專利名稱：用于提高植物耐旱性的方法和材料的制作方法
技術領域：
本發明涉及NCED3核酸和多肽，并且涉及那些核酸和多肽用于制備具有提高的耐旱性的轉基因植物的應用。
背景技術：
在農業和林業領域，為了供給不斷增長的世界人口和保證可再生原料的供應，已經努力生產具有增加的生長潛力的植物。傳統上這通過植物育種進行。然而，育種過程是耗費時間和勞動力密集型的。并且，對于每一種相關的植物種類必須進行適當的育種計劃。
另外，植物不斷地暴露于各種生物的(例如，病原體感染和昆蟲的吞噬)和非生物的(例如，高溫或低溫，干旱，和鹽度)脅迫。為了在這些挑戰下存活，植物發育了精細的機制，以感知外界信號，并且表現出具有適當的生理和形態學變化的適應性反應(Bolmert等.，1995 Plant Cell，71099-1111)。暴露于低水分或干旱條件的植物典型地具有低產量的植物材料、種子、果實和其它可食用的產物。世界的一些地區持續具有非常少的降雨，并且因此存在為它們的人口而生長足夠的糧食作物的問題。但是，已經觀察到一些植物在缺水的環境下存活并且生長茂盛。為了避免對育種過程的依賴，鑒定賦予提高的耐旱性的基因將有效地使得能夠制備具有提高的耐旱性特征的轉化植物(諸如作物植物)。
發明概述本文獻涉及用于在植物中增加生長潛力和耐旱性的材料和方法，其特征在于穩定地整合到植物基因組的多聚核苷酸的表達。因此，本文獻涉及分離的核酸，由其編碼的多肽，和它們在轉基因植物中的包含。本申請提供的轉基因植物相對于對照植物可以具有必要的表型特征，諸如提高的耐旱性。本文獻還涉及由于提高的耐旱性而具有增加的生長潛力的植物。
一方面，本發明著重描述一種分離的核酸，其包含編碼與SEQ ID NO2列出的氨基酸序列有至少98.4％的同源性的氨基酸序列的多肽的核苷酸序列。所述分離的核酸還可以包含有效連接到編碼所述多肽的核苷酸序列上的控制元件。控制元件可以是廣泛表達型啟動子，脅迫誘導型啟動子，或干旱誘導型啟動子。所述分離的核酸還可以含有可選擇的標記。所述多肽可以具有同SEQ ID NO2列出的氨基酸序列有至少98.7％的同源性，至少99％的同源性，或至少99.5％的同源性的氨基酸序列。
另一方面，本發明著重描述一種純化的多肽，其具有同SEQ ID NO2列出的氨基酸序列有至少98.4％的同源性的氨基酸序列。所述多肽可以具有同SEQ ID NO2列出的氨基酸序列有至少98.7％的同源性，至少99％的同源性，或至少99.5％的同源性的氨基酸序列。
另一方面，本發明著重描述含有至少一種外源核酸的轉基因植物，所述至少一種外源核酸含有編碼具有同SEQ ID NO2列出的氨基酸序列有至少98.4％的同源性的氨基酸序列的多肽的核苷酸序列。相對于缺少編碼所述多肽的核苷酸序列的相同遺傳背景的相應植物，所述轉基因植物可以在干旱條件下展現出更高的生長速率。相對于缺少編碼所述多肽的核苷酸序列的相同遺傳背景的相應植物，所述轉基因植物可以展現出增強的干旱恢復性(drought-recovery)。相對于缺少編碼所述多肽的核苷酸序列的相同遺傳背景的相應植物，所述轉基因植物可以展現出更低的蒸騰速率。所述至少一種外源核酸可以編碼雙子葉植物的9-順式-環氧類胡蘿卜素雙加氧酶(9-cis-epoxycarotenoid dioxygenase)。對于所述至少一種外源核酸，所述轉基因植物可以是半合子的或純合子的。所述轉基因植物可以是F1代植物，F2代植物，BC1代植物，或BC2代植物。所述轉基因植物可以是有繁殖能力的。轉基因植物可以是雙子葉的。轉基因植物可以是單子葉的(例如，玉蜀黍，小麥屬，黑麥屬，大麥屬，燕麥屬，稻屬，稷屬，高梁屬，肯塔基藍草，須芒草屬，彎葉畫眉草，或羊茅屬)。本發明還著重描述本文所描述的轉基因植物的種子。
另一方面，本發明著重描述用于產生轉基因植物的方法。所述方法包括(a)向植物細胞中引入至少一種外源核酸，以產生轉化的植物細胞，其中所述至少一種外源核酸含有編碼具有同SEQ ID NO2列出的氨基酸序列有至少98.4％的同源性的氨基酸序列的多肽的核苷酸序列，和(b)從所述轉化的植物細胞產生轉基因植物。相對于缺少編碼所述多肽的核苷酸序列的相同遺傳背景的相應植物，所述轉基因植物可以在干旱條件下展現出更高的生長速率。相對于缺少編碼所述多肽的核苷酸序列的相同遺傳背景的相應植物，所述轉基因植物可以展現出增強的干旱恢復性。相對于缺少編碼所述多肽的核苷酸序列的相同遺傳背景的相應植物，所述轉基因植物可以展現出更低的蒸騰速率。
除非另外定義，本文所用的所有技術和科學術語具有同本發明所屬領域的普通技術人員通常所理解的相同的意思。盡管與本文所描述的那些相似或等價的方法和材料可以用于實施或檢驗本發明，但是下文描述了適當的方法和材料。本文所提及的所有出版物、專利申請、專利、和其它參考文獻都全部并入作為參考。在有沖突的情形中，本說明書，包括定義，將能夠控制。另外，所述材料、方法和實例僅是舉例說明，并不意欲成為限制。
本發明的其它特征、目的和優點將通過詳述和附圖，和通過權利要求而顯而易見。
附圖簡述
圖1是ABA生物合成的圖示。NCED編碼9-順式-環氧類胡蘿卜素雙加氧酶，其催化黃氧素(xanthoxin)，ABA生物合成中的一種關鍵中間物的產生。
圖2A列出從擬南芥(Arabidopsis thaliana)WS生態型分離的NCED3cDNA序列(SEQ ID NO1)。圖2B列出所編碼的NCED3多肽序列(SEQ IDNO2)。
圖3列出9-順式-環氧類胡蘿卜素雙加氧酶的共有氨基酸序列(SEQID NO3)。符號″<>″表明氨基酸的可變數目。例如，<1>表示直到1(例如，0或1)個任何類型的氨基酸是允許的；<18>表示直到18(例如，0，1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，或18)個任何類型的氨基酸是允許的。
圖4是舉例說明在表現出存在或不存在轉基因NCED3表達的證據的R2代秧苗之間蒸騰速率比較的圖表。
發明詳述植物激素ABA是倍半萜類化合物激素，其在許多生理過程中起著重要的作用，包括種子發育和休眠，植物性(vegetative)生長，和對環境脅迫的反應。當植物經受干旱、鹽或溫度脅迫時，ABA水平增加，并且已經表明這些增加的水平對于脅迫耐受性是必要的(Xiong和Zhu(2003)Plant Physiol.13329-36)。在脅迫發生之前調節ABA水平也給植物提供更好的脅迫耐受性。
ABA是通過分解四十碳類胡蘿卜素前體接著通過ABA醛的黃氧素的兩步轉化而合成的(
圖1；Taylor等.(2000)J.Exp.Bot.511563-1574；和Finkelstein等.(2002)Plant Cell 14 SupplS15-S45)。已經鑒定了一些參與ABA生物合成的擬南芥基因。這些基因之一是NCED3，編碼9-順式-環氧類胡蘿卜素雙加氧酶(NCED)的基因，所述9-順式-環氧類胡蘿卜素雙加氧酶催化黃氧素，ABA生物合成中的一種主要中間物的產生。如本文所述，過量表達NCED3以致改變內生ABA水平的轉基因植物可以更好地抵擋脅迫性(例如，干旱)條件。
多聚核苷酸和多肽本發明提供了分離的NCED(例如，NCED3)核酸和多肽。術語“核酸”或“多聚核苷酸”在本文中可以互換地應用，并且是指RNA和DNA，包括cDNA，基因組DNA，合成的(例如，化學合成的)DNA，和含有核酸類似物的DNA(或RNA)。多聚核苷酸可以具有任何三維空間結構。核酸可以是雙鏈的或單鏈的(即，有義鏈或反義單鏈)。多聚核苷酸的非限制性實例包括基因，基因片段，外顯子，內含子，信使RNA(mRNA)，轉運RNA，核糖體RNA，核酶，cDNA，重組多聚核苷酸，分支多聚核苷酸，質粒，載體，分離的任何序列的DNA，分離的任何序列的RNA，核酸探針，和引物，以及核酸類似物。核酸類似物可以在堿基部分、糖部分、或磷酸骨架上進行修飾，以提高，例如，核酸的穩定性、雜交性、或溶解性。對骨架的修飾包括應用不帶電荷的連接(例如，磷酸甲酯，磷酸三酯，磷酰胺(phosphamidates)，或氨基甲酸)和帶電荷的連接(例如，硫代磷酸酯或二硫代磷酸酯)。對骨架的修飾還可以結合肽連接，例如，以形成PNA-型連接。在堿基部分的修飾可以包括，例如，用脫氧尿苷取代脫氧胸苷，和用5-甲基-2′-脫氧胞苷或5-溴-2′-脫氧胞苷取代脫氧胞苷。糖部分的修飾可以包括，例如，修飾核糖的2′羥基形成2′-O-甲基或2′-O-烯丙基糖。還可以修飾磷酸脫氧核糖骨架，以產生嗎啉代核酸，其中每個堿基部分連接六元嗎啉環，或產生肽核酸，其中脫氧磷酸骨架被假肽骨架取代，并且保留4個堿基。參見，Summerton和Weller(1997)AntisenseNucleic Acid Drug Dev.7(3)187-195；和Hyrup等.(1996)Bioorgan.Med.Chem.4(1)5-23。另外，例如，脫氧磷酸骨架可以被硫代磷酸酯或二硫代磷酸酯骨架，磷酰胺，或烷基磷酸酯骨架取代。
