感官特性改進的大豆組合物和產生方法

專利名稱：感官特性改進的大豆組合物和產生方法
背景技術：
本發明要求2004年7月9日提交的美國臨時專利申請系列號60/521,846的優先權，該專利申請的全部公開內容通過引用明確結合到本文中。
1.發明領域 本發明涉及營養和食品科學領域。具體的說，本發明涉及感官特性改進如氣味減少的大豆組合物及其使用和生產方法。
2.相關技術的描述 大豆可提供對人類健康有益的高質量蛋白質(Hermansen等，2003；Bazzano等，2001；美國食品和藥物管理局，1999)。在過去的三十年中，對大豆用以制造大豆食品的需求上升得不如預計的那么多(Wolfe和Cowan，1975；SoySource，The United Soyboard Board 1999)。這部分上是因為大豆制品所伴隨的不適宜氣味(McLeod和Ames，1988；Freese，1999)。這種不適宜的大豆氣味通常被描述為“大豆腥味”。給大豆賦予大豆腥味特征的成分包括許多揮發性脂肪酸、脂族羰基化合物、胺類、醇類、醛類和呋喃類，這些物質衍生自酶類對大豆中存在的各種化合物的作用和這些化合物由許多機制造成的進一步氧化(Wolfe和Cowan，1975；Sessa和Rackis，1977)。
Kobay Ashi等(1995)總結，造成未煮過的豆漿出現氣味的主要物質是(反式，反式)-2，4-壬二烯醛、(反式，反式)-2，4-癸二烯醛、己醛、2-戊基呋喃、1-辛烯-3-酮、(反式)-2-壬烯醛和(反式，順式)-2，4-壬二烯醛。從熱處理豆漿提取出的最強烈氣味經鑒定為(反式，反式)-2，4-癸二烯醛和正己醛(Feng，康奈爾大學博士學位論文，2000)。(反式，反式)-2，4-癸二烯醛的形成在室溫下慢速發生(Frankel，1988)，但在大豆處理過程中的熱條件下由于熱降解作用這一反應得到增強(Lin，2003)。其它造成氣味的物質是(反式)-4，5-環氧基-(E)-2-癸烯醛(從2，4-癸二烯醛形成)、(反式，順式)-2，6-壬二烯醛、(反式)-2-壬烯醛、(反式，反式)-2，4-壬二烯醛、2，4壬二烯醛、麥芽酚、香蘭素和β-大馬酮。由氣味測定法檢測所要求的最小頂隙體積(minimum headspace volume)測定出的豆漿中最強烈氣味物質，是己醛、乙醛、甲硫醇、二甲基三硫和2-戊基呋喃(Boatright，2002)。
大豆分離蛋白中最強烈的氣味物質經鑒定為二甲基三硫、(反式，反式)-2，4-癸二烯醛、2-戊基吡啶、(反式，反式)-2，4，-壬二烯醛、己醛、苯乙酮和1-辛烯-3-酮(Boatright和Lei，1999)。甲硫醇和二甲基三硫的形成機制涉及到脂質氧化形成的自由基(Lei和Boatright，2003)和酶類如半胱氨酸合酶的產物(Boatright，2003，poster 45C-26，IFT annualmeeting，Chicago)。
2-戊基吡啶的形成由2，4-癸二烯醛和氨在室溫下的自發反應發生。精氨酸、賴氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺這些游離氨基酸，可能通過在大豆蛋白質加工過程中提供氨而使2-戊基吡啶的形成增加。(Zhou和Boatright，2000；Kim等，1996)。游離氨基酸還能形成其它不適宜的產物。天冬酰胺和葡萄糖暴露于高溫會導致形成丙烯酰胺(Jung等，2003)。暴露在蒸煮溫度下的精氨酸能形成誘變劑(Knize等，1994)。游離精氨酸富含于缺乏β-伴大豆球蛋白和大豆球蛋白的大豆中(Takahashi等，2003)。
