專利名稱：蜂膠和銀離子復合納米消毒劑及其制備方法
技術領域：
本發明涉及一種用作消毒劑的化學組合物，具體涉及一種新型蜂膠和銀離子復合納米消毒劑及其制備和應用。
背景技術：
自2001年美國“9.11”恐怖事件后，相繼在多個國家出現“白色粉末”-炭疽芽孢郵寄，生物恐怖成為現實，更為引起各國政府對生物恐怖的高度關注。生物工程和基因工程發展突飛猛進，不僅使生物恐怖病原更加容易取得，而且對烈性傳染病原進行重建和改構，進一步加大了生物恐怖襲擊的威脅和生物反恐的難度。目前可以使用應對類似生物恐怖病原的消毒劑為有機化工制品如甲醛、次氯酸等，這些消毒劑本身毒性較大，不僅對人體皮膚粘膜有一定的損傷，而且會造成環境污染。因此，研制高效、廣譜殺滅生物恐怖病原，可在人體安全使用，有效預防和抑制生物恐怖原感染、發病，并可對污染的環境、民用設施和精密儀器等消毒的新型消毒劑成為生物恐怖防護的重要課題之一。
發明創造內容 本發明的目的是提供一種能夠廣譜殺滅生物恐怖病原的新型蜂膠和銀離子復合納米消毒劑。
本發明的另一目的是提供一種上述蜂膠和銀離子復合納米消毒劑的制備方法。
本發明提供的蜂膠和銀離子復合納米消毒劑，是含有濃度為0.125～2g/100ml、平均粒徑在30～100納米之間的蜂膠和濃度為3.125～50ug/l的銀離子的水包油型乳劑。
上述蜂膠和銀離子復合納米消毒劑中，還包括有機溶劑，所述有機溶劑為乙醇、甲醇，正丁醇、或丙酮中的一種；所述乳劑中所用乳化劑為吐溫-20、吐溫-60、或吐溫-80中的一種；所述銀離子來自于硝酸銀或磷酸銀。
上述蜂膠和銀離子復合納米消毒劑中，每100體積份乳劑中，含有2重量份蜂膠，5體積份乙醇，10～15體積份吐溫-80，5×10-6重量份硝酸銀，并且當體積份為毫升時，重量份對應為克，依此類推。
本發明提供一種所述蜂膠和銀離子復合納米消毒劑的制備方法，包括以下操作將蜂膠溶于有機溶劑中，室溫條件下，將乳化劑滴加入該蜂膠有機溶液中，同時進行磁力攪拌，直至混合液澄清形成油相，然后邊攪拌邊滴加銀離子水溶液直至最終形成復合乳劑即為所述消毒劑。
上述蜂膠和銀離子復合納米消毒劑的制備方法中，將乳化劑滴加入蜂膠有機溶液中滴加速度為1～2ml/min；滴加銀離子水溶液時滴加速度為3～5ml/min。
上述蜂膠和銀離子復合納米消毒劑的制備方法中，所述乳化劑和蜂膠有機溶液的最佳體積比范圍為1∶1～2∶1。所述銀離子水溶液形成的水相與乳化劑和蜂膠有機溶液形成的油相的最佳體積比范圍為7∶3～4∶1。
采用上述技術方案，本發明利用蜂膠廣譜抗細菌、真菌和病毒及無毒的特性，配以銀離子，提高蜂膠殺滅致病微生物的活性，尤其是對桿菌芽孢的滅活；采用本發明方法，不使用強力乳化機械，只在室溫下溫和攪拌，通過利用乳化劑具有親水、親油的特性，滴加銀離子水溶液，可自發形成蜂膠納米級顆粒的復合乳劑。實驗證明，本發明乳劑具有殺菌時間短、殺滅效果明顯的特點，毒性實驗表明該乳劑大大降低了蜂膠溶解劑中刺激性有機溶劑的含量，可在人體皮膚、粘膜上安全使用，對環境和人體無危害和刺激作用。從而使制備的新型復合納米消毒劑可強效殺滅多種致病微生物，并能在多種條件下安全使用。
具體實施例方式 本發明中采用的抗菌或抑菌的功能成分為蜂膠和銀離子。
研究表明，蜂膠抗菌的主要活性成分是蜂膠所含的黃酮類化合物及多酚，利用微量測熱法和電子顯微照相技術結果表明，蜂膠可通過阻止細胞分化抑制細菌生長，通過破壞細胞膜和胞漿的有序狀態，引起部分溶菌和細菌蛋白質合成的抑制(Koo H，Gomes BP，Rosalen PL.In vitro antimicrobial activity of propolis and arnica Montanaagainst oral pathogens.Arch oral Biol.2000；45(2)1416.)。