當用于本文時，“分離的”，當指核酸時，是指從在基因組，例如植物基因組中存在的其它核酸分離的核酸，其包括通常側連在所述基因組的核酸的一側或兩側的核酸。用在本文時，關于核酸的術語“分離的”還包括任何非天然存在的序列，由于這樣的非天然存在的序列沒有在天然中發現，并且在天然存在的基因組中沒有直接相鄰的序列。
例如，分離的核酸或多聚核苷酸可以是DNA分子，條件是在天然存在的基因組中通常發現直接與所述DNA分子側連的核酸序列之一被移除或不存在。因此，分離的核酸包括，但不限于，作為不依賴于其它序列的分離的分子(例如，化學合成的核酸，或由PCR或限制性核酸內切酶處理產生的cDNA或基因組DNA片段)而存在的DNA分子，以及結合到載體、自主復制的質粒、病毒(例如，副反轉錄病毒，反轉錄病毒，慢病毒，腺病毒，或皰疹病毒)上的DNA，或原核生物或真核生物的基因組DNA。另外，分離的核酸可以包括工程核酸，諸如作為雜合或融合核酸的部分的DNA分子。例如，在cDNA文庫或基因組文庫，或含有基因組DNA限制性消化液的凝膠切片上成百到上百萬其它核酸中存在的核酸，不被認為是分離的核酸。
當用于本文時，術語“多肽”是指兩個或多個亞基氨基酸、氨基酸類似物、或其它肽模擬物的化合物，而不管翻譯后的修飾(例如，磷酸化和糖基化)。所述亞基可以通過肽鍵或其它鍵連接，例如，酯或醚鍵。術語“氨基酸”是指天然的和/或非天然的或合成的氨基酸，包括D/L光學異構體。通過這一定義包括全長的蛋白、類似物、突變體及其片段。
關于多肽的“分離的”或“純化的”，意指在某種程度上所述多肽與其通常在天然發現的細胞成分(例如，其它多肽，脂質，碳水化合物，和核酸)分離。純化的多肽可以在非還原多聚丙稀酰胺凝膠上產生單一的主帶。純化的多肽可以是至少約75％的純度(例如，至少80％，85％，90％，95％，97％，98％，99％，或100％純度)。例如，純化的多肽可以通過從天然來源提取，通過化學合成，或通過在宿主細胞或轉基因植物中重組生產獲得，并且可以應用，例如，親和層析，免疫沉淀，大小排阻層析，和離子交換層析而純化。純化可以應用，但不限于，柱層析，聚丙烯酰胺凝膠電泳，或高效液相色譜而測定。
當本文所提供的多聚核苷酸和多肽非天然表達時(例如，關于在植物中的定位，諸如根對莖；環境條件；植物種類；發育時間；和/或以增加或減少的量)，它們可以產生對干旱條件具有改變的反應的植物。這些反應包括，例如，在干旱條件下更快的生長速率，增強的干旱恢復性，或更低的蒸騰速率，如由本文所討論的轉基因植物分析所證明的那樣。這些特點可以用來應用或最大化植物產物。例如，本文所提供的核酸可以用來產生這樣的轉基因植物，即，其在不利環境條件下具有對生理性植物表現重要的一種或多種基因(例如，NCED3)的增加的表達。這樣的轉基因植物可以需要更少的水分，導致為農民減少成本并且在干旱條件下有更好的產量，如本文所討論的那樣。因此，本文所提供的多聚核苷酸和多肽可以有效用于制備在農業和林業產業具有特殊應用的轉基因植物。
本發明的多聚核苷酸包括編碼NCED多肽的核酸。SEQ ID NO1和SEQ ID NO2，圖2A和2B所示，分別列出了擬南芥NCED3多聚核苷酸和多肽序列。SEQ ID NO3，圖3所示，列出了共有NCED序列。本發明包括這些序列以及與具有圖2B或圖3所示的氨基酸序列的多肽功能相當的蛋白(和編碼這樣的蛋白的核苷酸)的同系物和直向同源物。還考慮了所描述的多聚核苷酸(和所編碼的多肽)的片段、融合體、補體、和反式補體。
多肽的同系物和直向同源物也可以叫作“功能相當”的多肽。“功能相當”的多肽是具有至少一種共同特征的多肽。這樣的特征可以包括，例如，序列相似性或同源性，生化活性，轉錄模式，和表型活性。例如，具有相似生化活性的功能相當的多肽可以能夠在相同的反應物上作用給出相同的產物。這樣“生化相當”的多肽可以或可以不表現出相同的動力學，對反應物的親和性，或產生所述產物的周轉時間，但是，由于產生了相同的終產物，所以仍認為是功能相當的。例如，功能相當的多肽可以表現出至少60％的具有SEQ ID NO2或SEQ ID NO3列出的氨基酸序列的9-順式-環氧類胡蘿卜素雙加氧酶的生化活性，例如，至少70％，80％，90％，或95％的生化活性。用于評估生化活性的方法包括本領域普通技術人員已知的那些方法，并且包括，例如，酶促檢測和放射性示蹤劑攝取檢測。
另一類功能相當的多肽，本文叫作“表型相當物(phenotypiccomparables)”，可以影響相同的物理特征，諸如植物大小或高度或新陳代謝模式。即使多肽影響相同的物理特征，但是到不同的程度，還是可以認為多肽是表型相當的。例如，表型相當的多肽影響相同的特征(例如，導致增加的高度)，其中由相當的多肽之一引起的定量測定是另一個的大約20％或更多；例如，約20-30％；約30-40％；約40-50％；約50-60％；約60-70％；約70-80％；約80-90％；或約90-100％。因此，盡管一種蛋白將植物高度增加10％和另一種將植物高度增加15％，但是兩種多肽可以是表型相當物。
共有NCED序列氨基酸序列，諸如在圖3中列出的序列，可以通過將9-順式-環氧類胡蘿卜素雙加氧酶序列與各種植物種類相比對，并且確定每個位置上的最常見的氨基酸或氨基酸類型而確定。例如，共有序列可以通過比對來自下列各項的氨基酸序列而確定擬南芥NCED3(GenBank登記號BAB01336)，鱷梨屬NCED3(GenBank登記號AAK00623.1)，鱷梨屬9-順式-環氧類胡蘿卜素雙加氧酶(GenBank登記號AAK00632.1)，擬南芥At3g14440多肽序列(GenBank登記號NP 188062.1)，擬南芥推定的9-順式-環氧類胡蘿卜素雙加氧酶(GenBank登記號AAL07104.1)，大豆屬推定的9-順式-環氧類胡蘿卜素雙加氧酶(Cere克隆號528092)，菜豆屬9-順式-環氧類胡蘿卜素雙加氧酶(GenBank登記號AAF26356.1)，豌豆屬NCED2(GenBank登記號BAC10550.1)，豌豆屬NCED3(GenBank登記號BAC10551.1)，豇豆屬新黃質裂解酶(GenBank登記號BAB11932.1)，番茄屬9-順式-環氧類胡蘿卜素雙加氧酶(GenBank登記號T07123)，馬鈴薯可能的9-順式-環氧類胡蘿卜素雙加氧酶(GenBank登記號T51936)，萵苣屬9-順式-環氧類胡蘿卜素雙加氧酶(GenBank登記號AAK94454.1)，小麥屬9-順式環氧類胡蘿卜素雙加氧酶(Ceres克隆號704111)，玉蜀黍母體萌芽-14多肽(GenBank登記號T04351)，和來自染色體4，BAC克隆OSJNBb0080H08的稻屬多肽序列(GenBank登記號CAE02392.2)。這樣的比對可以用來產生諸如SEQ ID NO3(圖3)列出的共有序列。
本文所提供的分離的多肽可以展現出同SEQ ID NO2列出的NCED3序列或SEQ ID NO3列出的共有NCED序列的不同水平的序列同源性。如下文所描述的那樣，例如，分離的核酸可以包括編碼具有同圖2B列出的NCED3序列(SEQ ID NO2)，或同圖3列出的共有NCED序列(SEQ IDNO3)有至少90％同源性的氨基酸序列的多肽的核苷酸序列。這樣的多肽可以用來，例如，制備具有在干旱條件下更快的生長速率，增強的干旱恢復性，和/或更低的蒸騰速率的轉基因植物。
