得的信息的情況
已經嘗試按以下方法調節休眠過程(1)Bruce，D.；Eaton，C.D.；Schafer；Ronald，K.和Boise，I.D.在1998年9月22日提交的美國專利#5811372中描述了一種通過延長冷藏時的馬鈴薯的休眠而控制馬鈴薯抽芽形成的方法。在大約16.6ppm的塊莖上使用了某些化學藥品例如chloropham、香芹酚和苯并噻唑(bezothiazole)和一般有效的CIPC(異丙基3-氯苯基氨基甲酸酯)殘基。
(2)Lulai；Edward，C.Orr；Paul，H.，Glynn；Martin，T.在1995年7月25日提交的美國專利#5436226中提出通過使用一種天然的植物生長物質茉莉酮酸酯抑制冷藏條件下的馬鈴薯的抽芽。
(3)Barry；Gerard Francis；Kishore；Ganesh Murthy；Stark；David Martin；Zalewaski；James Conrad在1997年7月15日提交的美國專利#5648249中描述了一種提高貯存在降低的溫度下的馬鈴薯的質量的方法和一種延長貯存的馬鈴薯球莖的休眠的方法。通過用重組的雙鏈DNA分子轉化馬鈴薯植物而生產轉基因馬鈴薯，該DNA分子包括啟動子(來自馬鈴薯或擬南芥屬的冷誘導啟動子)、結構DNA序列(它編碼了一種融合多肽，該多肽包括氨基末端質粒轉運肽和大腸桿菌glgC ADP葡萄糖焦磷酸化酶)和3’末端非翻譯DNA序列(引起翻譯終止和在RNA序列的3’末端加入聚腺苷酸化核苷酸)。起作用的啟動子導致冷藏期間產生塊莖RNA序列、結構DNA序列導致產生RNA序列。已證實這些轉基因馬鈴薯塊莖具有延長的休眠期且可抑制低溫時抽芽。
(4)Kawchuk，L.M.；Armstrong，J.D.；Lynch，D.R.；Knowles，N.R(1998)在1998年8月13日提交的專利#WO9835051 A1中公開了通過抑制基因表達提高低溫貯存的馬鈴薯的質量。發明人用貯存在低溫下的馬鈴薯塊莖生產了具有葡聚糖L型磷酸化酶(GLTP)或葡聚糖H型磷酸化酶(GHTP)酶活性水平下降的轉基因馬鈴薯。
(5)Khan，A.A.(1994)在1994年3月15日提交的美國專利#5294593中討論了在蔬菜、草、樹以及灌木和花的無休眠種子中引入休眠的方法，即通過用赤霉素生物合成抑制劑tetcyclasis對它們進行處理。
(6)Janes，H.W.，Gore，G.E.，Wittman，W.K.和Romen，H.T在1997年7月1日提交的美國專利#5642587中公開了通過增加生物質的生產來增加產量和回收紫杉酚和taxotrene的方法。通過抑制休眠過程和增加溫室中的生長循環數來實現此目的。為了阻斷休眠，將植物在無光線和85％相對濕度的條件下于低溫房中放置30天，然后轉移至溫室(55-80°F，即13℃和27℃；相對濕度75％-80％)中放置40天以進行生長。將所有植物進行冷處理顯示了發育更充沛的幼芽和全部植物生長。未處理的植物停止了生長且一段時間后沒有再生長。
(7)Rieder，G.L.(1984年12月11日提交的美國專利#4487625)討論了一種中斷多年生農作物——葡萄樹的幼芽休眠的方法，即用0.1-10wt％氨腈水溶液噴射，得到了伴有農作物產量增加的花和果實的均相發育。
(8)Illingworth，J.(1997，12，2)在美國專利#5693592中公開了某些含調節生長的化合物(選自脂肪酸酯、脂肪酸酰胺、脂肪醇、脂肪醇鹽、鄰苯二甲酸酯、鄰苯二甲酸酰胺和酰亞胺以及其兩種或更多的混合物)、用于控制休眠終止和休眠的多年生植物的盛開的組合物，這些多年生植物例如有核果(李子、櫻桃、桃等)、梨果(蘋果和梨)、蔓生植物、葡萄、橄欖、溫和果(獼猴桃、無花果)、漿果(草莓、覆盆子、越橘、黑莓和羅苷莓)和堅果(杏樹、胡桃、栗子)，這些植物需要必需的冷刺激以終止幼芽休眠。于期望的幼芽斷裂前的60天的休眠季節中，上述生長調節化合物的不同組合物的不同濃度(0.5wt％至50wt％)被用于不同的植物種類中。本發明可用于提前或推后果樹的幼芽休息的時間。
下面特別給出了有關植物的頂端幼芽的休眠相關性基因的已知技術的情況參考文獻(1)Or，E.，Vilozny，I.，Eyal，Y.和Ogrodovitch，A.2000《植物分子生物學》43483-494，其中描述了葡萄休眠阻斷相關性蛋白激酶(以下稱作GDBRPK)轉錄的鑒別，此轉錄通過氫氨腈對休眠釋放的化學誘導向上調節。GDBRPK含有編碼325個氨基酸的976個堿基對(此后稱為bp)開放讀框。此后是241 bp 3’-非翻譯區域。GDBRPK，大概是作為應激信號的傳感器。
參考文獻(2)Rohde，A.，Montagu，M.V.和Boerjan，W.1996(在Ahuja，M.R.，Boerjan，W.和Neale，D.B.編輯的《樹的體細胞遺傳學和分子遺傳學》中，Kluwer研究院出版，荷蘭，第183-188頁中)，其中得出的結論是幼芽和種子休眠的過程可以具有相似的結果。應注意到此工作不包括任何差異基因表達類型或蛋白質分布研究。該結論是根據在細胞循環特異性啟動子的控制下、對包含嵌合β-葡糖醛酸酶基因的轉基因Populus的研究得出的。因此，這些研究沒有揭示幼芽休眠本身的任何機制或者產生任何與幼芽休眠有關的基因。
現有技術的缺陷為(a)通過將植物暴露于低溫條件下努力較早調節休眠不可能使植物在田地中立住。尤其是，對于例如紫杉、李子、蘋果、無花果、桑屬、杏、核桃和茶樹等植物，由于它們是樹、不可能在罐中生長。
(b)通過噴射化學制劑而努力較早調節休眠將對環境不利，因此會產生環境污染。
(c)至今仍沒有在天然條件下從休眠或無休眠幼芽克隆出基因。僅有一項分離從葡萄樹(Vitis vinfera cv.Perlette)的幼芽克隆的基因的報道。然而，克隆的基因是由于使用氫氨腈而誘導的(Or，E.，Vilozny，I.，Eyal，Y.和Ogrodovitch，A.2000.《植物分子生物學》43483-494)。
(d)在一些情況下，已經從將要置于轉基因植物中的微生物獲得了特殊酶的基因。這引起了關于環境問題和危害。理想的是從生長在本身用于調節休眠現象的相似生態系統中的植物系統獲得相關基因。
(e)沒有休眠過程中所表達和阻抑的基因光譜。
(f)早期發明沒有考慮到的重要之處是用于鑒定和克隆差異表達基因的相同基因控制組成和被處理的樹種。
本發明第一次用一種簡單且可靠的方法避免了上述缺陷，這對于本領域技術人員來說不是顯而易見的。
發明內容
本發明的主要目的是克隆生長在野外田間條件下的茶樹(Camelliasinensis L.(O.)Kuntze)的頂端幼芽中冬眠期間所表達和阻抑的新的DNA序列。
本發明另一個目的是確保用于鑒定和克隆生長在野外田間條件下的茶樹(Camellia sinensis L.(O.)Kuntze)的頂端幼芽中冬眠期間所表達和阻抑的新的DNA序列的植物的同樣基因組成。
本發明還有一個目的是產生生長在野外田間條件下的茶樹(Camelliasinensis L.(O.)Kuntze)的頂端幼芽中冬眠期間所表達和阻抑的基因光譜。
本發明的另一個目的是鑒定生長在野外田間條件下的茶樹的頂端幼芽中冬眠期間所表達和阻抑的基因的3’末端。
本發明的另一個目的是證實用于確立生長在野外田間條件下的茶樹的頂端幼芽中冬眠期間的差異表達的差異表達基因的已鑒定3’末端。
本發明還有一個目的是克隆已鑒定的差異表達基因的3’末端。
本發明仍有一個目的是對已鑒定的克隆基因的3’末端進行測序。
附圖的簡要說明
圖1代表從茶樹的無休眠(ND)和休眠(D)幼芽分離的RNA，M代表RNA標記；圖2代表從茶樹的ND和D幼芽分離的總RNA合成的DNA，T11A、T11C和T11G代表用于用三種分離反應中的總RNA合成cDNA的引物，M泳道包含DNA分子重量標記；圖3代表使用每一泳道底部所示的引物組合在茶樹的ND和D頂端幼芽中所表達和阻抑的基因的3’末端的光譜，每一泳道頂部的數目代表泳道數，箭頭表示差異表達；圖4代表使用每一泳道底部所示的引物組合在茶樹的ND和D頂端幼芽中所表達和阻抑的基因的3’末端的進一步光譜，每一泳道頂部的數目代表泳道數，箭頭表示差異表達；圖5代表使用每一泳道底部所示的引物組合在茶樹的ND和D頂端幼芽中所表達和阻抑的基因的3’末端的進一步光譜，每一泳道頂部的數目代表泳道數，箭頭表示差異表達；圖6代表使用每一泳道底部所示的引物組合在茶樹的ND和D頂端幼芽中所表達和阻抑的基因的3’末端的進一步光譜，每一泳道頂部的數目代表泳道數，箭頭表示差異表達；圖7代表使用每一泳道底部所示的引物組合在茶樹的ND和D頂端幼芽中所表達和阻抑的基因的3’末端的進一步光譜，每一泳道頂部的數目代表泳道數，箭頭表示差異表達；圖8代表使用每一泳道底部所示的引物組合在茶樹的ND和D頂端幼芽中所表達和阻抑的基因的3’末端的進一步光譜，每一泳道頂部的數目代表泳道數，箭頭表示差異表達；圖9代表使用每一泳道底部所示的引物組合在茶樹的ND和D頂端幼芽中所表達和阻抑的基因的3’末端的進一步光譜，每一泳道頂部的數目代表泳道數，箭頭表示差異表達；