研究表明，銀離子低濃度時(如50ug/l)，可強力吸附于細胞壁表面，細菌雖有某些生理功能被破壞，但仍有一定的生命力(抑菌作用)；銀離子高濃度時在細胞表面吸附，過量的銀離子就會穿透細胞壁進入細胞內部；滯留在細胞漿膜上，與此處含巰基的酶上的S，O，N原子結合，抑制酶的活性，使細菌死亡(殺菌作用)(Yahya MT，StraubTM，Gerba CP etal.Inactivation of coliphage MS-2 and poliovirus by copper，silver，andchlorine.Can J Microbiol.1992；38(5)430.) 本發明是將蜂膠和銀離子復合使用的一種消毒劑，并且使之形成一種水包油的乳劑結構。考慮消毒劑的毒性應控制在合理范圍，本發明使用的銀離子的含量最高限定在50ug/L，該濃度下的單一銀離子僅具有抑菌作用，但用本發明方法將其與蜂膠復合使用，則形成增效作用，具有殺菌功能。
本發明利用蜂膠有機溶液和銀離子水溶液為主要原料，配以適量乳化劑，用適當的方式將其混合形成一種乳劑即得到本發明的消毒劑。在該消毒劑中，油相包括蜂膠、一種或數種作為用于溶解蜂膠的有機溶劑和乳化劑，其中有機溶劑可以為不同濃度的乙醇溶液或甲醇，正丁醇、丙酮等，乳化劑為不同濃度的吐溫類活性劑的一種，如吐溫-20，吐溫-60，吐溫-80等，蜂膠的平均粒徑在30-100納米之間；水相為銀離子水溶液，可由硝酸銀、磷酸銀等一定濃度的銀離子水溶液組成。本發明消毒劑中，蜂膠終濃度較好在0.125～2.0g/100ml，而銀離子濃度較好在3.125～50ug/l。
本發明還提供了一種蜂膠和銀離子復合納米消毒劑的制備方法，該方法不使用強力乳化機械，只在室溫下溫和攪拌，通過利用乳化劑具有親水、親油的特性，滴加銀離子水溶液，可自發形成蜂膠納米級顆粒的復合乳劑。具體步驟為室溫條件下，將乳化劑滴加入蜂膠有機溶液中，磁力攪拌至混合液澄清形成油相；然后邊攪拌邊滴加銀離子水溶液，直至最終復合乳劑呈棕黃色透明液體，即得到本發明消毒劑。在制備過程中，其中油相中乳化劑和蜂膠有機溶液的最佳體積比范圍為1∶1～2∶1，而水相和油相的最佳體積比范圍為7∶3～4∶1。
實施例1、 將蜂膠2g溶于體積濃度為50％的乙醇10ml中，室溫條件下，將10ml吐溫-80滴加入該蜂膠乙醇溶液中，滴加速度1～2ml/min，同時進行磁力攪拌，直至混合液澄清形成油相；然后邊攪拌邊滴加濃度為62.5ug/L的硝酸銀水溶液80ml，滴加速度3～5ml/min，直至最終復合乳劑呈棕黃色透明液體，即得到本例消毒劑100ml。
本例消毒劑中各組分終濃度分別為蜂膠2g/100ml，乙醇5％(v/v)，吐溫-80為10％(v/v)，硝酸銀5ug/100ml。乳劑中蜂膠顆粒平均粒徑約為50nm。
實施例2、 將蜂膠2g溶于純乙醇5ml中，室溫條件下，將15ml吐溫-80滴加入該蜂膠乙醇溶液中，滴加速度1～2ml/min，同時進行磁力攪拌，直至混合液澄清形成油相；然后邊攪拌邊滴加濃度為62.5ug/L的硝酸銀水溶液80ml，滴加速度3～5ml/min，直至最終復合乳劑呈棕黃色透明液體，即得到本例消毒劑100ml。
本例消毒劑中各組分終濃度分別為蜂膠2g/100ml，乙醇5％(v/v)，吐溫-80為15％(v/v)，硝酸銀5ug/100ml。乳劑中蜂膠顆粒平均粒徑約為90nm。
實施例3、 將蜂膠1g溶于體積濃度為50％的正丁醇10ml中，室溫條件下，將20ml吐溫-60滴加入該蜂膠正丁醇溶液中，滴加速度1～2ml/min，同時進行磁力攪拌，直至混合液澄清形成油相；然后邊攪拌邊滴加濃度為71.4ug/L的磷酸銀水溶液70ml，滴加速度3～5ml/min，直至最終復合乳劑呈棕黃色透明液體，即得到本例消毒劑100ml。