本文所提供的多肽可以具有同SEQ ID NO2或SEQ ID NO3列出的氨基酸序列有至少90％同源性(例如，95％，96％，97％，98％，98.1％，98.2％，98.3％，98.4％，98.5％，98.6％，98.7％，98.9％，99.0％，99.1％，99.2％，99.3％，99.4，99.5％，99.6％，或100％序列同源性)的氨基酸序列。類似地，本文所提供的核酸可以具有同SEQ ID NO1列出的核苷酸序列有至少90％的序列同源性(例如，95％，96％，97％，98％，98.1％，98.2％，98.3％，98.4％，98.5％，98.6％，98.7％，98.9％，99.0％，99.1％，99.2％，99.3％，99.4，99.5％，99.6％，或100％序列同源性)的核苷酸序列。序列同源性是指任何給出的查詢序列(例如，NCED3序列)和目標序列(例如，SEQ ID NO2列出的NCED3序列)之間的同源性程度。對于任何查詢核酸或氨基酸序列相對于另一目標核酸或氨基酸序列的百分比同源性確定如下。
應用程序ClustalW，其允許跨越它們的全長比對DNA和蛋白序列(總體比對)，將查詢核酸或氨基酸序列與一種或多種目標核酸或氨基酸序列相比較和比對。ClustalW計算所選擇的序列的最佳匹配，并且將它們排列起來，以致可以檢驗同源性、相似性和差異性(Thompson等.(1994)Nucl.Acids Res.224673-4680)。可以將一個或多個殘基的缺口插入到查詢或目標序列中，以最大化序列比對。所述結果反映序列之間的關系。ClustalW可以在線運行，例如，應用ClustalW版本1.83，默認的參量，在BaylorCollege of Medicine Search Launcher網址(searchlauncher.bcm.tmc.edu/multi-align/multi-align)和在萬維網上的European Bioinformatics Institute網址上運行。對于核酸序列的快速成對比對，應用下述默認的參量詞的大小2；窗口大小4；得分方法百分數；頂端對角線數目4；和缺口罰分(penalty)5。對于核酸序列的多重比對，應用下述參量缺口開放罰分10.0；缺口延伸罰分5.0；和重量轉換是。對于蛋白序列的快速成對比對，應用下述參量詞的大小1；窗口大小5；得分方法百分數；頂端對角線數目5；缺口罰分3。對于蛋白序列的多重比對，應用下述參量重量基質blosum；缺口開放罰分10.0；缺口延伸罰分0.05；親水性缺口開啟；親水性殘基Gly，Pro，Ser，Asn，Asp，Gln，Glu，Arg，和Lys；殘基特異性缺口罰分開啟。
為了確定查詢序列和目標序列之間的同源性百分數，將匹配的堿基或氨基酸數目除以堿基或氨基酸的全部數目，并且乘以100。例如，如果查詢序列和主題序列各為500個堿基對長，并且具有200個匹配的(或相同的)堿基，那么所述目標序列將具有對于所述查詢序列40％的序列同源性。如果兩種比較的序列是不同的長度，那么將匹配的數目除以兩種序列長度中更短的序列。例如，如果在400個氨基酸的查詢多肽和500個氨基酸的目標多肽之間有100個氨基酸匹配，那么這些多肽將具有同查詢多肽25％的同源性。
應該理解，與目標序列比對的查詢核苷酸和氨基酸序列可以導致許多不同的長度，每一長度具有其本身的百分數同源性。另外，應該注意到，同源性百分數值可以四舍五入到最接近的十分之一。例如，將78.11，78.12，78.13，和78.14四舍五入到78.1，而將78.15，78.16，78.17，78.18，和78.19四舍五入到78.2。還應該注意到，長度值應該總是整數。
本文提供的多肽可以具有SEQ ID NO2列出的NCED3氨基酸序列。備選地，多肽可以具有SEQ ID NO2列出的NCED3氨基酸序列，限定條件是所述多肽的氨基酸序列相對于SEQ ID NO2在選自由位置18，42，83，145，184，239，271，285，447和485組成的組的1-9個(例如，1，2，3，4，5，6，7，8，或9個)位置具有取代。例如，多肽可以具有SEQ ID NO2列出的NCED3氨基酸序列，限定條件是所述多肽具有位置18的天冬酰胺，位置42的絲氨酸，位置83的蘇氨酸，位置145的亮氨酸，位置184的組氨酸，位置239的天冬氨酸，位置271的谷氨酸，位置285的天冬氨酸，位置447的絲氨酸，或位置485的甲硫氨酸，或所公布的組的直到9個位置的任意其組合。
重組構建體，載體和宿主細胞還提供了含有諸如本文所描述的那些核酸的載體。“載體”是一種復制子，諸如質粒，噬菌體，或黏端質粒，其中可以插入其它DNA片段，以便引起所插入的片段的復制。一般地，當與適當的控制元件締合時，載體能夠復制。適當的載體骨架包括，例如，本領域通常應用的那些，諸如質粒，病毒，人工染色體，BACs，YACs，或PACs。術語“載體”包括克隆和表達載體，以及病毒載體和整合載體。“表達載體”是包括一種或多種表達控制序列的載體，并且“表達控制序列”是控制并且調控另一DNA序列的轉錄和/或翻譯的DNA序列。適當的表達載體包括，但不限于，質粒，和衍生于，例如，噬菌體、baculoviruses、煙草花葉病毒、皰疹病毒、巨細胞病毒、反轉錄病毒、牛痘病毒、腺病毒以及腺相關病毒的病毒載體。許多載體和表達系統可從公司，諸如Novagen(Madison，WI)，Clontech(Palo Alto，CA)，Stratagene(La Jolla，CA)，和Invitrogen/Life Technologies(Carlsbad，CA)商購。
術語“調控序列”，“控制元件”，和“表達控制序列”是指影響轉錄和翻譯起始和速率，和所述轉錄物和多肽產物的穩定性和/和遷移性的核苷酸序列。調控序列包括，但不限于，啟動子，啟動子控制元件，蛋白結合序列，5′和3′不翻譯區(UTRs)，轉錄起始位點，終止序列，多聚腺苷化序列，內含子，和位于編碼序列內的其它調控序列。當用于本文時，“有效連接”意指結合到遺傳構建體中，以便表達控制序列有效地控制目的編碼序列的表達。當RNA聚合酶能夠將所述編碼序列轉錄成mRNA時，然后mRNA可以被翻譯成由所述編碼序列編碼的蛋白時，編碼序列在細胞中被“有效地連接”并且“受控于”表達控制序列。
啟動子是一種表達控制序列，其由DNA分子的一個區域組成，典型地在轉錄起始點上游100個核苷酸內(對于RNA聚合酶II通常在起始位點附近)。啟動子參與RNA聚合酶和其它蛋白的識別和結合，以起始和調節轉錄。為了使得編碼序列受控于啟動子，典型地，有必要使得所述多肽的翻譯閱讀框的翻譯起始位點位于啟動子下游第1個和大約第50個核苷酸之間。
基本的啟動子是組裝轉錄起始所需要的轉錄復合物必需的最小序列。基本啟動子通常包括"TATA盒"元件，其通常位于轉錄起始位點上游大約第15和約35個核苷酸之間。基本啟動子還可以包括"CCAAT盒″元件(典型地CCAAT序列)和/或GGGCG序列，其通常位于轉錄起點上游大約第40和約200個核苷酸，優選地大約第60和約120個核苷酸之間。
在大多數，但不必要是全部的，環境條件和發育狀態或細胞分化下，稱為“組成型啟動子”的啟動子可以促進轉錄。組成型啟動子的非限制性實例包括花椰菜花葉病毒(CaMV)35S轉錄起始區域，衍生于根癌農桿菌(Agrobacterium tumefaciens)T-DNA的1′或2′啟動子，p32449(SEQ IDNO4)，p13879(SEQ ID NO5)，和許多植物基因的其它轉錄起始區域，諸如玉米泛蛋白-1啟動子，是為本領域的技術人員已知的。
當它在許多，但不必是所有，植物組織中促進轉錄時，啟動子可以稱為是“廣泛表達型的”。例如，廣泛表達型啟動子可以促進有效連接的序列在莖，枝條，莖尖(苗端)，和葉片中的一種和多種中的轉錄，但是可以微弱地或完全不促進在組織，諸如花和發育的種子的繁殖組織中的轉錄。例如，有效地連接到編碼序列上的廣泛表達型啟動子可以以比在發育的種子中的轉錄水平高出至少2倍(例如，至少3，5，10，或20倍)的水平促進在植物枝條中的轉錄。備選地或另外，廣泛表達型啟動子可以以比在花的繁殖組織中的轉錄水平高出至少2倍(例如，至少3，5，10，或20倍)的水平促進在植物枝條中的轉錄。廣泛表達型啟動子實例包括，但不限于，p326(SEQ ID NO6)，YP0050(SEQ ID NOS7和8)，YP0144(SEQ IDNOS9和10)和YP0190(SEQ ID NOS11和12)。