圖10代表使用每一泳道底部所示的引物組合在茶樹的ND和D頂端幼芽中所表達和阻抑的基因的3’末端的進一步光譜，每一泳道頂部的數目代表泳道數，箭頭表示差異表達；
圖11代表從圖3-10所示的測序(變性聚丙烯酰胺)凝膠洗脫后基因的差異表達的3’末端的擴增，每一泳道的頂部的第一個數代表圖3-10所示的泳道數，點后的第二個數代表從圖3-10所示的各自泳道的頂部計數的差異表達的條帶數，M代表DNA大小標記；
圖12代表從圖3-10所示的測序(變性聚丙烯酰胺)凝膠洗脫后基因的差異表達的3’末端的進一步擴增，每一泳道的頂部的第一個數代表圖3-10所示的泳道數，點后的第二個數代表從圖3-10所示的各自泳道的頂部計數的差異表達的條帶數，M代表DNA大小標記；
圖13代表從圖3-10所示的測序(變性聚丙烯酰胺)凝膠洗脫后基因的差異表達的3’末端的進一步擴增，每一泳道的頂部的第一個數代表圖3-10所示的泳道數，點后的第二個數代表從圖3-10所示的各自泳道的頂部計數的差異表達的條帶數，M代表DNA大小標記；
圖14代表從圖3-10所示的測序(變性聚丙烯酰胺)凝膠洗脫后基因的差異表達的3’末端的進一步擴增，每一泳道的頂部的第一個數代表圖3-10所示的泳道數，點后的第二個數代表從圖3-10所示的各自泳道的頂部計數的差異表達的條帶數，M代表DNA大小標記；
圖15代表
圖11-14所示基因的洗脫的差異表達的3’末端克隆后的擴增，每一泳道的頂部的第一個數代表圖3-10所示的泳道數，點后的第二個數代表從圖3-10所示的各自泳道的頂部計數的差異表達的條帶數，M代表DNA大小標記；
圖16代表
圖11-14所示基因的洗脫的差異表達的3’末端克隆后的擴增，每一泳道的頂部的第一個數代表圖3-10所示的泳道數，點后的第二個數代表從圖3-10所示的各自泳道的頂部計數的差異表達的條帶數，M代表DNA大小標記；
圖17代表
圖11-14所示基因的洗脫的差異表達的3’末端克隆后的擴增，每一泳道的頂部的第一個數代表圖3-10所示的泳道數，點后的第二個數代表從圖3-10所示的各自泳道的頂部計數的差異表達的條帶數，M代表DNA大小標記；
圖18代表通過Northern雜交證實基因的克隆3’末端的差異表達；
圖19代表通過使用兩個以上克隆的Northern雜交進一步證實基因的克隆3’末端的差異表達；圖20代表來自ND、D和強制ND頂端幼芽的基因數31.2的已鑒定的克隆3末端的表達(冬季將赤霉酸用于D幼芽以強制幼芽進入非休眠期)。
因此，本發明提供了(a)生長在野外田間條件下的Camellia sinensis L.(O.)Kuntze(茶)灌木的頂端幼芽中冬眠期間所表達和阻抑的新的DNA序列；(b)從相同基因組成的茶樹克隆這些序列；(c)生長在野外田間條件下的無休眠和休眠茶樹的頂端幼芽中所表達和阻抑的基因的3’末端的光譜；(d)證實用于確立生長在野外田間條件下的茶樹的頂端幼芽中冬眠期間的差異表達的差異表達基因的已鑒定3末端；(e)使已鑒定基因與生長在野外田間條件下的茶樹幼芽的休眠相關聯的方法；和(f)根據迄今在數據庫中未存放的新序列，對差異表達基因的克隆3’末端進行測序具有單一性。
因此，本發明提供了Camellia sinensis L.(O.)Kuntze(茶樹)灌木或樹種的頂端幼芽中冬眠期間所表達和阻抑的新的DNA序列，所述的序列包括以下所示的序列ID1一4SEQ ID NO15′-ATCGCCGTAA TTGCCATGTT TTCCCTCTCA CCGGAATCCT ACGTTATCC CCTTACCTTC GTGAACATTA CAGTAGGAAT CGGTGGTCCAATTATCAACT TAATTTTGGG CGCATCTGTT CGTGTTAACT AGAAGCCATGTATACATACA ATACAACATG GTTCACTCCT CCTACAGATT ATGAGTTGAACTTTTATAAT AAGTTGTAAT AATGGCTTCT GAATAAGGAG AAGAGGAGCCTCTGTTTGTT TTACTTATTA CAGATGTGAT ATCGTTCAAC AACTTTGATTCTGCGAAAAA AAAAA-3′SEQ ID NO25′- AGAAGTACCT GAAAGGAAGC TTAACGAGGT GAACATCCATTGCAGCCAGC CCTGGAATCT GTACAGGGCA ACTCTGAACC GGAATTATTTTAATAACCCG TGGGCAATGA TTGCAATTAT GGCTCGTTTG GTATTACTTCTACTCACTTA GACACAACTG TATTTACGGT TTTCGCTGGA ATTGTAATTGTTGGAGCGAC AAAATAGATG GTCACAACTT ATTGGTGAGA GTATCAGTGTGCTCTTCTTT ATCGTCTTTA ACTCTCCGTG GTAATTACTT TGACAATATTCATACAT-3′SEQ ID NO35′-GAGACTCAGC TCAGCAATCA TGTTCTAAGT GAATGTCACT CTATCGCCTTCTTGTCCCTC TTAGACATAC TACATCCTCA TTCTGCTAGA AATGAACTCATGTAGGTTTT GAAGTTGGGA ACTTTTGAAA CTGTGTTGTT TGGGTGCTGTCTGTTATACA ATTCTCTCAA CTGCGGAGAA TTGACGTTGG TTGTAGTGGAATTCAACACT TGGGTTTTGT TCTTAGTTAA AAAAAAAAA-3′SEQ ID NO45′-ATAGCTTAGT CACGTGTCTC TTGAGAATGG ACTACGTAGT TGTTAAGTTGGGTGATCAGA AGGCGTTGAT GATGAATGTA TGAAGCAGAG ACTACTGAATGTAATTTTGT TGTTGAAAGA TGAATGATTT ATTAATGCCT GCATATCTTTCTATTGTTTG ATGCCAAACC TTTGGGCACA TTTTTTCTTT CTTTTTGTGATAATGTTCTC TTCTTGCAAA AAAAAAAA-3′
在本發明的一個實施方式中，新的DNA序列是從具有同樣基因組成的茶樹中克隆的。
在本發明的另一個實施方式中，新的DNA序列是從生長于野外田間條件下的具有同樣基因組成的茶樹中克隆的。
本發明的另一個新的DNA序列與茶的冬眠有關。
在本發明的另一個實施方式中，新的DNA序列，是通過任何但不限于扣除雜交法和差示篩選法的方法克隆的。
在本發明的另一個實施方式中，DNA的核苷酸序列如SEQ ID NO1中所示。
在本發明的另一個實施方式中，在SEQ ID NO1中給出的DNA的核苷酸序列僅在茶樹的無休眠頂端幼芽中超量表達。
在本發明的另一個實施方式中，DNA的核苷酸序列如SEQ ID NO2中所示。
在本發明的另一個實施方式中，在SEQ ID NO2給出的DNA的核苷酸序列僅在茶的無休眠頂端幼芽中表達。
在本發明的另一個實施方式中，DNA的核苷酸序列如SEQ ID NO3中所示。
在本發明的另一個實施方式中，在SEQ ID NO3中給出的DNA的核苷酸序列僅在茶的無休眠頂端幼芽中表達。
在本發明的另一個實施方式中，DNA的核苷酸序列如SEQ ID NO4中所示。
在本發明的另一個實施方式中，在SEQ ID NO4中給出的DNA的核苷酸序列僅在茶的休眠頂端幼芽中表達。
在本發明的另一個實施方式中，新的序列能夠被克隆成全長cDNA。