本例消毒劑中各組分終濃度分別為蜂膠1g/100ml，正丁醇5％(v/v)，吐溫-60為20％(v/v)，磷酸銀5ug/100ml。乳劑中蜂膠顆粒平均粒徑約為60nm。
實施例4、 將蜂膠1g溶于體積濃度為50％的乙醇10ml中，室溫條件下，將15ml吐溫-80滴加入該蜂膠乙醇溶液中，滴加速度1～2ml/min，同時進行磁力攪拌，直至混合液澄清形成油相；然后邊攪拌邊滴加濃度為33.3ug/L的硝酸銀水溶液75ml，滴加速度3～5ml/min，直至最終復合乳劑呈棕黃色透明液體，即得到本例消毒劑100ml。
本例消毒劑中各組分終濃度分別為蜂膠1g/100ml，乙醇5％(v/v)，吐溫-80為15％(v/v)，磷酸銀2.5ug/100ml。乳劑中蜂膠顆粒平均粒徑約為30nm。
經測試，上述實施例制備的消毒劑均滿足下述理化性狀 外觀棕黃色透明 pH值6.5 4500rpm離心后無分層或混濁 電鏡下顆粒直徑(nm)30-100 總黃酮含量(g)0.55 本發明蜂膠和銀離子復合納米消毒劑的抑菌、殺菌試驗 1.復合乳劑與乳劑中各組分對大腸桿菌8099的抑制作用比較 將實施例1制備的蜂膠和銀離子復合納米消毒劑(簡稱復合乳劑)用無菌水做1∶4，1∶8，1∶16，1∶32的稀釋，按照消毒技術規范的要求進行大腸桿菌8099的懸液抑菌實驗，確定最小抑制濃度(MIC)，并同時對照不同濃度、蜂膠、吐溫-80、乙醇的抑菌作用。結果見表1 表1復合乳劑對大腸桿菌8099的抑菌作用分組抑菌劑稀釋比例對大腸桿菌抑菌效果實驗組稀釋后復合乳劑1∶4-1∶8-1∶16-1∶32+吐溫-80(v/v)10％+5％+2.5％+對照組 乙醇(v/v)25％-12.5％+6.25％+ 蜂膠(g/100ml)1％-0.5％-0.25％+ Ag+(ug/L)12.5+50- 注傾注法活菌計數培養后無菌生長或僅生長1-5個菌落記為-，表明有抑制作用；標記+的表明沒有抑制作用。
表1結果顯示復合乳劑對大腸桿菌8099的最小抑制濃度為1∶16，此稀釋后的復合乳劑中蜂膠的濃度為0.125％(g/100ml)，銀離子濃度為3.125ug/L，該濃度條件下的復合乳劑就具有抑菌作用；而單獨應用蜂膠和銀離子MIC分別為0.5％(g/100ml)和50ug/L時才有抑菌效果，單獨組分抑菌濃度是復合乳劑濃度的4-8倍。表1結果同時顯示復合乳劑中所含的吐溫-80和乙醇(1.25％)無抑菌作用，說明起抑菌作用的是復合乳劑。
2.復合乳劑對大腸桿菌8099的最短抑菌時間實驗 將實施例2的復合乳劑以1∶4，1∶8，1∶16稀釋，以稀釋液與大腸桿菌8099的懸液作用不同時間后的抑菌試驗確定最小抑制時間，并對照單獨使用蜂膠、銀離子的抑菌時間。結果見表2 表2復合乳劑對大腸桿菌8099的最短抑菌時間受試劑 作用不同時間(min)的抑制作用 復合乳劑稀釋度1351015301∶4---1∶8---1∶16--- 2％(g/100ml)蜂膠+++++- 銀離子50ug/L+++++- 注傾注法話菌計數培養后，無菌生長或僅生長1-5個菌落記為-，+無抑制作用。
表2結果可見復合乳劑對大腸桿菌8099的最小抑制時間為1min，而單獨應用蜂膠(2％)，銀離子(50ug/L)的MIC分別為30min和15min。表明復合乳劑的抑菌時間較單獨使用明顯縮短。
3.檢測蜂膠-銀離子納米乳劑對大腸桿菌8099，金黃色葡萄球菌(ATCC6538)，綠膿桿菌和白色念珠菌(ATCC10231)的殺滅最短時間，殺滅最低濃度和殺滅對數值。試驗方法參見《消毒技術規范》的懸液定量殺菌試驗，結果見表3。