氣味一旦形成就難以從大豆成分中除去，因為它們與蛋白質相結合(Franzen和Kinsella，1974)。由于一些氣味結合到大豆蛋白質上，加入到大豆食品中的天然香料的質量也受到不利改變。羰基化合物和2-戊基吡啶與大豆球蛋白級分結合的親和力比與β-伴大豆球蛋白級分的更大(Zhou等，2002；O’Keefe等，1991)。將油體結合蛋白和極性脂質提取出來，可顯著減少與大豆分離蛋白相結合的氣味的數量(Samoto等，1998)。
蛋白質-蛋白質相互作用造成的質構(texture)對氣味強度的影響比入鼻(in-nose)氣味濃度更大(Weel等，2002)。大豆蛋白質可通過形成不溶性聚集體和石灰口感(chalky mouthfeel)造成大豆飲料的感官質量粗劣。在主要的大豆蛋白質當中，大豆球蛋白對pH和Ca+2引起的不溶性作用更為敏感(Yuan，2002)，所以大豆球蛋白與β-伴大豆球蛋白之比低的大豆對于制造可溶性大豆蛋白質成分是有用的(美國專利第6,171,640號)。脂質氧化反應也會影響蛋白質可溶性。在大豆分離蛋白制造過程中可加入抗氧化劑，以限制自由基引起的蛋白質氧化，提高可溶性蛋白質的產量(美國專利第5,777,080號)。一些肽類在加工過程中可與多糖反應形成抗氧化化合物(Matsumura，2003)。
顏色影響到新鮮感和味感(Joshi，2000)。少量的還原糖和脂質氧化所形成的醛類在加熱時會與蛋白質的氨基發生Maillard褐變反應，形成褐色色素(Kwok等，1999)。醛類含量較高的豆漿在熱加工后會產生更深、更不吸引人的顏色。另一方面，豆漿加工過程中的脂質氧化會使豆漿的黃色色素脫色(Obata和Matsuura，1997)。
通過醇提取、酶處理、蛋白質凝塊(protein curd)洗滌、蛋白質超濾和/或應用閃蒸來提取脂質和其它成分，可將大豆精制以改進風味。這些過程會增加大豆蛋白質成分的成本，且通常會降低有益健康的生物可利用成分的量(例如纖維、寡糖、異黃酮、多不飽和脂肪酸、生育酚、磷脂、生物活性肽)。用以改進大豆蛋白質成分的感官特性加工方法，因氣味結合到大豆蛋白質上和因存在促進氣味形成的條件(pH8-10)，其有效性有限。用誘變育種構建了缺乏脂加氧酶(lipoxygenase)1，2和3中的一種至三種的大豆，以減少大豆腥味氣味的形成(Hajika等，1991)。對從缺乏所述三種脂加氧酶的大豆制得的豆漿和大豆粉進行香氣分析，發現與含有所有三種脂加氧酶的親本大豆品系相比，有幾種氣味含量較低，但1-辛烯-3-醇的含量較高(Hao等，2002)。在從一種缺乏三種脂加氧酶的大豆品系和兩種其它大豆品系制得的脫脂大豆粉和大豆分離蛋白中，發現了類似水平的2，4-癸二烯醛(Boatright等，1998)。從缺乏脂加氧酶的大豆制備得到的大豆食品與從對照大豆制得的食品相比風味有改進(Wilson，1996)。從缺乏三種脂加氧酶的大豆制備得到的豆漿感覺起來比對照大豆更苦，特別是種子保存15個月以后，但預期這一差別可通過加糖來消除(Torres-Penaranda和Reitmeirer，2001)。
提出了進行轉基因修飾，以通過減少多不飽和脂肪酸(美國專利第5,981,781號)、脂加氧酶(美國專利申請第20030074693號)和/或氫過氧化物裂合酶(美國專利第6,444,874號)的水平來改進大豆的風味。含有小于10％多不飽和脂肪酸和大于75％油酸的大豆產生出的煎炸油比多不飽和脂肪酸含量高的煎炸油味道要差(Warner等，2001)。