在本發明的另一個實施方式中，新的序列能夠被克隆成全長基因組DNA。
在本發明的另一個實施方式中，新的序列能夠被克隆成重要的序列，例如，但不限于，啟動子序列和調節序列等。
選擇生長和培養于Palampur(32°04’N，76°29’E；海拔高1300m)、Himalayan Bioresoure技術研究所的茶農場、屬于懸鈴木(chinary)型的茶樹。也可以選擇其它類型茶樹即assamica和combad。但是，由于Himachal Pradesh的Kangra地區的懸鈴木(chinary)型的優勢，因此選擇這種特殊純系。
在本發明的一個優選實施方式中，確保了用于鑒定和克隆生長在野外田間條件下的茶樹(Camellia sinensis L.(O.)Kuntze)灌木的頂端幼芽中冬眠期間所表達和阻抑的新的DNA序列的植物的基因組成相同。這對于茶之類的植物是很重要的。茶樹是一種高度異花受粉植物、且由種子生長而成。由于不同的基因組成導致了植物與植物的巨大異種性。長成茶樹的每一種子被認為是其自身的一個克隆。尤其是，對于涉及比較用于克隆受環境條件改變影響的差異表達基因的基因表達類型的發明，例如本發明的目的是比較和克隆從控制且冬眠植物所表達和阻抑的基因，經受環境條件改變的植物具有相同的基因組成是絕對必要的。認識到這一重要方面，就只能選擇一種屬于懸鈴木(chinary)型的茶樹。
在本發明的另一個實施方式中，在無休眠季節(4月)的早晨10點僅從一種灌木收集測量值為1.2-1.5(長)、0.5-0.6cm(周長)的茶樹頂端幼芽。無休眠季節的頂端幼芽生長張開成葉子。這些稱作無休眠幼芽(以下叫做ND)、并且被認為是“控制”在本發明的范圍之內。該灌木產生了數量約100的頂端幼芽。用焦碳酸二乙基酯(以下叫做DEPC)處理的水[為了制備DEPC處理的水，將DEPC加入蒸餾水中至最終濃度為0.1％，接著培養過夜后進行高壓滅菌(即在1.1kg/cm2的壓力下于121℃加熱)]洗滌頂端幼芽、收獲并立即浸入液氮中以冷凍中止細胞活性的細胞成分。
茶樹從11月之前開始休眠。此時期的頂端幼芽不會長大張開成葉子，這被稱作休眠(以下叫做D)幼芽。從收集了ND幼芽的同一種灌木中收集D幼芽。基本上按與ND幼芽相同的方法采集和貯存D幼芽，其測量與ND幼芽大小相似。
從同樣的灌木收集ND和D幼芽保證了所考慮的組織的基因組成相同。
在本發明的另一個實施方式中，分離來自ND和D幼芽的總RNA，采用“差異顯示技術”(Liang，P.，Zhu，W.，Zhang，X.，Guo，Z.，O’Connell，R.，Averboukh，L.，Wang，F.和Pardee，A.B.1994.《核酸研究》221385-1386)以產生茶樹的ND和D幼芽中的表達和阻抑基因的3’末端的光譜。
在本發明的一個優選實施方式中，將茶樹的ND和D幼芽中的表達和阻抑基因的3’末端與一種載體連接得到重組質粒，它轉化成形成一種克隆的適合的大腸桿菌宿主。載體，在本發明中是指能接受外源DNA的DNA序列、并且呈環狀質粒DNA的形式，對所用的抗生素具有抗性。
在本發明的另一個實施方式中，對克隆的基因在茶樹的ND和D幼芽中的表達或阻抑進行測試、以確定克隆的基因與休眠過程之間的聯系。
在本發明的另一個實施方式中，用雙脫氧鏈終止法(Sanger，F.S.，Nicklen，S.和Coulson，A.R.1997.Proc.Natl.Acad.Sci.美國745463-5467)對基因進行測序、以確定基因的單一性。
本發明還有一個實施方式，其中序列數據是用于獲得有關基因調節的重要信息。
在本發明的另一個實施方式中，采用以下技術、例如但不限于農桿菌屬介導的轉化和Biallistic介導的轉化，轉移這些基因后，將新的基因用于調節植物的冬眠。
在本發明的另一個實施方式中，采用以下技術、例如但不限于農桿菌屬介導的轉化和Biallistic介導的轉化，轉化這些基因后，用植物中的新基因調節冬眠是可能的，該植物例如但不限于，茶樹、李樹、櫻桃樹、桃樹、紫杉屬、蘋果樹、梨樹、藤本植物、葡萄樹、橄欖樹、獼猴桃果樹、無花果樹、桑屬、草莓樹、覆盆子樹、越橘樹、黑莓樹、羅苷莓樹、杏樹、胡桃樹和栗樹。
在本發明的另一個實施方式中，新基因的序列數據可用于獲得有關基因調節的重要信息以用于調節轉基因中的基因表達。
在本發明的另一個實施方式中，涉及cDNA和基因組DNA用于合成單一蛋白質和單一蛋白質用于產生抗體的其它應用。
在本發明的另一個實施方式中，涉及本發明抗體用作找尋在其它植物、動物和/或微生物系統或類似系統中的相似蛋白質的探針。
在本發明的另一個實施方式中，涉及本發明的新序列、cDNA和基因組DNA用作找尋在其它植物、動物和/或微生物系統和類似系統中的核苷酸序列的探針。
在本發明的另一個實施方式中，涉及本發明的新序列、cDNA和基因組DNA用作找尋在其它植物、動物和/或微生物系統和類似系統中的這些核苷酸序列的表達的探針。
在本發明的另一個實施方式中，涉及一種使已鑒定的基因與如序列ID1所述的茶幼芽的休眠過程相互關聯的方法，它是唯一的。
在本發明的另一個實施方式中，涉及一種可也用于其它序列ID的方法。
在本發明的另一個實施方式中，涉及一種可用于其它農作物的方法，該農作物例如但不限于，李樹、櫻桃樹、桃樹、紫杉屬、蘋果樹、梨樹、藤本植物、葡萄樹、橄欖樹、獼猴桃果樹、無花果樹、桑屬、草莓樹、覆盆子樹、越橘樹、黑莓樹、羅苷莓樹、杏樹、胡桃樹和栗樹，和用于使相似的基因相互關聯的方法。
通過下列實施例將對本發明更詳細地舉例說明。這些實施例僅僅是為了舉例說明本發明目的，而不應視為對本發明進行限定，權利要求書中對本發明進行了恰當的描述。
具體實施例方式
實施例1RNA分離、使用DN酶1的RNA的消化、RNA的量化和凝膠電泳為了保證從茶樹的ND和D幼芽得到高質量的核糖核酸(以下叫做RNA)，使用RN酶(RNeasy)植物小試劑盒(從德國的M/s.Qiagen購得)。根據廠家的說明分離RNA。通過在260nm測定吸光度來使RNA量化，并通過計算在260nm和280nm所測得的吸光度之比來監測純度。一般認為在260/280nm的值＞1.8是本研究的目的所需。用于計算RNA濃度和產量的等式如下RNA的濃度(μg/ml)＝A260(260nm的吸光度)×40×稀釋因子總產量(μg)＝濃度×備用的RNA樣品的體積為了檢驗RNA的完整性，用15.5μl的M1溶液(2μl的5X MOPS緩沖液，3.5μl甲醛和10μl甲酰胺[5X MOPS緩沖液300mM醋酸鈉、10mM MOPS(3-{N-嗎啉}丙磺酸)、0.5mM乙二胺四乙酸(EDTA))稀釋4.5μl中的5-6λg的RNA，并在65℃培養15分鐘。加入2μl甲醛-凝膠加樣緩沖液[50％甘油、1mM EDTA(pH 0.8)、0.25％溴酚藍、0.25％二甲苯氰FF]后，將RNA加樣在1.5％甲醛瓊脂糖凝膠上，并在1X MOPS緩沖液(60mM醋酸鈉、2mM MOPS、0.1mM EDTA)中于72伏進行電泳(Sambrook，J.，Fritsch，E.F.和Maniatis，T.1989《分子克隆實驗室手冊》，冷泉港實驗室出版，Plainview，紐約)。
為了除去剩余的DNA，在1X反應緩沖液[10X反應緩沖液100mMTris-Cl(pH 8.4)、500mM KCl、15mM MgCl2、0.01％明膠]中于37℃用10單位的DN酶I消化RNA(10-50λg)30分鐘(從美國M/s.GenHunter公司購得的)。通過加入PCI(比例為25∶24∶1的酚、氯仿、異戊基醇)沉淀DN酶I、并通過加入0.3M醋酸鈉中的3體積乙醇沉淀含水相中的RNA。于-70℃培養3小時后，沉淀RNA，用冷凍的70％乙醇沖洗，最后溶解在10μl無RN酶的水中。對如此獲得的無DNA的RNA進行量化，并按上述檢驗完整性。
圖1描述了RNA的質量。雖然我們采用了德國M/SQuiagen的Rneasy柱，但其它方法也可用于分離茶的頂端幼芽。