表3復合納米乳劑殺滅不同微生物的試驗結果復合乳劑稀釋度 受試菌種 作用不同時間的平均殺滅率(％)1min3min5min 10min1∶4 大腸桿菌 80991001001001∶81001001001∶161001001001∶4 金黃色葡萄球菌 ATCC68351001001001∶81001001001∶161001001001∶4 綠膿桿菌 ATCC15442951001001∶8901001001∶16751001001∶4 白色念珠菌 ATCC102316070100 1001∶83550100 100 注試驗溫度18-22℃。陽性對照組平均菌數，大腸桿菌為2.78×108cfu/mL，金黃色葡萄球菌為2.92×108cfu/mL，綠膿桿菌為2.53×108cfu/mL，白色念珠菌為2.56×107cfu/mL；復合乳劑使用實施例1配制的。
從表3數據可見，稀釋后的復合乳劑對大腸桿菌，金黃色葡萄球菌作用1min，綠膿桿菌作用3min，平均殺滅率為100％，最低殺滅濃度為原液的1∶16稀釋，殺滅對數值(KL)為8.48和8.42和8.31。對白色念珠菌作用5min，平均殺滅率即可達到100％。最低殺滅濃度為原液的1∶8稀釋，殺滅對數值(KL)為7.56。而單獨使用蜂膠(2g/100ml)和銀離子(50ug/L)僅具有抑菌作用而沒有殺菌作用。
以上試驗說明，利用本發明制備的復合納米乳劑可有效廣譜殺滅多種細菌如大腸桿菌、金葡球菌、綠膿桿菌及真菌白色念珠菌、病毒及桿菌芽胞等，且單獨使用同濃度的蜂膠和銀離子溶液僅有抑菌作用而無殺菌作用，說明本發明蜂膠銀離子復合納米消毒劑殺滅各種致病微生物的活性來源于本發明組配的復合乳劑各組分的協同增效作用。
本發明蜂膠和銀離子復合納米消毒劑的急性毒性試驗 該實驗按照《消毒技術規范》具體要求進行。分別對實施例1和實施例3的復合乳劑進行試驗。
1、急性經口毒性試驗選取體重18～22g昆明系小鼠20只，雌雄各半。隨機分為2組，每組10只。灌胃前禁食過夜，按最大劑量5000mg/kg一次性灌胃，試驗組灌復合乳劑原液，對照組灌生理鹽水。觀察14d內小鼠的中毒表現，死亡時間和死亡只數。結果見表4 表4復合納米乳劑經口毒性結果組別 反應動物數行為活動 運動死亡(14d內)復合納米乳劑原液組0/10無異常 無異常0/10生理鹽水對照組0/10無異常 無異常0/10 結果表明，復合納米乳劑的LD50大于10000mg/kg，，屬于實際無毒性。
2.皮膚刺激試驗選取3只純種日本大耳白兔。試驗前24h，脊柱兩側去毛左右各約3cm×3cm，不損傷皮膚。左側滴原液0.5ml，右側滴0.5ml的生理鹽水作為對照。4h后，用溫水除去殘留受試物。觀察1h、24h和48h皮膚局部反應。按紅斑和水腫形成的程度計分并計算皮膚刺激指數評定刺激強度。結果見表5。
表5皮膚刺激試驗結果 組別皮膚刺激反應紅斑和水腫形成刺激平均積分皮膚刺激指數刺激強度 復合乳劑組 1h 無24h無48h無00無刺激 對照組 無無無00無刺激 結果表明，復合納米乳劑屬于實際無皮膚刺激性。
3.急性眼刺激試驗選取3只雙眼無異常純種日本大耳白兔。吸取0.1ml復合乳劑滴入白兔左眼結膜囊內，右眼以生理鹽水作對照。滴入后，被動閉眼4s，30s后用生理鹽水沖洗。于滴眼后24h、48h和72h用裂隙燈觀察白兔眼虹膜、角膜損害和結膜充血、水腫4個方面的平均評分，判定復合乳劑對眼睛的刺激程度。結果見表6。
表6急性眼刺激試驗結果組別 眼虹膜、角膜和結膜損害和充血情況刺激評分刺激分級24h48h72h受試眼側無無無0無刺激對照眼側無無無0無刺激 結果表明，復合乳劑對兔角膜、結膜和虹膜的刺激平均積分＝0，無眼刺激性。