“植物啟動子”是能夠在植物細胞中起始(促進)轉錄的啟動子。這樣的啟動子不必是植物源性的。例如，衍生于植物病毒的啟動子，諸如CaMV35S啟動子，或衍生于根癌農桿菌的啟動子，諸如T-DNA啟動子，可以作為植物啟動子。植物源性的植物啟動子的實例是玉米泛蛋白-1(ubi-1)啟動子。其它適宜的植物啟動子包括本領域的普通技術人員所知的那些。植物啟動子可以指導核苷酸序列在植物的所有或某些組織中的表達，例如，組成型啟動子，諸如35S，或廣泛表達型啟動子，諸如p326(SEQID NO6)。備選地，植物啟動子可以指導核苷酸序列在特定組織中的轉錄(組織特異性啟動子)，或可以另外受到更精確的環境控制(可誘導的啟動子)。
“可誘導的啟動子”是指受到具體條件調控的啟動子，諸如光，厭氧條件，溫度，化學藥劑濃度，蛋白濃度，生物體、細胞或器官內的條件。脅迫誘導的啟動子，例如，可以在脅迫條件下被激活，諸如干旱，高溫或低溫，缺乏適當的營養。可以與本文提供的多聚核苷酸一起應用的可誘導的啟動子的一個實例是PARSK1。這一啟動子來自擬南芥編碼絲氨酸-蘇氨酸激酶酶的基因，并且受到脫水作用，ABA，和氯化鈉的誘導(Wang和Goodman(1995)Plant J.837)。脅迫誘導型啟動子的其它實例包括PT0633和PT0688，其分別具有SEQ ID NOS13和14列出的核苷酸序列。這些啟動子在干旱條件下可以是可誘導的。
編碼區3′-末端的多聚腺苷化區域也可以有效地連接到NCED3編碼序列上。所述多聚腺苷化區域可以衍生于天然基因，衍生于其它植物基因，和衍生于轉運DNA(T-DNA)。
本文所提供的載體還可以包括，例如，復制起點，支架附著區(SARs)，和/或標記。標記基因可以賦予植物細胞可選擇的表型。例如，標記可以賦予，生物殺滅劑抗性，諸如對抗生素(例如，卡那霉素，G418，博來霉素，或潮霉素)，或對除草劑(例如，chlorosulfuron或phosphinothricin)的抗性。另外，表達載體可以包括設計成輔助所表達的多肽的操作或檢測(例如，純化或定位)的標記序列。標記序列，諸如綠色熒光蛋白(GFP)，谷胱甘肽S-轉移酶(GST)，多聚組氨酸，c-myc，血凝素，或FlagTM標記(Kodak，New Haven，CT)序列，典型地作為與所編碼的多肽的融合體而表達。這樣的標記可以被插入多肽內的任何地方，包括在羧基或氨基末端。
本文提供的重組DNA構建體典型地包括插入到適宜轉化植物細胞的載體中的NCED多聚核苷酸序列。重組載體可以應用，例如，標準的重組DNA技術(參見，例如，Sambrook等.(1989)Molecular CloningALaboratory Manual.第二版，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold SpringHarbor，NY)而制備。
轉基因植物本文提供的載體可以用來轉化植物細胞并且產生轉基因植物。因此，本發明還提供包括本文所描述的外源核酸的轉基因植物，以及用于制備這樣的轉基因植物的方法。用于轉化廣泛種類的更高等植物種類的技術在本領域內是已知的。應用許多已知的方法的任何一種，包括電穿孔，顯微注射，和生物射彈方法，可以將本文所描述的多聚核苷酸和/或重組載體引入到各種植物宿主的基因組中。備選地，所述多聚核苷酸或載體可以與適當的T-DNA側接區域連接，并且引入到常規根癌農桿菌宿主載體中。這樣的根癌農桿菌介導的轉化技術，包括解除(disarming)以及二元載體的應用，在本領域內是公知的。其它基因轉移和轉化技術包括通過鈣或PEG原生質體轉化，電穿孔介導的裸DNA的攝入，植物組織的電穿孔，病毒載體介導的轉化，和微粒轟擊(參見，例如，美國專利5,538,880，5,204,253，5,591,616，和6,329,571)。如果細胞和組織培養物用作轉化的受體組織，應用本領域的技術人員已知的技術植物可以從所轉化的培養物再生。
“外源”核酸是指通過重組DNA技術引入宿主細胞或生物體的多聚核苷酸。外源核酸是原先不存在于作為所述核酸受體的植物中的，但是向所述核酸最初分離的相同種類的植物中引入一個或多個拷貝的核酸是屬于本發明范圍內的。典型地，外源多聚核昔酸被穩定地整合到宿主細胞或生物體的基因組內。
含有外源核酸的轉基因細胞或植物在本文中對于初級轉基因細胞或植物稱為R1代細胞或植物，對于第一代稱為R2代細胞或植物，對于第二代和后續代的細胞或植物稱為R3，R4，等。R2是指R1代細胞或植物的后代。例如，R2代植物可以是R1代植物自體受精的結果。R3是指R2代細胞或植物的后代。例如，R3代植物是指轉化實驗的直接結果的細胞或植物的第二代后代；R3代植物可以是R2代植物自體受精的結果。轉基因植物可以參與育種計劃，例如，將核酸引入其它株系，將核酸轉運到其它種類或用于其它必要特征的進一步選擇。備選地，對于適用于這樣的技術的那些種類，轉基因植物可以進行無性繁殖。后代可以包括具體的植物或植物株系的后代。例如，后代可以包括F1，F2，F3，F4，F5，F6，F7，F8，F9和后續代植物形成的種子，或BC1，BC2，BC3，BC4，BC5，BC6和后續回交代植物形成的種子。轉基因植物產生的種子可以生長并且然后自交(或異型雜交和自交)，以獲得對于編碼新型多肽的核酸純合的種子。
本文提供的核酸的異位表達可以應用“敲入”方法實現。這里，第一成分，“活化子系(activator line)”，是含有有效連接到啟動子上的轉錄活化子的轉基因植物。第二成分含有有效連接到轉錄活化子的靶點結合序列/區域的需要的cDNA序列。將第二成分轉化到“活化子系”或用于轉化宿主植物以產生“目標”系，其與“活化子系”通過常規培養方法雜交。在每種情形中，結果是所述啟動子促進轉錄活化子蛋白的產生，然后其結合靶點結合區域以促進需要的cDNA的表達。
任何在植物中作用的啟動子都可以用于第一成分，諸如組成型啟動子，組織或器官特異性啟動子，或廣泛表達型啟動子。也可以應用可誘導的啟動子，諸如脅迫-(例如，干旱-)誘導性啟動子，ABA誘導性啟動子，或低濕度誘導性啟動子。適當的轉錄活化子多肽包括，但不限于，編碼HAP1和GAL4的那些。由所選擇的轉錄活化子蛋白識別并且靶向的所述結合序列用于第二成分。
可以培養所轉化的植物細胞，以再生擁有所轉化的表型的植物。再生技術可以取決于植物激素在組織培養生長培養基中的操縱，并且可以取決于與所述目的多聚核苷酸一起引入的生物殺滅劑和/或除草劑標記。再生還可以從植物原生質體、胼胝體、移植體、器官、花粉、胚、或其部分獲得。
轉化的細胞、胼胝體、組織或植物可以通過選擇或篩選特殊特征或活性的工程植物物質，例如，由標記基因或抗生素抗性基因編碼的那些，而鑒定和分離。這樣的篩選和選擇方法學是本領域的普通技術人員公知的。另外，可以應用物理和生物化學方法來鑒定轉化子。這些方法包括用于多聚核苷酸的檢測的DNA印跡分析和PCR擴增；用于檢測RNA轉錄物的RNA印跡，S1 Rnase保護，引物延伸，或RT-PCR擴增；用于檢測多肽和多聚核苷酸的酶或核酶活性的酶促檢驗；和蛋白質凝膠電泳，蛋白質印跡，免疫沉淀，和酶聯免疫檢測，以檢測多肽。其它技術，諸如原位雜交，酶染色，和免疫染色，也可以用來檢測多肽和/或多聚核苷酸的存在或表達。實行所有提及的技術的方法是公知的。當多聚核苷酸穩定地結合到轉基因植物中后，它可以被引入其它植物中，例如，應用標準的育種技術。
本文所描述的多聚核苷酸和載體可以用來轉化許多單子葉和雙子葉植物和植物細胞系統，包括雙子葉植物，諸如紅藍花屬、紫苜蓿、大豆屬、咖啡屬、油菜籽(高芥子酸和油菜)、或向日葵屬，以及單子葉植物，諸如玉蜀黍、小麥屬、黑麥屬、大麥屬、燕麥屬、稻屬、稷屬、莧科、或高梁屬。本文提供的多聚核苷酸和多肽可以在農業和林業領域有具體的應用，并且因此用于作物，諸如谷物作物(例如，小麥屬、玉蜀黍屬、稻屬、稷屬、和大麥屬)；果實作物(例如，番茄屬、蘋果屬、梨屬、草莓屬、桔、葡萄、草莓屬、鳳梨屬、瓜屬(例如，西瓜和甜瓜)、桃、梨屬、櫻屬、檸檬、葡萄柚、李屬、芒果屬、芭蕉屬、和棕櫚)；飼料植物(例如苜蓿)；蔬菜或塊根作物(例如胡蘿卜、馬鈴薯、糖蘿卜、薯蕷屬、蔥屬、花椰菜、豌豆屬、大豆屬、甜玉米、爆玉米花用玉米、番茄屬、馬鈴薯、豆屬(包括菜豆、利馬豆、干豆(dry beans)、和青豆)、萵苣屬、和菠菜屬)；開花植物(例如，矮牽牛屬、薔薇屬、和菊屬)；針葉植物和松屬樹木(例如，松屬、冷杉屬、和云杉屬)；油類作物(例如，向日葵和油菜籽)；煙草；用于實驗目的的植物(例如，擬南芥)；和天然植物(例如，灰白銀膠菊(Partheniurn argentatum))。