實施例2通過逆轉錄(以下叫做RT)使mRNA轉化成互補DNA(以下叫做cDNA)用一種已知酶作為逆轉錄酶、將0.2μg休眠和無休眠樣品的無DNA的RNA在分離反應中進行逆轉錄。用0.2μM的T11M引物(T11M中M可以是T11A、T11C或T11G)、20μM的dNTP、RNA和RT緩沖液[25mM Tris-Cl(pH8.3)、37.6mM KCl、1.5mM MgCl2、和5mM DTT]完成該反應。在本發明中，dNTP是指脫氧腺苷三磷酸(以下叫做dATP)、脫氧鳥苷三磷酸(以下叫做dGTP)、脫氧胞苷三磷酸(以下叫做dCTP)和脫氧胸苷三磷酸(以下叫做dTTP)。對三種RT反應設定對應于T11M引物的每個RNA樣品。在熱循環器(thermocycler)(M/s Perkin-Elmer 480型)中完成這些反應。所選擇的用于轉錄的熱循環器參數為65℃、5分鐘→37℃、60分鐘→75℃、5分鐘→4℃。于37℃培養10分鐘后，在每一反應中加入100單位逆轉錄酶，然后繼續反應50分鐘。這樣得到圖2所示的cDNA。兩種不同RNA(ND和D)與3種T11M引物結合得到總共6種反應，該反應描述了6種不同類型的cDNA。用3種不同的T11M引物將全部RNA群分成由錨式堿基M而確定的3個亞類，可以是A、C或G(逆轉錄系統是美國M/s.GenHunter公司的RNA顯象試劑盒的一種成分)。
實施例3通過差異顯示技術產生差異表達基因的光譜差異表達基因的鑒定將實施例2所獲得的休眠和無休眠RT產品的不同cDNA亞類在放射性標記的dNTP中擴增、以通過聚合酶鏈反應(以下叫做PCR；PCR方法為Hoffman-La Roche公司擁有的專利所保護)標記擴增的產品。在20μl反應混合物中完成放射性PCR，該反應混合物包括(1)反應緩沖液[10mM Tris-Cl(pH 8.4)、50mM KCl、1.5mMMgCl2、0.001％明膠]，(2)2μMdNTP，(3)0.2μM T11M和(4)0.2μM任意引物(化學試劑1-4是作為RNA顯象試劑盒的一部分從美國Nashville的M/s.GenHunter公司購買的)、0.2μl α[33P]dATP(約2000 Ci/mmole，從印度JONAKI中心、CCMB campus Hyderabad購得)、和1.0單位棲熱水生菌(以下叫Taq)DNA聚合酶(從德國M/S.Qiagen購得)。將30μl高壓滅菌的礦物油覆蓋在每一反應的頂部、以避免因蒸發而導致體積改變。每一反應中的T11M引物是用于合成cDNA的同樣引物。所選擇的參數為94℃、30秒→40℃、2分鐘→72℃、30秒，共進行40個循環；以及72℃、5分鐘1個循環，最后在4℃培養。
在6％變性聚丙烯酰胺凝膠上將擴增產品分級。為了此目的，將每3.5μl擴增產品與2μl加樣染料[95％甲酰胺、10mM EDTA(pH 8.0)、0.09％二甲苯氰FF和0.09％溴酚藍]混合，于80℃培養2分鐘，并在6％變性聚丙烯酰胺凝膠[變性聚丙烯酰胺凝膠15ml丙烯酰胺(20∶1的丙烯酰胺和雙丙烯酰胺的40％貯備液)、10ml的10X TBE、40ml蒸餾水和50g尿素]上加樣。用1X TBE緩沖液[10 X TBE108g Tris堿、55g硼酸和40ml0.5M EDTA(pH 8.0)]作為流動緩沖液在60瓦特進行電泳直至二甲苯氰(移動較慢染料)達到玻璃平板的較低端。測序(變性聚丙烯酰胺)凝膠裝置的較大平板的大小為13×16英寸。電泳后，去除一個玻璃平板、將凝膠轉移至3MM Whattman濾紙上。在80℃將凝膠干燥過夜、并暴露于Kodak X-線薄膜2-3天。在暴露于X-線薄膜之前，為了進一步排列用放射性墨水標記干凝膠的角。圖3-11顯示了展開薄膜后所見的茶樹的ND和D頂端幼芽中的差異表達基因的光譜。展開凝膠后，分析薄膜的ND和D信號之間的差異表達條帶。
用于差異顯示的引物的序列(作為RNA顯象試劑盒的一部分，從美國M/s.GenHunter公司購得)如下T11M(錨式)引物 引物序列T11A 5’-AAGCTTTTTTTTTTTTTA-3’T11C 5’-AAGCTTTTTTTTTTTTTC-3’T11G 5’-AAGCTTTTTTTTTTTTTG-3’任意引物 引物序列AP1 5’-AAGCTTGATTGCC-3’AP2 5’-AAGCTTCGACTGT-3’AP3 5’-AAGCTTTGGTCAG-3’AP4 5’-AAGCTTCTCAACG-3’AP5 5’-AAGCTTAGTAGGC-3’AP6 5’-AAGCTTGCACCAT-3’AP7 5’-AAGCTTAACGAGG-3’AP8 5’-AAGCTTTTACCGC-3’AP33 5’-AAGCTTGCTGCTC-3’AP34 5’-AAGCTTCAGCAGC-3’AP35 5’-AAGCTTCAGGGCA-3’AP36 5’-AAGCTTCGACGCT-3’
AP37 5’-AAGCTTGGGCCTA-3’AP38 5’-AAGCTTCCAGTGC-3’AP39 5’-AAGCTTTCCCAGC-3’AP40 5’-AAGCTTGTCAGCC-3’AP65 5’-AAGCTT CAAGACC-3’AP66 5’-AAGCTT GCCTTTA 3’AP67 5’-AAGCTT TATTTAT-3’AP68 5’-AAGCTT CTTTGGT-3’AP69 5’-AAGCTT AATAACG-3’AP70 5’-AAGCTT TCATATG-3’AP71 5’-AAGCTT GTAGTAA-3’AP72 5’-AAGCTT TCAAAGA-3’實施例-4cDNA探針的再擴增克隆差異表達帶需要從變性聚丙烯酰胺凝膠的同樣洗脫和進一步擴增以得到足夠量用于克隆的DNA。放射自顯影圖(展開的X線薄膜)用加有放射性墨水的干凝膠定位、并用無菌的鋒利剃刀切下已鑒定的差異表達條帶(隨同凝膠和濾紙)。通過在微量離心管中的100μl無菌水中培養10分鐘洗脫DNA，接著煮沸10分鐘。通過于10,000rpm下旋轉2分鐘使紙和凝膠殘渣沉淀、將含DNA的上清液轉移至一新試管中。用10μl的3M醋酸鈉、pH 5.5、5μl糖原(儲備液；10mg/ml)和450μl的乙醇沉淀DNA。在-70℃培養過夜后，在10,000rpm下于4℃離心10分鐘，再用85％乙醇沖洗沉淀的DNA。將DNA沉淀溶解在10μl無菌蒸餾水中。用同一套T11M和用于進行如實施例3所示的差異顯示的任意引物擴增洗脫的DNA。還有，除了dNTP濃度為20μM而不是2μM、不加入同位素外，PCR條件相同。將反應升高至40μl并在PCR結束后，30μl的PCR樣品在置于TAE緩沖液(TAE緩沖液0.04M Tris-醋酸、0.002 EDTA，pH 8.5)中的1.5％瓊脂糖凝膠上流動，該緩沖液包含溴化乙錠(最終濃度0.5μg/ml)。將剩余的擴增產品貯存于-20℃以為克隆所用(見
圖11-14)。
實施例5再擴增的PCR產品的克隆用1X連接緩沖液(10X連接酶緩沖液500mM Tris-Cl pH 7.8、100mMMgCl2、100mM DTT、10mM ATP、500μg/ml BSA)中的200單位的T4DNA連接酶將實施例4所獲得的再擴增PCR成品連接在300ng叫做PCR-TRAP載體的插入型載體中。載體和所需的其它化學試劑是從美國Nashville的M/s.GenHunter公司以PCR-TRAP克隆系統的名稱購買的。在美國M/s.Perkin Elmer的480型熱循環器中于16℃連接16小時。PCR產品與上述載體連接得到環化質粒。本發明中，諸如本發明的PCR產品的外源DNA與適合的載體例如PCR-TRAP載體的這種連接過程就叫做克隆。還有其它市售的載體或者適合PCR產品的克隆的其它載體，因此也可以使用。質粒，如所定義的，它是一種封閉的環狀DNA分子、存在于諸如不依賴于染色體的DNA的大腸桿菌(以下稱E.coli)的適合的宿主細胞中，它具有對抗抗生素的抗性。PCR-TRAP載體產生的質粒對四環素具有抗性。
連接產品或質粒需要置于適當的大腸桿菌宿主中，該宿主通過一種叫做轉化的方法進行繁殖和增殖。將如上所得到的連接產品(10μl)用于轉化100μl大腸桿菌細胞成分(從美國M/s.GenHunter公司以PCR-TRAP克隆系統的名稱購得)。成分意指能接受質粒DNA的大腸桿菌細胞。為了此目的，混合連接產品和細胞成分，在冰上放置45分鐘，熱激2分鐘，再在0.4ml的LB培養基(LB∶1l∶10g胰化蛋白胨、5g酵母提取物、10g氯化鈉)中培養4小時。將200μl轉化細胞在LB-四環素(對1l添加10g胰化蛋白胨、5g酵母提取物、10g氯化鈉和四環素，得到20μg/ml的最終濃度)平板上進行平板接種、并在37℃生長過夜。標記克隆、并將單分離的克隆在LB-四環素平板上再劃線以得到同種克隆。四環素能抗大腸桿菌細胞顯然提示已經克隆了PCR產品即鑒定基因。