可用諸如聚磷酸鹽的化學品(美國專利第6,355,296號)限制異味產生和改進蛋白質可溶性。其它添加劑如沒食子酸(PCT WO 01/06866)或醛氧化酶(Maheshwari等，1997)可用來除去氣味。
有關天然遺傳變異對大豆的風味和顏色品質的影響的出版信息很少。測定了16個大豆品種的硫代巴比妥酸值，作為脂質氧化的量度，沒有發現與大豆維生素E含量的相關性(Dahuja和Madaan，2004)。測定了從三個大豆品種制得的大豆粉和大豆分離蛋白中2-戊基吡啶和2，4-癸二烯醛的量(Zhou和Boatright，1999)。研究了干燥條件對從大豆去除綠色色素——葉綠素的影響(Salete等，2003；Sinnecker等，2002)。
在過去的十年中科學家們證實，從缺乏脂加氧酶的大豆制備得到的油類不具有改進的氧化穩定性。從無脂加氧酶大豆生產出來的大豆蛋白質仍含有顯著水平的大豆腥味(Maheshwari等，1997)。
制備豆漿或大豆蛋白質成分的第一步是將大豆脫殼(或者去皮)以產生大豆果肉。還可使下胚軸與子葉分離。大豆果肉定義為脫殼大豆，可包括或不包括子葉。大豆果肉的制備方法描述于例如美國專利第5,727,689號中。一種脫殼的方法包括但不限于使種子通過逆流輥子(counter-current roller)或碾碎輥之間，并將輕質皮殼抽吸掉而留下果肉。可將果肉浸泡在水中以生產豆漿，或者使果肉成薄片并用己烷提取，作為按需制備脫脂大豆粉、大豆濃縮蛋白、大豆分離蛋白和純化蛋白質級分的起始步驟。
本發明提供新的方法來測定大豆果肉阻止主要氣味化合物(被鑒定為2，4-癸二烯醛、己醛、己醇和1-辛烯-3-醇)的產生的能力。選定這些化合物作為不同類型氧化反應的程度的指標。己醛和己醇由氫過氧化物裂合酶和醇脫氫酶分解含氫過氧化物的化合物(脂肪酸9碳位和12碳位上的過氧化物)而產生。2，4-癸二烯醛是不知是否涉及氫過氧化物裂合酶的脂加氧酶途徑的分解產物。1-辛烯-3-醇由氫過氧化物裂合酶對亞油酸10碳位上形成的氫過氧化物的作用而形成。這些化合物可因另外的加工進一步發生反應，形成更濃烈的氣味。例如，2，4-癸二烯醛涉及2-戊基吡啶的形成，1-辛烯-3-醇涉及到1-辛烯-3-酮的形成。
發明概述 在一個方面，本發明提供從含有脂加氧酶1、2和3的大豆生產的大豆果肉組合物，其中所述組合物按總脂肪酸的百分比包含大于10％的亞油酸，在溫和含水條件下氧化后包含小于20μg/克的總2，4-癸二烯醛加上己醛加上己醇。所述組合物可包含或不包含所述各脂加氧酶或其任何組合，且可包含失活的脂加氧酶。在一個實施方案中，所述組合物包含脂加氧酶-2。在某些實施方案中，本發明提供的組合物可包含小于約15μg或小于約18μg的總2，4-癸二烯醛加上己醛加上己醇。在其它的實施方案中，所述組合物可包含約6μg-約20μg、約10μg-20μg或約12-18μg的總2，4-癸二烯醛加上己醛加上己醇。在其它實施方案中，所述組合物按總脂肪酸的百分比可包含小于4％的亞麻酸，包括小于約3％和約1％-4％或約2％-約4％。
在另一個實施方案中，本發明的組合物可包含小于2000μg/克的游離精氨酸和/或小于400μg/克的游離天冬酰胺，包括小于約1800μg/克的游離精氨酸和/或小于約350μg/克的游離天冬酰胺。這種組合物在某些實施方案中可包含約300μg-2000μg/克的游離精氨酸，包括約500-2000、約1200-1800和約1000-2000μg/克的游離精氨酸。本發明提供的組合物在某些實施方案中還可包含約50μg-約400μg/克的游離天冬酰胺，包括約100-400、100-350、200-400、300-400知250-400μg/克的游離天冬酰胺。