因此，本文所描述的方法可以用于屬于，但不限于，下列各目的雙子葉植物Magniolales，八角目(Illiciales)，樟目(Laurales)，胡椒目(Piperales)，馬兜鈴目(Aristochiales)，睡蓮目(Nymphaeales)，毛茛目(Ranunculales)，Papeverales，Sarraceniaceae，昆欄樹目(Trochodendrales)，金縷梅目(Hamamelidales)，杜仲目(Eucomiales)，Leitneriales，楊梅目(Myricales)，殼斗目(Fagales)，木麻黃目(Casuarinales)，石竹目(Caryophyllales)，Batales，蓼目(Polygonales)，白花丹目(Plumbaginales)，五椏果目(Dilleniales)，山茶目(Theales)，錦葵目(Malvales)，蕁麻目(Urticales)，玉蕊目(Lecythidales)，堇菜目(Violales)，楊柳目(Salicales)，Capparales，歐石南目(Ericales)，巖梅目(Diapensales)，柿目(Ebenales)，報春花目(Primulales)，薔薇目(Rosales)，Fabales，川苔草目(Podostemales)，Haloragales，桃金娘目(Myrtales)，山茱萸目(Cornales)，帕洛梯目(Proteales)，檀香目(Santales)，大花草目(Rafflesiales)，衛矛目(Celastrales)，大戟目(Euphorbiales)，鼠李目(Rhamnales)，無患子目(Sapindales)，胡桃目(Juglandales)，牻牛兒苗目(Geraniales)，遠志目(Polygalales)，Umbellales，龍膽目(Gentianales)，花荵目(Polemoniales)，唇形目(Lamiales)，車前目(Plantaginales)，玄參目(Scrophulariales)，風鈴草目(Campanulales)，茜草目(Rubiales)，川續斷目(Dipsacales)，和紫菀目(Asterales)。本文所描述的方法還可以用于屬于，但不限于，下列各目的單子葉植物Alismatales，水鱉目(Hydrocharitales)，茨藻目(Najadales)，霉草目(Triuridales)，鴨跖草目(Commelinales)，谷精草目(Eriocaulales)，帚燈草目(Restionales)，早熟禾目(Poales)，燈心草目(Juncales)，莎草目(Cyperales)，香蒲目(Typhales)，鳳梨目(Bromeliales)，Zingiberales，檳榔目(Arecales)，巴拿馬草目(Cyclanthales)，露兜樹目(Pandanales)，Arales，Lilliales，和蘭目(Orchidales)，或者用于屬于Gymnospermae的植物，例如，松目(Pinales)，銀杏目(Ginkgoales)，蘇鐵目(Cycadales)和買麻藤目(Gnetales)。
同樣地，本發明對十分廣泛范圍的植物種類都有應用，包括來自，但不限于，下列各屬的種屬蔥屬(Allium)，油丹屬(Alseodaphne)，腰果屬(Anacardium)，落花生屬(Arachis)，天門冬屬(Asparagus)，顛茄屬(Atropa)，燕麥屬(Avena)，瓊楠屬(Beilschmiedia)，蕓苔屬(Brassica)，柑桔屬(Citrus)，西瓜屬(Citrullus)，辣椒屬(Capsicum)，長春花屬(Catharanthus)，紅藍花屬(Carthamus)，木防己屬(Cocculus)，椰子屬(Cocos)，咖啡屬(Coffea)，Croton，香瓜屬(Cucumis)，南瓜屬(Cucurbita)，Daucus，Duguetia，油棕屬(Elaeis)，花菱草屬(Eschscholzia)，榕屬(Ficus)，草莓屬(Fragaria)，海罌粟屬(Glaucium)，大豆屬(Glycine)，棉屬(Gossypium)，向日葵屬(Helianthus)，Heterocallis，Hevea，大麥屬(Hordeum)，天仙子屬(Hyoscyamus)，萵苣屬(Lactuca)，膠藤屬(Landolphia)，亞麻屬(Linum)，木姜子屬(Litsea)，黑麥草屬(Lolium)，羽扇豆屬(Lupinus)，番茄屬(Lycopersicon)，蘋果屬(Malus)，Manihot，Majorana，苜蓿屬(Medicago)，芭蕉屬(Musa)，煙草屬(Nicotiana)，木犀欖屬(Olea)，稻屬(Oryza)，稷屬(Panicum)，Pannesetum，罌粟屬(Papaver)，銀膠菊屬(Parthenium)，鱷梨屬(Persea)，碧冬茄屬(Petunia)，菜豆屬(Phaseolus)，松屬(Pinus)，Pistachia，豌豆屬(Pisum)，梨屬(Pyrus)，李屬(Prunus)，蘿卜屬(Raphanus)，Rhizocarya，蓖麻屬(Ricinus)，黑麥屬(Secale)，千里光屬(Senecio)，防己屬(Sinomenium)，白芥屬(Sinapis)，茄屬(Solanum)，高梁屬(Sorghum)，千金藤屬(Stephania)，可可樹屬(Theobroma)，胡盧巴屬(Trigonella)，小麥屬(Triticum)，野豌豆屬(Vicia)，長春花屬(Vinca)，葡萄屬(Vitis)，豇豆屬(Vigna)和玉蜀黍屬(Zea)。
轉基因植物可以表現出本文所描述的多肽的任何生化活性。例如，轉基因植物可以表現出9-順式-環氧類胡蘿卜素雙加氧酶的至少一種生化活性。用于評估生化活性的方法是本領域的普通技術人員已知的。
相對于不是轉基因或對于NCED核酸是轉基因的但并不表達NCED多肽的相應的對照植物，本文所提供的轉基因植物還可以表現出對不利環境條件增強的應答。例如，轉基因植物可以在干旱條件下表現出更高的生長速率，或者在包括干旱期接著重新水化的條件下可以表現出增強的干旱恢復性。轉基因植物還可以比相應的對照植物表現出更低的蒸騰速率。評估改變的生理參量，諸如植物高度和植物蒸騰速率的方法是為本領域的普通技術人員已知的，并且也是本文所討論的。
與缺少所述轉基因或不表達所述轉基因的相應的對照植物相比較，轉基因植物可以具有改變的表型。但在植物中表達時，例如，在適當的時間，適當的組織中，或以適當的表達水平，多肽可以影響植物(例如，轉基因植物)的表型。表型效果可以相對于下列不表達目的外源多聚核苷酸的對照植物而進行評估，諸如相應的野生型植物，對于所述目的外源多聚核苷酸是非轉基因的但是另外是與目的轉基因植物遺傳背景相同的相應的植物，或其中所述多肽的表達受到阻抑，抑制，或不被誘導(即，在表達處于可誘導性啟動子控制下的情形中)的相同遺傳背景的相應植物。當植物表現出低于10％(例如，低于9％，8％，7％，6％，5％，4％，3％，2％，1％，0.5％，0.1％，0.01％，或0.001％)量的由目的植物所表現出的多肽或編碼所述多肽的mRNA時，認為植物“沒有表達”多肽。表達可以應用包括，例如，RT-PCR，RNA印跡，S1 RNAse保護，引物延伸，蛋白質印跡，蛋白質凝膠電泳，免疫沉淀，酶聯免疫檢測，芯片檢測，和質譜的方法進行評估。應該注意到，如果多肽在組織特異性或廣泛表達型啟動子控制下表達，表達可以在整個植物或在所選擇的組織中進行評估。類似地，如果多肽在特定的時間表達，例如，在發育的特定時間或誘導時，表達可以選擇性地在需要的時期進行評估。
表型效果可以是在脅迫環境條件下相對于對照植物改變的生長速率。例如，轉基因植物可以在干旱條件下表現出更高的生長速率。在另一個實例中，轉基因植物可以在緊接著干旱之后經歷重新水化作用時表現出更高的生長速率。因此，干旱條件下，或經歷干旱和重新水化處理時，植物的生理狀況可以是其干旱恢復能力的測定，并且可以用生理參量，諸如，例如，植物高度，新枝條數目，新葉片數目，或種子數目進行評估。