在整個上述方法中，選擇T11M引物可擴增mRNA的多A尾區。多A尾總是與基因的3’端相連，因此T11M引物與任意引物結合總是得到基因的3’區。
實施例6檢測PCR產品的大小一旦基因被克隆且大腸桿菌被轉化后，就有必要檢測質粒是否接受了恰當大小的PCR產品。通過進行集落PCR完成此檢測，其中集落被裂解、裂解物隨后用于進行采用適當引物的PCR。然后將擴增產品在瓊脂糖凝膠上分析。
從再劃線的平版(實施例5)收起單分離克隆并在50μl集落裂解緩沖液(集落裂解緩沖液TE(Tris-HCl 10mM，1mM EDTA，pH 8.0)和0.1％吐溫20)中通過沸騰10分鐘進行裂解。沉淀細胞殘渣，將上清液或含模板DNA的集落裂解物用于PCR。PCR成分基本上與實施例4相同，除外使用了T11M和任意引物Lgh(5’-CGACAACACCGATAATC-3’)和Rgh(5’-GACGCGAACGAAGCAAC-3’)引物，以及在洗脫DNA中使用了2μl集落裂解物。反應體積也減至20μl。用于集落PCR的PCR條件94℃、30秒→52℃、40秒→72℃、1分鐘，共進行了30個循環；接著進行72℃、5分鐘的1個循環，最后浸泡成4℃。擴增產品與分子重量標記在1.5％瓊脂糖凝膠上流動，并分析校正插入片段的大小。當使用Lgh和Rgh旁側引物，由于旁側載體序列被擴增，克隆的PCR產品的大小增大了120bp(見
圖15-17)。
實施例7通過Northern印跡法證實差異表達上面克隆的PCR產品代表差異表達基因的3’末端。在本發明中，將這些克隆的DNA片段叫做基因。由于差異顯示總是引起假象(falsepositives)即顯著差異表達基因(Wan，J.S.和Erlander，M.G.1997.“通過采用差異顯示和扣除雜交法克隆差異表達基因”，在《分子生物學方法》85卷“差異顯示方法和策略”中，Liang，P.和Pardee，A.B.編輯，Humana出版公司，Totowa，NJ，第45-48頁)，必須用通過Northern分析的證實試驗確定ND和D頂端幼芽之間的差異表達。Northern分析需制備放射性標記探針、然后用印跡在一種膜上的變性RNA進行雜交。
在Northern分析中將實施例6的擴增產品用作探針。在1.5％瓊脂糖凝膠上將擴增產品顯色后，從凝膠中切下，根據廠商說明使用德國M/s.Qiagen的QIAEX II凝膠提取試劑盒從凝膠中洗脫DNA。
根據廠商說明使用美國Nashville的M/s.GenHunter公司的HotPrime試劑盒、用α[32P]dATP(4000 Ci/mmole)對純化片段進行放射性標記。用QIA快速核苷酸去除試劑盒(QIAGEN，德國)純化放射性標記探針、以去除未結合的放射性核苷酸，為了印跡，基本上按實施例1所述使20μl的RNA在1.0％甲醛瓊脂糖凝膠上流動。一旦流動完成后，在DEPC處理的高壓滅菌水中洗滌凝膠兩次共20分鐘、每次同時振蕩。然后在10X SSPE(1.5M氯化鈉、115mMNaH2PO4、10mM EDTA)中洗滌凝膠兩次共20分鐘、每次同時振蕩。同時將尼龍膜(boehringer mannheim cat.no.#1209272)在DEPC水中浸濕、然后在10X SSPE(1.5M氯化鈉、115mM NaH2PO4、10mM EDTA)中浸泡5分鐘、并輕輕振蕩。然后用DEPC處理的10X SSPE(1.5M氯化鈉、115mMNaH2PO4、10mM EDTA)作為轉移基質、將凝膠中的DNA在尼龍膜上進行真空印跡(采用的壓力為40mbar)。進行4小時轉移。將壓力增至70mbar共15分鐘、之后才從真空印跡裝置中放出凝膠。轉移后，去除凝膠，在紫外光源下于尼龍表面上標記RNA標記的定位。將膜干燥、并在80℃烘烤45分鐘。在5X SSPE(20X SSPE3M氯化鈉、230mM磷酸鈉、20mM EDTA)中簡單沖洗后，將膜浸在預雜交液(50％甲醛、0.75M氯化鈉、50mM磷酸鈉、pH 7.4、5mM EDTA、0.1％Ficoll-400、0.1％BSA、0.1％聚乙烯吡咯烷酮、0.1％SDS溶液和150μg/ml新鮮煮沸的鮭精液DNA)中5小時。
通過煮沸10分鐘使較早合成的放射性探針變性、然后加入預雜交液浸漬印跡膜。進行16小時雜交。去除溶液、并用含0.1％SDS的1X SSC(20X SSC；3M氯化鈉和0.3M檸檬酸鈉二水合物、pH 7.0)于室溫下洗滌此膜兩次、每次15分鐘。在50℃用含0.1％SDS的預溫0.25X SSC進行最后洗滌15分鐘。除去膜、將其包裹在莎綸包中、并根據信號的強度將其暴露于X線薄膜12-240小時。
進行Northern雜交時，將ND和D頂端幼芽的RNA在膜上進行印跡并測試選擇的探針。
圖18-19顯示了4個這種探針的結果、并證實了ND和D頂端幼芽之間的差異表達。
31.2(T11C，AP37)主要是基因的3’末端區域，如
圖19所示它在Northern印跡上雜交成0.96kb大小的轉錄物。
21.2(T11C，AP7)主要是基因的3’末端區域，如
圖18所示它在Northern印跡上雜交成0.96kb大小的轉錄物。
53.1(T11A，AP34)主要是基因的3’末端區域，如
圖19所示它在Northern印跡上雜交成0.95kb大小的轉錄物。
44.3(T11G，AP33)主要是基因的3末端區域，如
圖18所示它在Northern印跡上雜交成1.75kb大小的轉錄物。
實施例8使鑒定基因與茶樹幼芽的休眠相關聯的方法我們克隆了上面實施例6所鑒定的4種差異表達基因。為了進一步使這些差異表達基因與休眠現象相關聯，用植物生長調節劑赤霉酸(以下稱GA3)使冬季休眠灌木終止幼芽休眠。將GA3溶解在5％乙醇中至最終濃度為5μM。在12月期間的同一天，用植物刷將這種溶液用于每一休眠幼芽上涂刷至少4次。有規律地記錄幼芽長度及其周長、作為其生長的指征。從20個幼芽中僅10個幼芽顯示了與GA3對應的生長增強(休眠停止)。將這些稱作強制ND頂端幼芽。收集這些幼芽并按實施例1所述貯存，它們可用于Northern分析中的RNA分離。
關于這樣一種實驗，在尼龍膜上將ND、D和強制ND的RNA進行印跡、并用ND(31.2)探針探測。所涉及的各種方法在實施例6中已經進行了描述。
從圖20可見，與ND相比，D頂端幼芽中的用于探測的基因表達呈現下調(即顯示較少表達)。而在強制ND中基因出現上調(即顯示超量表達)。因此，證實了基因31.2(序列ID No.1，本發明在實施例8中進行了詳細說明)確實是一種休眠相關性基因。相似的方法也可適用于其它基因。
實施例9對鑒定的克隆測序用從美國M/s.Amersham Pharmacia Biotech購買的T7測序酶版本2測序試劑盒對每個克隆進行手工測序。所用的測序引物為[Lgh(5’-CGACAACACCGATAATC-3’)或Rgh(5’-GACGCGAACGAAGCAAC-3’)](1)SEQ ID NO1的信息(i)序列特征(A)長度305堿基對(B)類型核酸(C)鏈雙(D)拓撲結構環狀(i)分子類型cDNA(ii)序列說明SEQ ID NO1Seq ID No.1#3 1.2克隆的序列5′-ATCGCCGTAA TTGCCATGTT TTCCCTCTCA CCGGAATCCT ACGTTATCC CCTTACCTTC GTGAACATTA CAGTAGGAAT CGGTGGTCCAATTATCAACT TAATTTTGGG CGCATCTGTT CGTGTTAACT AGAAGCCATGTATACATACA ATACAACATG GTTCACTCCT CCTACAGATT ATGAGTTGAACTTTTATAAT AAGTTGTAAT AATGGCTTCT GAATAAGGAG AAGAGGAGCCTCTGTTTGTT TTACTTATTA CAGATGTGAT ATCGTTCAAC AACTTTGATTCTGCGAAAAA AAAAA-3′(2)SEQ ID NO2的信息(i)序列特征(A)長度297堿基對(B)類型核酸(C)鏈雙(D)拓撲結構環狀(ii)分子類型cDNA(iii)序列說明SEQ ID NO2