在還另一個實施方案中，本發明提供的組合物可具有這樣的顏色按其中L*表示光亮度和b*表示藍(-)-黃(+)色軸上色調的CIE-L*a*b*系統進行監測，經測出為b*值小于30和L*值大于80。在某些實施方案中，本發明的組合物可具有測出b*值為約18-30、約20-30、約25-30和小于約25的顏色。在其它的實施方案中，本發明提供的組合物可具有約80-100、約80-90和大于約90的L*值。在某些實施方案中，本發明提供的組合物在溫和含水條件下氧化后可包含小于8μg/克的1-辛烯-3-醇含量，包括小于約6μg、小于約5μg、約1.3-約8μg、約2-約8μg和約4-約8μg。本發明提供的組合物還可以具有大于30％蛋白質的β-伴大豆球蛋白，有小于25％蛋白質的大豆球蛋白。這種組合物可進一步定義為有大于約40％的蛋白質為β-伴大豆球蛋白，和有約30％-約60％、約40％-60％、約35％-55％和約30％-約50％的蛋白質為β-伴大豆球蛋白。這種組合物可進一步定義為大豆球蛋白含量小于約20％、15％和10％，和可包含約0％-25％、5％-20％、1％-25％和約10-25％蛋白質的大豆球蛋白。
在本發明的另一個方面，提供大豆果肉組合物，其有大于30％的蛋白質為β-伴大豆球蛋白，有小于25％的蛋白質為大豆球蛋白，游離精氨酸小于5,000μg/克，游離天冬酰胺小于900μg/克。這種組合物在某些實施方案中可包含約300-5,000μg/克、約1,000-5,000μg/克、約3,000-5,000μg/克、約1,000-4,000μg/克和約500-2,000μg/克的游離精氨酸。這種組合物在某些實施方案中可包含小于400μg/克的游離天冬酰胺，約50-400μg/克、約100-400μg/克、約100-700μg/克和約200-900μg/克的游離天冬酰胺。在一個實施方案中，組合物具有小于2,000μg/克的游離精氨酸和小于400μg/克的游離天冬酰胺。
在另一個實施方案中，所提供的組合物在溫和含水條件下氧化后包含小于4μg/克的1-辛烯-3-醇含量，包括小于約3μg、約1.3μg-3μg、約1.3μg-4μg和約2μg-4μg/克。在還其它的實施方案中，所述組合物的亞麻酸濃度占總脂肪酸的1％至14％之間，包括約3-14％、約5-14％、約1.5％-12％、約3-12％和約7-14％。在又另一個實施方案中，所述組合物的亞油酸濃度占總脂肪酸的10％至60％之間，包括約10％至50％之間、約10％至40％之間、約15％至60％之間、約20％至50％之間和約20％至60％之間。
在某些實施方案中，本發明提供的大豆果肉組合物可定義為缺乏一種或多種脂加氧酶。在一個實施方案中，本發明提供的大豆果肉組合物可定義為缺乏脂加氧酶-2。在其它的實施方案中，不存在脂加氧酶-1、脂加氧酶-2和/或脂加氧酶-3的任何組合，包括任何兩種或所有三種這些脂加氧酶。本發明的組合物還可定義為具有以下顏色特征按其中L*表示光亮度和b*表示藍(-)-黃(+)色軸上色調的CIE-L*a*b*系統進行監測，測出b*值小于30和L*值大于80。在還其它的實施方案中，本發明提供的組合物可包含67-69mg賴氨酸/克蛋白質，可包含72-80mg精氨酸/克蛋白質和/或可包含28-30mg組氨酸/克蛋白質。