當本文所描述的多肽在轉基因植物中表達時，所述轉基因植物可以表現出比不表達所述多肽的植物更高出約7％-約20％(例如，約10％-約15％；約12％-約18％；約8％-約18％；或約15％-約20％更高)的高度。在另一實例中，當本文所描述的多肽在轉基因植物中表達時，所述轉基因植物比不表達所述多肽的植物表現出更多的新生長。新生長可以作為植物上新枝條或新葉片的數目進行測定。因此，例如，轉基因植物可以具有比相應的對照植物多出1-10個(例如，1，2，3，4，5，6，7，8，9，或10個更多)新枝條，或者甚至是多于10個更多的新枝條。在另一實例中，當本文所描述的多肽在轉基因植物中表達時，與不表達所述多肽的植物相比較，經歷干旱或干旱和重新水化處理后，所述轉基因植物可以表現出更多數目的新葉片。例如，轉基因植物可以具有比相應的對照植物多出1-50片(例如，2，4，6，7，8，9，10，12，15，16，18，20，25，29，30，32，35，37，40，42，45，49，或50更多)的新葉。在另一情形中，當本文所描述的多肽在轉基因植物中表達時，轉基因植物可以表現出比相應的對照植物多出約10％-約95％(例如，約10％-約20％；約10％-約50％；約10％-約70％；約20％-約60％；約20％-約75％；約25％-約85％；約30％-約70％；約35％-約90％；約40％-約60％；約40％-約85％；約50％-約80％；約50％-約90％；或約70％-約90％更多)的種子數目(每株植物的種子數目)。在某些情形中，當本文所描述的多肽在轉基因植物中表達時，所述轉基因植物可以表現出比不表達所述多肽的植物的種子重量高出約5％-約20％(例如，約5％-約10％；約8％-約12％；約10％-約15％；約8％-約18％更高)的每株植物的種子重量增加。
與相同遺傳背景的對照植物相比較，轉基因植物還可以表現出更低的蒸騰速率。蒸騰速率是指示植物如何良好地耐受干旱條件的另一生理參量。例如，具有低蒸騰速率的植物預計比具有高蒸騰速率的植物更緩慢地失水，并且因此將期望其更好地抵抗干旱條件(即，具有更好的耐旱性)。當本文所描述的多肽在轉基因植物中表達時，所述轉基因植物可以表現出與相應的對照植物的蒸騰速率相比較減少約1-100％(例如，2％，4％，6％，8％，10％，12％，15％，18％，22％，28％，35％，37％，42％，45％，47％，50％，55％，64％，68％，71％，75％，77％，80％，83％，86％，89％，90％，92％，95％，98％，或99％)。
應該注意到，表型效果典型地通過一種或多種實驗分析的統計學顯著性而進行評估。應該理解，當比較表型以評估多肽的作用時，在p≤0.05時，具有適當的參量或非參量統計量，例如，Chi-方檢驗，斯氏t-檢驗，Mann-Whitney檢驗，或F-檢驗，認為多肽的差異是統計學顯著性的。其它表型效果可以通過本領域普通技術人員已知的方法進行評估，包括在發育的特定時間的細胞長度測量，新枝條計數，和確定新葉數目。
典型地，在p≤0.05時，具有適當的參量或非參量統計量，例如，Chi-平方檢驗，斯氏t-檢驗，Mann-Whitney檢驗，或F-檢驗，相對于相應的對照植物的種子，認為轉基因植物種子的生長速率、干旱恢復性、和/或蒸騰速率之間的差異是統計學顯著性的。在一些實施方案中，在p＜0.01，p＜0.005，或p＜0.001時，生長速率、干旱恢復性、和/或蒸騰速率的差異是統計學顯著性的。與相應的對照植物種子的內容相比較，例如，在生長速率、干旱恢復性、和/或蒸騰速率中的統計學顯著性差異表明(1)存在于轉基因植物中的重組核酸改變了種子的生長速率、干旱恢復性、和/或蒸騰速率，和/或(2)重組核酸保證作為改變植物中碳含量的候選的進一步研究。
制品本發明還提供制品，其可以包括，例如，本文所提供的轉基因植物的種子混合物(例如，基本上均一的種子混合物)。所述種子混合物可以處于良好狀態，并且通過本領域已知的方式包裝，以形成一套產品。種子的包裝可以具有標簽，例如，系在包裝材料上的標記或標簽，打印在包裝材料上的標簽，或插在袋內的標簽。標簽可以指明，從包含在包裝袋內的種子長成的植物可以產生相對于相應的對照植物具有干旱條件下更高生長速率、增強的干旱恢復性、和/或更低的蒸騰速率的作物。
本發明在下述實例中進一步描述，所述實例并沒有限制在權利要求中描述的本發明的范圍。
實施例實施例1-材料和方法序列搜索將查詢核酸和氨基酸序列針對在公共或個人所有的數據庫中存在的目標核酸或氨基酸序列進行搜索。應用Washington UniversityBasic Local Alignment Search Tool版本2.0(WU-Blast2)程序進行這樣的搜索。WU-Blast2程序可在華盛頓大學(Washington University)blast.wustl.edu在線應用。解釋怎樣應用所述程序的用法指導也可以在blast.wustl.edu/blast/README在線獲得。運行WU-Blast2的一列綜合的和具體的序列搜索服務也可以從華盛頓大學(blast.wustl.edu)在線獲得。對于擬南芥的WU-Blast2服務可以在arabidopsis.org/wublast/index2的WorldWide Web上找到。除非另外指明，應用下述WU-Blast2參量篩選選擇設定為“默認”，輸出格式設定為“缺口比對”，比較矩陣設定為“BLOSUM62”，截斷值(S值)設定為“默認”，期望值(E閾值)設定為10-5，要顯示的最佳比對的數目設定為“10000”，和“分類輸出”選擇設定為通過“p值”分類輸出。打開選擇“-postsw”，以應用Smith-Waterman運算法則將序列比對最優化。
轉化載體的構建2種構建體用于轉化。無啟動子pNB4-NCED3質粒用來產生對照植物。pNB4 p35SAtNCED3質粒，其中p35S啟動子有效地連接到從生態型WS克隆的擬南芥NCED3 cDNA(圖2A；SEQ ID NO1)上，用來產生測試植物。為了制備這些構建體，應用下列引物AtNCED3_5′(5′-CCGGAAGCTTCTGATTGAACACACTTGAAAAATGGCTT；SEQ ID NO15)，和AtNCED3_3′(5′-GCAGTCTAGACACATAAGAACTCACACGACCTGCTT；SEQ ID NO16)，通過PCR從WS DNA擴增NCED3 cDNA片段。將所獲得的NCED3 cDNA PCR片段用Hind III和XbaI消化，并且亞克隆到pNB4-UAS-NOS載體骨架中，以產生pNB4_NCED3，對照構建體。備選地，將所獲得的NCED3 cDNA PCR片段用Hind III和Xba I消化，并且亞克隆到pNB4-35S載體骨架中，以產生pNB4_P35SNCED3，測試構建體。每一pNB4_NCED3和pNB4_P35SNCED3構建體含有農桿菌的左和右邊界(borders)，用于在細菌中選擇的壯觀霉素-抗性基因，和用于植物中抗性選擇的BAR基因。
植物材料和轉化水稻培育種Kitaake用于所有的實驗。應用能夠轉化的胼胝體細胞和農桿菌介導的方法進行轉化。Kitaake在北海道(日本)培育耐寒性，但是不適應任何類型的潮濕或干旱環境。
應用農桿菌和能夠轉化的胼胝體，將pNB4 NCED3和pNB4_P35SNCED3構建體平行引入水稻植物。對于含有每種構建體的植物材料，平行地進行胼胝體誘導，轉化，轉化細胞的選擇和植物再生。對照，或無啟動子的構建體，pNB4_NCED3，用于對照植物的轉化和再生。pNB4_P35SNCED3用于測試植物的轉化和再生。