Seq ID No.1#21.2克隆的序列5′- AGAAGTACCT GAAAGGAAGC TTAACGAGGT GAACATCCATTGCAGCCAGC CCTGGAATCT GTACAGGGCA ACTCTGAACC GGAATTATTTTAATAACCCG TGGGCAATGA TTGCAATTAT GGCTCGTTTG GTATTACTTCTACTCACTTA GACACAACTG TATTTACGGT TTTCGCTGGA ATTGTAATTGTTGGAGCGAC AAAATAGATG GTCACAACTT ATTGGTGAGA GTATCAGTGTGCTCTTCTTT ATCGTCTTTA ACTCTCCGTG GTAATTACTT TGACAATATTCATACAT-3′(3)SEQ ID NO3的信息(i)序列特征(A)長度239堿基對(B)類型核酸(C)鏈雙(D)拓撲結構環狀(ii)分子類型cDNA(iii)序列說明SEQ ID NO3Seq ID No.1#53.1克隆的序列5′-GAGACTCAGC TCAGCAATCA TGTTCTAAGT GAATGTCACT CTATCGCCTTCTTGTCCCTC TTAGACATAC TACATCCTCA TTCTGCTAGA AATGAACTCATGTAGGTTTT GAAGTTGGGA ACTTTTGAAA CTGTGTTGTT TGGGTGCTGTCTGTTATACA ATTCTCTCAA CTGCGGAGAA TTGACGTTGG TTGTAGTGGAATTCAACACT TGGGTTTTGT TCTTAGTTAA AAAAAAAAA-3′(4)SEQ ID NO4的信息(i)序列特征(A)長度228堿基對(B)類型核酸(C)鏈雙(D)拓撲結構環狀(ii)分子類型cDNA(iii)序列說明SEQ ID NO4
Seq ID No.1# 44.3克隆的序列5′-ATAGCTTAGT CACGTGTCTC TTGAGAATGGACTACGTAGTTGTTAAGTTG GGTGATCAGA AGGCGTTGAT GATGAATGTA TGAAGCAGAGACTACTGAAT GTAATTTTGT TGTTGAAAGA TGAATGATTT ATTAATGCCTGCATATCTTT CTATTGTTTG ATGCCAAACC TTTGGGCACA TTTTTTCTTTCTTTTTGTGA TAATGTTCTC TTCTTGCAAA AAAAAAAA-3′實施例10序列分析將每個克隆進行BLAST分析，發現這些克隆是單一的。
本發明的主要優點為(a)克隆了生長在野外田間條件下的Camellia sinensis L.(O.)Kuntze(茶)灌木或樹種的頂端幼芽中冬眠期間所表達和阻抑的新的DNA序列；(b)已經具有從同樣基因組成的茶樹中克隆了這些序列；(c)已經得到了生長在野外田間條件下的茶樹的無休眠和休眠頂端幼芽中的表達和阻抑基因的3’末端的光譜；(d)已證實了用于確立生長在野外田間條件下的茶樹的頂端幼芽中冬眠期間的差異表達的差異表達基因的已鑒定3’末端；(e)已描述了使已鑒定基因與生長在野外田間條件下的茶樹幼芽的休眠相關聯的方法；(f)根據迄今未在數據庫中所存放的新序列，對差異表達基因的克隆3’末端進行測序具有單一性。
附錄1下列數據庫站點的結果http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/blast form.maphttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/blast form.map序列ID1的結果(31.2，T11CAP37)查尋序列所得到的14個胚胎細胞的分布 {PRIVATE} 分數產生顯著性排列的序列 (位數)E值gi|4156134 gb|AC005091.1|AC005091Homo sapiens BAC clone CT...420.17gi|21O61799|emb|AL237127.7|AL137127Human DNA sequence from...420.17gi|9186966|emb|AL161744.7|AL161744Human DNA sequence from...400.69gi|5001496|gb|AC007319.2|AC007319Homo sapiens BAC clonc RP...382.7gi|3850563|gb|AC005943.1|AC005943Homo sapiens chromosome l...382.7gi|11121047|emb|AL356787.11|AL356787Human DNA sequence fro...382.7gi|8216586|emb|AL139195.3|CNS01DXCHuman chromosome 14 DNA ...382.7gi|3650382|emb|AL030995.1|HS1170D6Human DNA sequence from ...382.7gi|854638|emb|X87335.1|XXEVCGEncephalomyocarditis virus co...382.7gi|44207|emb|X06414.1|MCRPCLUSMycoplasma capricolum riboso...382.7gi|323856|gb|M37588.1|EMCDIABEncephalomyocarditis virus， d...382.7gi|323854|gb|M22458.1|EMCDCGEncephalomyocarditis (EMC) vir...382.7gi|323852|gb|M22457.1|EMCBCGEncephalomyocarditis (EMC) vir...382.7gi|1212874|emb|X87215.1|CLC3GENEC.limosum C3 gene382.7Alignmcnts>gi|4156134|gb|AC005091.1|AC005091Homo sapiens BAC clone CTA-318C11 from7p14-p15，complete sequenceLength＝110535Score＝42.1 bits (21)，Expect＝0.17Identities＝21/21 (100％)Strand＝Plus/MinusOuery158tggttcactcctcctacagat 178|||||||||||||||||||||Sbjct87291 tggttcactcctcctacagat 87271>gi|11061799 emb|AL137127.7|AL137127Human DNA sequence from clone RPS-1126H10 on chromosome lp34.3-35.3，complete sequence(Homo sapiens)Length＝98832
27-MAR-01 0032ID91+11+6533889 K AND SSTART TIME 27-MAR-01 0022TELEPHONE NUMBER 0017132202302NAME(ID NUMBER) Akin，GumpTRANSMISSION MODE SECMRESOLUTION STDPAGES TRANSMITTED 026CONFIDENTIALOFFSECURITYOFFINFORMATION CODEOKREDIALING TIMES 00MACHINE ENGAGED 09·15JOB NUMBERTHIS XMT IS COMPLETED.
LAST SUCCESSFUL PAGE026