在又另一個方面，本發明提供分析大豆的氣味產生特性的方法，所述方法包括測定至少一種選自2，4-癸二烯醛、己醇、己醛和1-辛烯-3-醇的化合物的水平。在一個實施方案中，所述方法可包括測定所述化合物的水平，所述測定包括將約1份大豆種子粉和約4份水的混合物溫育約1至約40分鐘的時間，和用己醛、己醇和癸二烯醛的氘化標準品定量至少一種選自2，4-癸二烯醛、己醇、己醛和1-辛烯-3-醇及其組合的化合物的量。大豆種子粉可從脫殼大豆制得。
在還又另一個方面，本發明提供獲得產生氣味產生特性降低的大豆和大豆果肉的大豆品種的方法，所述方法包括測量來自第一和第二大豆品種的一顆或多顆大豆或大豆果肉中至少一種選自2，4-癸二烯醛、己醇、己醛和1-辛烯-3-醇及其任何組合的化合物的水平，和選出可生產所述化合物水平較低的種子的品種。所述方法可進一步包括使選定品種的植株與另一植株雜交產生后代，和測量來自后代的一顆或多顆大豆或大豆果肉中至少一種選自2，4-癸二烯醛、己醇、己醛和1-辛烯-3-醇及其任何組合的化合物的水平。
在還又另一個方面，本發明提供選擇可抵抗真菌感染的大豆品種的方法，所述方法包括選出包含小于5μg 1-辛烯-3-醇/克種子的品種，所述含量通過將約1份大豆種子粉和約4份水的混合物溫育約1至約40分鐘的時間并測量1-辛烯-3-醇而測出。
在還又另一個方面，本發明提供標號0119149的大豆植株的種子，所述植株的代表性種子已保藏于ATCC，檢索號為PTA-6197。本發明進一步提供通過使這種種子生長而產生的大豆植株0119149或其部分。本發明的這種植株可包含轉基因。在還其它的實施方案中，本發明提供產生衍生自大豆植株0119149的大豆植株的方法，所述方法包括以下步驟(a)通過使大豆植株0119149的植株與另一大豆植株雜交制備衍生自大豆植株0119149的后代植株，其中大豆植株0119149的種子樣本已保藏于ATCC，檢索號為PTA-6197；(b)使所述后代植株自身雜交或與第二植株雜交，以產生下一代后代植株的種子；(c)從所述種子生長出下一代后代植株，并使所述下一代后代植株自身雜交或與第二植株雜交；和(d)再重復步驟(b)和(c)3-10代，產生衍生自大豆植株0119149的近交大豆植株。
在還又另一個方面，本發明提供在溫和含水條件下氧化后具有改進感官特性的大豆(即味道、顏色、氣味和口感特性改進的大豆)。還提供顏色更淺的大豆，以改進大豆的感官特性。還進一步提供游離精氨酸和天冬酰胺含量低的大豆，以改進大豆的感官特性。在另一個實施方案中，提供亞油酸和亞麻酸水平減少的大豆，以改進感官特性。
在一個實施方案中，本發明提供的大豆植株可包含一種或多種轉基因。轉基因的實例包括賦予除草劑抗性的基因(會產生具有除草劑抗性的植株)和賦予昆蟲抗性的基因。
根據本發明提供大豆種子，所述種子含有脂加氧酶1、2和3，按總脂肪酸的百分比含有大于約10％的亞油酸，在溫和含水條件下氧化后產生小于20μg/克磨碎種子的總2，4-癸二烯醛加上己醛加上己醇。
根據本發明的另一個方面提供大豆，所述大豆含有脂加氧酶，按總脂肪酸的百分比含有小于約4％的亞麻酸和大于約10％亞油酸，在溫和含水條件下氧化后產生小于20μg/克磨碎種子的總2，4-癸二烯醛加上己醛加上己醇。相同的大豆在溫和含水條件下氧化后還可產生小于8μg/克磨碎種子的1-辛烯-3-醇含量。
根據本發明的還又另一個方面，本發明還提供大豆，所述大豆每克干種子重量含有小于約2000μg游離精氨酸和小于約400μg游離天冬酰胺，在溫和含水條件下氧化后每克磨碎大豆產生小于約20μg/gm的2，4-癸二烯醛、己醛和己醇。相同的種子在溫和含水條件下氧化后每克磨碎大豆種子還可產生小于8μg的1-辛烯-3-醇含量。