RT-PCR為了篩選轉化子和基因型植物，從轉基因水稻植物收集大約120mg嫩葉材料，并且應用Qiagen RNeasy Plant袖珍型試劑盒(QiagenInc.，Valencia，CA)分離總RNA。在反轉錄前，將RNA樣品用DNase I，MseI，和DdeI處理，以消除基因組DNA污染。在20μL，應用Superscript II反轉錄酶(Invitrogen Life Technology，Carlsbad，CA)，通過反轉錄1μg總RNA，制備cDNA第一條鏈。將1μL cDNA用于PCR，應用Platinum TagDNA聚合酶(Invitrogen Life Technology)。應用GeneAmp PCR System 9700thennocycler(PE Applied Biosystems，Foster City，CA)，進行PCR反應，在95℃5分鐘，94℃變性1分鐘，52℃退火1分鐘，和72℃延伸1分鐘，30個循環，最后在72℃延伸7分鐘。應用3’端引物NCED3Se4(5′CCGTCCGATCATCTCCAACGAA；SEQ ID NO17)和5’端引物pNB4Seq3′(5′-GTTGCCGGTCTTGCGATGAT；SEQ ID NO18)，擴增NCED3序列。水稻微管蛋白用作內源對照，并且應用引物5′-ACCCTATGGCCAGATCTT (rtublf；SEQ ID NO19)和5′-CAGCTTGAGAGTCCTGAAG(rtublr；SEQ ID NO20)進行擴增。BaR-特異性引物用來檢測BaR基因的存在。pNB4_p35SAtNCED3質粒用作陽性對照，并且將來自非轉基因植物的RNA用作陰性對照。對17株測試植物(即，用pNB4_p35SAtNCED3轉化的)進行基因型分析。這些測試植物中有14株顯示出含有擬南芥NCED3序列。因此，用pNB4_p35SAtNCED3轉化水稻植物是成功。
R1植物的再生將從轉化和再生直接獲得的細胞和植物稱為R1代植物。在這兩種構建體的轉化或再生頻率上沒有觀察到顯著差異。將R1代種子滅菌并且在含有15mg/L抗生素Bialaphos的Murashige & Skoog(MS)培養基(Apollo Scientific Ltd，Bredbury，United Kingdom)中萌發，以選擇轉化的植物。所有的植物都保存在控制在28℃和16h8h光照黑暗循環的Percival(Peny，IA)生長室中。
GA3處理將R2代種子用20％漂白水表面消毒，并且在含有0.4mL/LFinale和過濾滅菌的GA3(gibberellin)至終濃度0，10，100，250，500或1,000μM的半強度MS中萌發。
蒸騰速率測定對于株系T13，為了具有相似大小的R2代和對照秧苗，將R2代種子先于野生型種子2周進行萌發。T7和T9 R2代種子和野生型對照種子同時萌發和確定。將植物轉移到含有半強度MS但是沒有糖的15mL Corning管中，并將生長培養基的終體積調整到14mL。將管子用幾層石蠟膜(Parafilm)緊密地包裹，以確保水分損失只通過蒸騰發生。將R2代和野生型秧苗相對于彼此隨機安置，并且在28℃，16h8h光照黑暗循環中生長。
對每株秧苗，在95和120小時后記錄水分水平。去除根部，并且將秧苗余下的綠色部分稱重，以便鮮重(FW)測定可以確定。應用下述方程，計算每株秧苗的蒸騰速率，其中FW為鮮重 實施例2-生長表型含有pNB4_p35SAtNCED3構建體的R1代測試植物表現出一定范圍的大小。大約一半的測試植物比對照植物更小；一般地，這些測試植物比含有pNB4_AtNCED3構建體的對照更緩慢地生長。其它測試植物沒有表現出明顯的大小異常，并且看起來以與對照植物相似的速率生長。測試植物之間的大小差異可以是由于轉基因表達的不同水平，其又可以是由于NCED3轉基因在不同株系中占據的不同的基因組位置。也可能是由于NCED3過量表達引起的增加ABA水平將能夠解釋在正常條件下稍微減弱的生長。
實施例3-R1代植物的干旱表型將10對R1代植物，每對由1株對照植物(含有pNB4_AtNCED3)和1株測試植物(含有pNB4_p35SAtNCED3)組成，移植到含有土壤的花盆中。每對植物大小匹配。在經受干旱處理前，允許植物在土壤中生長18天，干旱處理通過停止澆水8天或10天而進行。對于在8天后表現出表型跡象的每對植物，添加水分以使植物恢復。對于其它的植物，在10天后加水。通過目測法評估由此獲得的干旱癥狀恢復性。
10對植物中，在經受10天的干旱處理后，有3對植物沒有表現出明顯定義的癥狀。由于來自在單獨的花盆中生長的對照和測試植物的結果可能由于花盆與花盆之間的實驗性變化而被歪曲，所以，當應用在單獨的花盆中并排生長的成對植物時，對照和測試植物之間關于干旱癥狀和干旱恢復性的比較是最優化的。
在干旱條件下觀察到兩種反應。第一種，攜帶pNB4_p35SAtNCED構建體的植物(例如，株系T13和T16植物)表現出比攜帶pNB4_AtNCED3構建體的對照株系(例如，株系C12和C13的植物)更加茂盛和粗壯的生長。經受10天的干旱后，表達NCED3轉基因的測試植物比對照植物更大并且更加粗壯。
第二種類型的反應，與對照植物C7，C8，C9，C10和C15相比較，經受干旱處理之后，測試植物(例如，植物株系T2，T6，T7，T9和T15)表現出更好的恢復性。干旱恢復性實驗的結果在圖4中顯示。對于對照植物，在干旱處理過程的表型沒有明顯不同于測試植物的表型，并且只是當植物重新澆水并且處于恢復期時才變得明顯。
綜合看起來，這些數據表明，擬南芥NCED3基因可以增強水稻植物的耐旱性，并且增強的耐旱性可以采取在干旱時增強的生長或干旱后增強的恢復性的形式。這兩種表型在其它作物中可以是有價值的，諸如，玉蜀黍屬，小麥屬，大麥屬，燕麥屬，或稷屬，它們可以經受間歇性的干旱。
實施例4-萌芽表型從含有pNB4_p35SAtNCED3構建體的11株R1代株系收集種子，包括不與對照在土壤中成對評估的2株(T8和T10)，和沒有表現出清楚的癥狀的1株(T11)。來自測試株系T13和T16的種子，其在R1代顯示出提高的耐旱性，比對照株系T3(對于NCED3轉基因PCR陰性株系)萌芽晚7到10天并且生長更加緩慢。來自測試株系T2，T6，T7和T9的種子，其在干旱處理后顯示出提高的恢復性，比對照萌芽晚1到2天并且生長稍微緩慢一些。株系T7分離出一些白化秧苗，其可以在當植物經受組織培養條件時發生，來自株系T13和T16的種子還在不存在Bialophos時萌發，并且觀察到正常和遲萌發表型的清晰的分離，這與下述觀點一致，即，由轉基因誘導的過量的ABA可能是造成萌發延遲的原因。來自測試株系T15的種子也在Bialophos上表現出緩慢的生長，但是在不存在Bialophos時，不存在清晰的表型分離，這表明BaR基因在這一株系中僅賦予部分的抗性。
為了檢測R3代種子的萌芽能力，將株系T6和T7的純合R3代種子在含有Finale的MS培養基上萌芽。從T6植物傳下來的5組R2代植物中，T6-1和T6-4 R2代植物在R3代中沒有表現出分離的跡象。從T7植物傳下來的5組R2代植物中，T7-5 R2代植物在R3代中沒有表現出分離的跡象。與野生型對照相比較，T6-1和T7-5 R3代群體的萌芽稍微延遲。這些結果表明增加的ABA水平可以導致萌芽的稍微延遲。
綜合看起來，所述數據表明，NCED3轉基因的表達在正常環境條件下可以延長種子的休眠期，并且可以消弱生長。然而，盡管一些R1代測試植物在正常條件下發展性地被消弱，但是當對照和測試植物都經受干旱處理時，它們達到和超越R1代對照植物的大小。當這兩組植物經受干旱恢復性處理時，R1代測試植物還在大小上超越了R1代對照植物。
實施例5-轉基因表達用株系T3，T6，T7，T13和T16的R2代植物材料進行半定量RT-PCR。除了株系T3，其通過RT-PCR表現出十分微弱的條帶，所有的R2代植物都表現出NCED3轉基因的表達。當應用跨越35S的3′區和NCED3的5′區的引物時，對于T3和每一株它的后代通過RT-PCR檢測NCED3轉基因的存在遇到了困難。一種可能是在35S啟動子的3′區存在缺失，因此導致NCED3減少的表達，如由RT-PCR所證明的那樣。
對于株系T6和T7，檢測到證明NCED3轉基因表達的強RT-PCR條帶。這些RT-PCR結果與干旱處理后株系T6和T7表現出的更好的恢復性一致。株系T13和T16也表現出強RT-PCR條帶的存在與提高的耐旱性之間的一致性。綜合看起來，這些數據表明，與對照植物相比較，表現出表達NCED3轉基因的株系在干旱條件下具有更高的生長速率，并且在干旱處理后更能夠恢復。
實施例6-GA3處理的效果在種子萌芽中，ABA和GA3(赤霉素)可以拮抗性地作用。為了確定GA3是否能夠免除NCED3轉基因種子中明顯延長的休眠期，將GA3添加到生長培養基中，種子置于所述培養基中萌芽。即使在低如10μM的濃度，GA3促進萌芽。盡管由此獲得的秧苗更加伸長，但是更高濃度的GA3沒有顯著地改善種子萌芽。因此，加入外源的GA3可以，至少部分地，克服非正常型的延長的休眠期。