附錄2下列數據庫站點的結果http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/blast form.maphttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/blast form.map序列ID2的結果(21.2，T11CAP7)查尋序列所得到的4個胚胎細胞的分布 {PRIVATE} 分數產生顯著性排列的序列 (位數)E值gi|13324737|gb|AC009457.8|AC009457Drosophila melanogaster，...382.6gi|13122705|gb|AC009904.6|AC009904Drosophila melanogaster，...382.6gi|7299945|gb|AE003707.1|AE003707Drosophila melanogaster g...382.6gi|2393736|gb|AC002540.1|AC002540Human BAC clone GS1-25M2...382.6Alignments>gi|13324737|gb|AC009457.8|AC009457Drosophila melanogaster，chromosome 3R，region 88E-88E，BAC cloneBACR25A06，complete sequenceLength＝170163Score＝38.2 bits(19)，Expect＝2.6Identities＝19/19 (100％)Strand＝Plus/MinusQuery106aatgattgcaattatggct 124|||||||||||||||||||Sbjct120373 aatgattgcaattatggct 120355>gi|13122705|gb|AC009904.6|AC009904Drosophila melanogaster，chromosome 3R，rcgion 88E-88E，BAC cloneBACR32A03，complete sequenceLength＝182602Score＝38.2 bits(19)，Expect＝2.6Identities＝19/19(100％)Strand＝Plus/Minus
附錄3下列數據庫站點的結果http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/blast form.maphttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/blast form.map序列ID3的結果 (53.1，T11AAP34)查尋序列所得到的42個胚胎細胞的分布 {PRIVATE} 分數產生顯著性排列的序列 (位數) E值gi|12740602|gb|AC005079.6|AC005079Homo sapiens clone CTA-2...400.53gi|3819275|emb|AJ234492.1|HVU234492Hordeum vulgare genomic...400.53gi|10440603|gb|AC020914.7|AC020914Homo sapiens chromosome...382.1gi|9630683|ref|NC 001934.1|Potato yellow mosaic virus A co...382.1gi|5731403|gb|AC007870_3|AC007870Genomic sequence for Homo...382.1gi|4206727|gb|AF096911.1|AF096911Agaricus benesi mitochond...382.1gi|4206726|gb|AFC96910.1|AF096910Agaricus subfloccosus mit...382.1gi|4206724|gb|AF096909.1|AF096909Agaricus subrutilescens R...382.1gi|4206722|gb|AF096908.1|AF096908Agaricus bitorquis RNA po...382.1gi|11121078|emb|AL391385.8|AL391385Human DNA sequence from...382.1gi|1067078|emb|Z35604.1|CEZK1058Caenorhabditis elegans cos...382.1gi|6967817|emb|AL139075.2|CJ11168X2Campylobacter jejuni NC...382.1gi|2931|emb|X63075.1|MIABDRNAgaricus bitorquis mitochondri...382.1gi|644777|gb|U19744.1|CEU19744Caenorhabditis elegans integ...382.1gi|222458|dbj|000940.1|PYVVAPotato yellow mosaic virus (PY...382.1gi|11417453|ref|XM 004088.1|Homo sapiens mitogen-activated...368.3gi|12408747|gb|AC021640.7|ATAC021640Arabidopsis thaliana c...368.3gi|12408741|gb|AC015985.10|ATAC015985Arabidopsis thaliana...368.3gi|11497621|ref|NC 000917.1|Archaeoglobus fulgidus，comple...368.3gi|12000466|gb|AC073936.11|AC073936Mus musculus 11 BAC RP2...368.3gi|6466296|gb|AF022186.2|AF022186Cyanidium caldarium strai...358.3gi|11465393|ref|NC001840.1|Cyanidium caldarium chloroplas...368.3gi|4503068|ref|NM 001315.i|Homo sapiens mitogen-activatcd...368.3gi|9558585|gb|AC020967.2|AC020967Mus musculus chromosome l...368.3gi|2734100|gb|AC003009.1|UUAC003009Homo sapiens Chromoeomc...368.3gi 6249676|gb|AC005660.3|AC005660Cirb_163_9_10，complete s...368.3gi 5031218|gb|AF105034.1|AFi05034Arabidopsis thaliana delt...368.3gi 4234767|gb|AF069466.1|AF069468Arabidopsis thaliana ster...368.3gi|4731431|gb|AF061787.1|AF061787Escherichia coli plasmid...368.3
附錄4下列數據庫站點的結果http:/www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/blast form.maphttp:/www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/blast form.map序列ID4的結果 (44.3，T11g，AP33)查尋序列所得到的312個胚胎細胞的分布