根據本發明的還又另一個方面提供大豆，所述大豆其黃顏色按“b*值”測量小于30，在溫和含水條件下氧化后每克磨碎大豆產生小于20μg/gm的2，4-癸二烯醛、己醛和己醇。相同的種子在溫和含水條件下氧化后每克磨碎種子還可產生小于8μg的1-辛烯-3-醇含量。
根據本發明的還又另一個方面提供大豆，所述大豆其有大于30％的蛋白質為β-伴大豆球蛋白，有小于25％的蛋白質為大豆球蛋白，在溫和含水條件下氧化后每克磨碎大豆產生小于20μg/gm的2，4-癸二烯醛、己醛和己醇。相同的種子在溫和含水條件下氧化后每克磨碎種子還可產生小于8μg的1-辛烯-3-醇。
根據本發明提供大豆，所述大豆每克包含小于5,000μg的游離精氨酸，小于900μg的游離天冬酰胺，有大于30％的蛋白質為β-伴大豆球蛋白，有小于25％的蛋白質為大豆球蛋白，在溫和含水條件下氧化后每克磨碎大豆產生小于20μg/gm的2，4-癸二烯醛、己醛和己醇。相同的種子在溫和含水條件下氧化后每克磨碎種子還可產生小于8μg的1-辛烯-3-醇。
根據本發明的還又另一個方面提供大豆，所述大豆由第一大豆種子和第二大豆種子雜交產生，所述第一大豆種子其有大于30％的總蛋白質為β-伴大豆球蛋白，有小于25％的蛋白質為大豆球蛋白，所述第二大豆種子在溫和含水條件下氧化后每克磨碎大豆產生小于20μg/gm的2，4-癸二烯醛、己醛和己醇。
根據本發明的還又另一個方面提供大豆，所述大豆由第一大豆種子和第二大豆種子雜交產生，所述第一大豆種子按總脂肪酸的百分比含有小于4％的亞麻酸和大于10％的亞油酸，所述第二大豆種子含有脂加氧酶1、2和3，按總脂肪酸的百分比含有大于10％的亞油酸，在溫和含水條件下氧化后每克磨碎大豆產生小于20μg/gm的2，4-癸二烯醛、己醛和己醇。
根據本發明的還又另一個方面提供分析大豆種子品種的氣味產生特性的方法，所述方法包括將約1份大豆種子粉和約4份水的混合物溫育約1至約40分鐘的時間，和用己醛、己醇和癸二烯醛的氘化標準品定量選自2，4-癸二烯醛、己醇、己醛和1-辛烯-3-醇及其兩者、三者或四者組合的至少一種化合物的量。
根據本發明的還又另一個方面提供大豆培養方法，所述方法包括將約1份大豆粉或脫殼大豆粉和約4份水的混合物在室溫下溫育約1至約40分鐘的時間，和用己醛、己醇和癸二烯醛的氘化標準品定量2，4-癸二烯醛、己醇、己醛和1-辛烯-3-醇的量，并根據結果從育種群體中選擇種子。
根據本發明的另一個方面提供大豆，所述大豆包含轉基因，例如賦予除草劑抗性的除草劑抗性基因和賦予昆蟲抗性的殺昆蟲基因。
根據本發明的另一個方面提供供人類消費的包含大豆的加工食品，所述大豆其有大于30％的蛋白質為β-伴大豆球蛋白，有小于25％的蛋白質為大豆球蛋白，在溫和含水條件下氧化后每克磨碎大豆產生小于20μg/gm的2，4-癸二烯醛、己醛和己醇。
示例性實施方案的描述 本發明提供感官特性改進的大豆組合物、大豆和大豆種子衍生物以及它們的產生方法。本發明的大豆組合物提供改進的味道、顏色、氣味和口感特性。本發明還提供產生這種組合物的方法，和測定大豆品種產生被鑒定為2，4-癸二烯醛、己醛、己醇和1-辛烯-3-醇的主要氣味的能力并用所得結果從育種群體中選擇種子的方法。
按照本發明可如下產生氧化條件將大約0.5大豆粉與2mL水混合，或者將1份大豆粉與4份水混合，以將固體顆粒分散于水中，讓氧化反應在室溫下發生大約1-40分鐘，其中室溫可能在15°至40℃之間。濃縮的懸浮液使得酶類、底物、自由基、自由基清除化合物、酶抑制劑和其它因素可以影響所產生氣味的量。