實施例7-蒸騰速率測定氣孔的打開和關閉以及相關的蒸騰速率是耐旱性的重要確定因素。為了測定和比較測試和對照植物的蒸騰速率，將R2代種子先于野生型種子2周萌發，以獲得具有相似大小的R2代和對照秧苗。將植物轉移到含有半強度的MS鹽但是沒有任何糖的15mL Coming管(Acton，MA)中，并且生長培養基的終濃度調整至14mL。將管子用幾層石蠟膜(Parafilm M)緊密地包裹，以確保水分損失只通過蒸騰發生。將R2代和野生型秧苗相對于彼此隨機安置，并且對每株秧苗，在95和120小時后記錄水分水平。然后去除根部，并且將秧苗余下的綠色部分稱重，以便鮮重(FW)測定可以確定，并且應用實施例1提供的方程，可以計算蒸騰速率。
對于株系T7，T9和T13，在它們的PCR陽性和PCR陰性分離體之間，和與野生型分離秧苗，比較蒸騰速率。如圖4所示，表達NCED3的植物始終表現出比它們相應的PCR陰性對照更低的蒸騰速率。株系T13，其為在干旱條件下表現出更高的生長速率的株系的一種，表現出最低的蒸騰速率，相對于野生型分離體，在其R2代植物中減少達到約50％。這些數據表明表達NCED3的植物對干旱處理增強的反應至少部分是由于植物蒸騰速率的減少導致，所述減少的蒸騰速率推測起來是由表達NCED3的植物中ABA濃度的增加引起。
實施例8-R2代植物的耐旱性為了證實由在水稻中表達擬南芥NCED3賦予的耐旱性的增加是可遺傳的，在R2代植物中進行脫水實驗。對于每一T13和T16株系，生長2株R2代植物。植物T13-26和T13-27是株系T13的后代，和植物T16-23和T16-24是株系T16的后代。每個花盆含有R2代表達NCED3的植物和未轉化的野生型對照，以致一對植物在單一的花盆中，并且脫水條件對于2株植物是一致的。脫水處理在移植到土壤后第17天開始，通過去除任何剩余的水分并且此后停止澆水。在4個時間點拍取照片在脫水開始時(稱為D0)，第11天(D11)，脫水的末期(D15，D16，和D17)和重新澆水后4小時(D15-4h，D16-4h，和D17-4h)。重新澆水的時間取決于葉片癥狀的嚴重性。觀察到含有最大的植物的花盆的水分損失是更快的。
所有的R2代植物都在脫水過程中表現出耐旱性，并且在重新澆水后表現出快速的恢復。觀察到，盡管在脫水開始時(D0)，植物T13-26和T13-27在大小上比對照植物更小，在干旱處理后(D16和D17)它們同對照植物一樣高。另外，當重新澆水時，轉基因植物在不到4小時內完全恢復，而對照植物在這一時間階段內表現出很少和沒有恢復。綜合看起來，所述數據表明，擬南芥NCED3基因增強了水稻植物對干旱脅迫的耐受性，并且這一增強的干旱脅迫耐受性是可遺傳的。此外，觀察到增強的耐旱性采取在干旱下增強的生長和/或干旱后增強的恢復性的形式。
還研究了測試轉基因水稻植物在嚴重干旱處理下的表現。將株系T16的R2后代(T16-5)生長在未轉化的野生型對照植物旁邊。將兩種植物在移植到土壤后第24天開始脫水，持續7天，然后重新澆水連續5天。T16-5轉基因植物在這種極端脫水下存活，而野生型對照在5天的時間階段內沒有恢復。在對照植物中，頂端三分之一的葉片干枯了并且在90天內枯萎。在T16-5植物中，在種子規格或繁殖能力上沒有減少。進一步的研究表明株系T6和T7的純合植物具有比R1代植物甚至更好的干旱恢復性。綜合看起來，這些數據證實R1代結果，并且表明表達擬南芥NCED3轉基因的水稻植物具有可遺傳的增強的耐旱性。
應該注意到，盡管擬南芥NCED3轉基因的表達可以引起延遲的萌發和生長，但是當維持在干旱下或允許從干旱恢復時，T13和T16植物完全能夠趕上并且超越野生型對照，并且植物產量不受這一延遲的影響。事實上，盡管在正常生長和灌溉條件下，T13和T16植物比野生型對照稍微更矮，但是這些轉基因植物在干旱條件下具有比對照植物的產量更好的產量。
其它實施方案應該理解，盡管本發明結合其詳細的描述進行了描述，在前描述意欲舉例說明，并沒有限制由附上的權利要求的范圍所定義的本發明的范圍。其它方面、優點和改進處于下述權利要求范圍內。
權利要求
1.一種分離的核酸，其包括編碼具有與SEQ ID NO2列出的氨基酸序列有至少98.4％的同源性的氨基酸序列的多肽的核苷酸序列。
2.權利要求1的分離的核酸，其還包括有效連接到編碼所述多肽的核苷酸序列上的控制元件。
3.權利要求2的分離的核酸，其中所述控制元件是廣泛表達型啟動子。
4.權利要求2的分離的核酸，其中所述控制元件是脅迫誘導型啟動子。
5.權利要求2的分離的核酸，其中所述控制元件是干旱誘導型啟動子。
6.權利要求1的分離的核酸，其還包括可選擇的標記。
7.權利要求1的分離的核酸，其中所述多肽具有與SEQ ID NO2列出的氨基酸序列有至少98.7％的同源性的氨基酸序列。
8.權利要求1的分離的核酸，其中所述多肽具有與SEQ ID NO2列出的氨基酸序列有至少99％的同源性的氨基酸序列。
9.權利要求1的分離的核酸，其中所述多肽具有與SEQ ID NO2列出的氨基酸序列有至少99.5％的同源性的氨基酸序列。
10.一種純化的多肽，其具有與SEQ ID NO2列出的氨基酸序列有至少98.4％的同源性的氨基酸序列。
11.權利要求10的純化的多肽，其中所述多肽具有與SEQ ID NO2列出的氨基酸序列有至少98.7％的同源性的氨基酸序列。
12.權利要求10的純化的多肽，其中所述多肽具有與SEQ ID NO2列出的氨基酸序列有至少99％的同源性的氨基酸序列。
13.權利要求10的純化的多肽，其中所述多肽具有與SEQ ID NO2列出的氨基酸序列有至少99.5％的同源性的氨基酸序列。
14.一種包括至少一種外源核酸的轉基因植物，所述至少一種外源核酸包括編碼具有與SEQ ID NO2列出的氨基酸序列有至少98.4％的同源性的氨基酸序列的多肽的核苷酸序列。
15.權利要求14的轉基因植物，其中所述植物相對于缺少編碼所述多肽的核苷酸序列的相同遺傳背景的相應植物，在干旱條件下表現出更高的生長速率。
16.權利要求14的轉基因植物，其中所述植物相對于缺少編碼所述多肽的核苷酸序列的相同遺傳背景的相應植物，表現出增強的干旱恢復性。
17.權利要求14的轉基因植物，其中所述植物相對于缺少編碼所述多肽的核苷酸序列的相同遺傳背景的相應植物，表現出更低的蒸騰速率。
18.權利要求14的轉基因植物，其中所述至少一種外源核酸編碼雙子葉植物的9-順式-環氧類胡蘿卜素雙加氧酶。
19.權利要求14的轉基因植物，其中所述植物對于所述至少一種外源核酸是半合子的。
20.權利要求14的轉基因植物，其中所述植物對于所述至少一種外源核酸是純合的。
21.權利要求14的轉基因植物，其中所述植物是F1代植物，F2代植物，BC1代植物，或BC2代植物。
22.權利要求14的轉基因植物，其中所述植物是可繁殖的。
23.權利要求14的轉基因植物，其中所述植物是雙子葉植物。
24.權利要求14的轉基因植物，其中所述植物是單子葉植物。
25.權利要求24的轉基因植物，其中所述植物是玉蜀黍，小麥屬，黑麥屬，大麥屬，燕麥屬，稻屬，稷屬，高梁屬，肯塔基藍草，須芒草屬，彎葉畫眉草，或羊茅屬。
26.權利要求14的轉基因植物的種子。
27.一種用于產生轉基因植物的方法，所述方法包括(a)向植物細胞中引入至少一種外源核酸，以產生轉化的植物細胞，其中所述至少一種外源核酸含有編碼具有同SEQ ID NO2列出的氨基酸序列有至少98.4％的同源性的氨基酸序列的多肽的核苷酸序列，和(b)從所述轉化的植物細胞產生轉基因植物。
28.權利要求27的方法，其中所述轉基因植物相對于缺少編碼所述多肽的核苷酸序列的相同遺傳背景的相應植物，在干旱條件下表現出更高的生長速率。
29.權利要求27的方法，其中所述轉基因植物相對于缺少編碼所述多肽的核苷酸序列的相同遺傳背景的相應植物，表現出增強的干旱恢復性。
30.權利要求27的方法，其中所述轉基因植物相對于缺少編碼所述多肽的核苷酸序列的相同遺傳背景的相應植物，表現出更低的蒸騰速率。
全文摘要
本發明描述了分離的NCED3核酸和多肽，以及應用這樣的核酸和多肽制備具有增強的耐旱性的轉基因植物的方法。
文檔編號A01H5/00GK1973044SQ200580019678
公開日2007年5月30日 申請日期2005年4月22日 優先權日2004年4月23日
發明者方綺雯, R·I·彭內爾 申請人:塞雷斯公司