分數產生顯著性排列的序列 (位數)E值gi|4630763|gb|AC007350.1|AC007350Homo sapiens clone RP11-2...460.008gi|12545293|gb|AC034226.5|AC034226Homo sapiens chromosome...420.13gi|1628081|emb|Z81107.1|CER07H5Caenorhabditis elegans coam...420.13gi|4775629|emb|AL035416.7|HS782L23Human DNA sequence from ...420.13gi|2969943|emb|AL022148.1|HS435A7Homo sapiens DNA sequence...420.13gi|3087791|emb|Y15155.1|HSY15155Homo sapiens PHKB gene，ex...420.13gi|3892723|emb|AJ012821.1|CAR012821Cicer arietinum mRNA fo...420.13gi|8748927|gb|AC012502.3|AC012502Homo sapiens BAC clone RP...400.51gi|1679964|gb|S43579.1|S43579c-scr-pp60c-src，sdr-src down...400.51gi|4662612|gb|AC006582.13|AC006582Pan troqlodytes 12cp12 B...400.51gi|9988323|emb|AL354984.17|AL354984Ruman DNA sequence from...400.51gi|11907388|emb|AL445675.9|AL445675Human DNA sequence from...400.51gi|11137694|emb|AL162414.11|AL162414Human DNA sequence fro...400.51gi|886464|emb|Z49969.1|CEW01C9Caenorhabditis elegans cosmi...400.51gi|6983473|emb|AL133216.10|AL1332l6Human DNA sequence from...400.51gi|9367248|emb|AL389890.1|NCB24P7Neurospora crassa DNA lin...400.51gi|397651|gb|U01148.1|CHKSRC3Gallus gallus c-src protein(...400.51gi|13435608|gb|BC004681.1|BC004681Mus musculus，clone MGC...382.0gi|13096025|gb|AC011253.4|AC011253Drosophila melanogaster，...382.0gi|13096038|gb|AC008312.4|AC008312Drosophila melanogaster，...382.0gi|12831408|gb|AC009237.3|AC009237Homo sapiens clone RP11-...382.0gi|12739794|gb|AC087731.2|AC087731Felis catus clone RP86-4...382.0gi|11434370|ref|XM 003123.1|Homo sapiens ATPase，Ca++ tran...382.0gi|12583768|gb|AC008779.5|AC008779Homo sapiens chromosome...382.0gi|11094957|gb|AC084507.1|CBRG15B09Caenorhabditis briggsae...382.0gi|7656909|ref|NM 014382.1|Homo sapiens ATPase，Ca++ trans...382.0gi|10727101|gb|AE003671.2|AE003671Drosophila melanogaster...382.0gi|7684378|gb|AC022336.12|AC022336Homo sapiens 3 BAC RP11-...382.0gi|6826913|gb|AF189723.2|AF189723Homo sapiens calcium tran...382.0gi|6598643|gb|AC006951.5|AC006951Arabidopsis thaliana chro...382.0gi|2323254|gb|AC002407.1|AC002407Human Chromosome X，compl...382.0gi|6715130|gb|AF181120.1|AF181120Homo sapiens chromosome 3...382.0gi|4960088|gb|AF149981.1|AF149981Nicotiana tabacum sucrose...382.0gi|4699959|gb|AC006014.2|AC006014Homo sapiens PAC clone RP...382.0gi|5836194|gb|AC005468.2|AC005488Homo sapiens clone NH0313...382.0gi|2935483|gb|AF048727.1|AF048727Homo sapiens minisatellit...382.0gi|4309859|gb|AC005543.2|AC005543Homo sapiens chromosome 4...382.0gi|13276603|emb|AL121972.17|HSJ397H23Human DNA aequence fr...382.0gi|3646133|emb|AJ010953.1|HSA010953Homo sapiens mRNA for p...382.0gi|3970929|gb|AC006133.1|AC006133Homo sapiens Chromosome l...382.0
SEQUENCE LISTING<110>科學與工業研究委員會<120>茶樹頂端幼芽中冬眠期間所表達和阻抑的新的基因序列的克隆<130>PIF050654C<160>1<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>297<212>DNA<213>Camellia sinensis<400>1agaagtacct gaaaggaagc ttaacgaggt gaacatccat tgcagccagc cctggaatct60gtacagggca actctgaacc ggaattattt taataacccg tgggcaatga ttgcaattat 120ggctcgtttg gtattacttc tactcactta gacacaactg tatttacggt tttcgctgga 180attgtaattg ttggagcgac aaaatagatg gtcacaactt attggtgaga gtatcagtgt 240gctcttcttt atcgtcttta actctccgtg gtaattactt tgacaatatt catacat 29權利要求
1.Camellia sinensis L.(O.)Kuntze茶樹或樹種的頂端幼芽中冬眠期間所表達和阻抑的新的DNA序列，所述的序列為以下所示的序列IDNO25′-AGAAGTACCT GAAAGGAAGC TTAACGAGGT GAACATCCATTGCAGCCAGC CCTGGAATCT GTACAGGGCA ACTCTGAACC GGAATTATTTTAATAACCCG TGGGCAATGA TTGCAATTAT GGCTCGTTTG GTATTACTTCTACTCACTTA GACACAACTG TATTTACGGT TTTCGCTGGA ATTGTAATTGTTGGAGCGAC AAAATAGATG GTCACAACTT ATTGGTGAGA GTATCAGTGTGCTCTTCTTT ATCGTCTTTA ACTCTCCGTG GTAATTACTT TGACAATATTCATACAT-3′。
2.SEQ ID NO2的DNA用于表征植物處于休眠期和非休眠期狀態。
全文摘要
本發明涉及Camellia sinensis L.(O.)Kuntze茶樹的頂端幼芽中冬眠期間所表達和阻抑的新的基因序列的克隆，尤其是，涉及茶的冬眠頂端幼芽中所表達和阻抑的基因(本發明基因是指脫氧核糖核酸DNA)序列的新的引物3(以下稱作3’)末端的鑒別、克隆和分析。3’末端是指在DNA分子的碳水化合物部分的第3位置具有游離羥基的DNA的末端。
文檔編號A01H1/00GK1664102SQ20051006512
公開日2005年9月7日 申請日期2001年3月30日 優先權日2001年3月30日
發明者桑賈伊·庫馬爾, 拉赫維爾·拉爾, 帕拉姆威爾·辛格·阿胡賈 申請人:科學與工業研究委員會