4.陰道粘膜刺激試驗選取6只健康純種雌性日本大耳白兔，實驗組和對照組各3只。將復合乳劑或生理鹽水2ml緩慢注入陰道。灌注后24h，處死動物，取出完整陰道，縱切觀察充血水腫表現，10％福爾馬林中固定3d，取陰道的上、下端和中央部位組織切片，HE染色后，病理學檢測。根據上皮組織、白細胞浸潤、血管充血和水腫的情況評分，計算平均分和刺激指數評定對陰道粘膜刺激反應強度。結果見表7。
表7陰道粘膜刺激試驗結果 組別 陰道組織反應反應得分刺激指數 反應強度 上皮組織白細胞浸潤血管充血 水腫 受試組 完好無無 無0＜1 無刺激 對照組 完好無無 無0＜1 無刺激 結果表明，復合乳劑對陰道粘膜刺激指數＜1，無粘膜刺激性。
急性毒性試驗綜合評價結果本發明復合納米乳劑安全、無毒性和無刺激作用，可在人體的皮膚、粘膜多途徑安全使用并有保護作用的特點。可有效預防和抑制生物恐怖原感染、發病，并可對污染的環境、民用設施和精密儀器等實施消毒的新型消毒劑。
權利要求
1、一種蜂膠和銀離子復合納米消毒劑，其特征在于，其為含有濃度為0.125～2g/100ml平均粒徑在30～100納米之間的蜂膠和濃度為3.125～50ug/l的銀離子的水包油型乳劑。
2、根據權利要求1所述的蜂膠和銀離子復合納米消毒劑，其特征在于，還包括有機溶劑，所述有機溶劑為乙醇、甲醇，正丁醇、或丙酮中的一種。
3、根據權利要求1或2所述的蜂膠和銀離子復合納米消毒劑，其特征在于，所述乳劑中所用乳化劑為吐溫-20、吐溫-60、或吐溫-80中的一種。
4、根據權利要求1或2所述的蜂膠和銀離子復合納米消毒劑，其特征在于，所述銀離子來自于硝酸銀或磷酸銀。
5、根據權利要求1或2所述的蜂膠和銀離子復合納米消毒劑，其特征在于，每100體積份乳劑中，含有2重量份蜂膠，5體積份乙醇，10～15體積份吐溫-80，5×10-6重量份硝酸銀，并且當體積份為毫升時，重量份對應為克，依此類推。
6、一種權利要求1至5任一所述蜂膠和銀離子復合納米消毒劑的制備方法，包括以下操作將蜂膠溶于有機溶劑中，室溫條件下，將乳化劑滴加入該蜂膠有機溶液中，同時進行磁力攪拌，直至混合液澄清形成油相，然后邊攪拌邊滴加銀離子水溶液直至最終形成復合乳劑即為所述消毒劑。
7、根據權利要求6所述的蜂膠和銀離子復合納米消毒劑的制備方法，其特征在于，將乳化劑滴加入蜂膠有機溶液中滴加速度為1～2ml/min；滴加銀離子水溶液時滴加速度為3～5ml/min。
8、根據權利要求6或7所述的蜂膠和銀離子復合納米消毒劑的制備方法，其特征在于，所述乳化劑和蜂膠有機溶液的最佳體積比范圍為1∶1～2∶1。
9、根據權利要求6或7所述的蜂膠和銀離子復合納米消毒劑的制備方法，其特征在于，所述銀離子水溶液形成的水相與乳化劑和蜂膠有機溶液形成的油相的最佳體積比范圍為7∶3～4∶1。
全文摘要
公開了一種蜂膠和銀離子復合納米消毒劑，是含有濃度為0.125～2g/100ml、平均粒徑在30～100納米之間的蜂膠和濃度為3.125～50ug/l的銀離子的水包油型乳劑。本發明蜂膠和銀離子復合納米消毒劑的制備方法，是將蜂膠溶于有機溶劑中，室溫條件下，將乳化劑滴加入該蜂膠有機溶液中，同時進行磁力攪拌，直至混合液澄清形成油相，然后邊攪拌邊滴加銀離子水溶液直至最終形成復合乳劑。本發明乳劑具有殺菌時間短、殺滅效果明顯的特點，并可在人體皮膚、粘膜上安全使用，對環境和人體無危害和刺激作用，可用于預防和抑制生物恐怖原感染、發病，并可對污染的環境、民用設施和精密儀器等實施消毒。
文檔編號A01N59/16GK1669434SQ20051006643
公開日2005年9月21日 申請日期2005年4月25日 優先權日2005年4月25日
發明者王嘉軍, 劉敏霞, 王全立, 周勇, 甘慧 申請人:中國人民解放軍軍事醫學科學院野戰輸血研究所