本發明提供含脂加氧酶的大豆及其衍生的組合物，所述大豆按總脂肪酸的百分比含有小于4％的亞麻酸和/或大于10％的亞油酸，在溫和含水條件下氧化后每克磨碎種子產生小于20μg的2，4-癸二烯醛(CH3(CH2)4CHCHCHCHCHO，CAS No.25152-84-5)加上己醛(CH3(CH2)4CHO，CAS No.66-25-1)加上己醇(CH3(CH2)5OH，CAS No.111-27-3)。相同的大豆在溫和含水條件下氧化后每克磨碎種子或脫殼大豆粉還可產生小于8μg的1-辛烯-3-醇(CH3(CH2)4CHOHCHCH2，CAS No.3391-86-4)。化合物2，4-癸二烯醛、己醇、己醛和1-辛烯-3-醇及其組合用來對大豆的氣味產生特性進行定量。氣味并不限于所列的這些化合物。使用本發明的方法，其它可檢測醛類、酮類和醇類也可用作氣味產生特性的度量。這些化合物的實例包括但不限于丙醛、戊烯醛、戊醛、己烯醛、戊烯醇、庚醛、庚烯醛、苯甲醛、己二烯醛、庚二烯醛、庚醇、辛烯醇、辛烯醛、壬醛、辛二烯酮、2-戊基呋喃、2，3-二甲基戊醛、壬烯醛、麥芽酚、癸烯醛和2-十一烯醛。根據本發明，術語“脂加氧酶”指催化不飽和脂肪酸與氧發生氧化作用產生過氧化物的酶。術語“脂加氧酶”(EC.1.13.11.12)在本領域中也稱為脂氧化酶和雙加氧酶。來自缺乏脂加氧酶1、2和3中一種、兩種或三種的大豆的豆漿和大豆蛋白質成分的氣味由其它研究者進行了評估。高油酸大豆存在4％以下的亞油酸。用本發明的測定法發現，具有這些性狀的某些大豆每克磨碎大豆可產生小于20μg的總2，4-癸二烯醛加上己醛加上己醇，而有一些不會落入這個范圍。本發明發現，有可能構建出含有脂加氧酶1、2和3、氣味產生水平非常低的大豆，且發現無脂加氧酶大豆也可能產生高水平的異味。除了先前沒有進行過氣味產生特性篩選的高β-伴大豆球蛋白組合物之外，本發明特別提供含有脂加氧酶1、2和3及10％以上的亞油酸的新大豆組合物。根據本發明，亞油酸(18∶2n-6)和亞麻酸(183n-6)是具有兩個或三個順式雙鍵的多不飽和脂肪酸。本發明的從無脂加氧酶大豆或高油酸大豆的后代選擇低氣味產生品系的方法落入本發明的范圍內。
氣味1-辛烯-3-醇是在亞油酸10碳位上具有氫過氧化物的脂肪酸的分裂產物。本發明發現，將皮殼除去可極大地降低大豆組合物的1-辛烯-3-醇形成特性。真菌脂加氧酶和氫過氧化物裂合酶可分別形成10-氫過氧化物和1-辛烯-3-醇(Wurzenberger和Grosch，1984；Husson等，1998)。本發明推論認為，1-辛烯-3-醇產生量較低的大豆可抵抗真菌如點霉屬(Phomopsis)真菌對大豆皮殼的污染(Minor等，1995)和/或含有可抑制真菌脂加氧酶的成分。
大豆制品的感官特性取決于大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白的含量。大豆球蛋白更傾向于保持氣味和傾向于形成對大豆制品感官質量產生不利影響的不溶性顆粒。本發明提供這樣的大豆，其有大于30％的蛋白質為β-伴大豆球蛋白，有小于25％的蛋白質為大豆球蛋白，在溫和含水條件下氧化后每克磨碎種子產生小于20μg的總2，4-癸二烯醛加上己醛加上己醇。相同的種子在類似條件下每克磨碎種子還可產生小于8μg的1-辛烯-3-醇。根據本發明，β-伴大豆球蛋白指蛋白質三聚體，分子量為150-200kDa。β-伴大豆球蛋白的三個主要亞單位是α’(72kDa)、α(68kDa)和β(52kDa)。α’和α亞單位含有兩個共價結合的碳水化合物部分，β亞單位則含有一個。Utsumi等，(1997)給出了有關β-伴大豆球蛋白和另一種主要儲存蛋白質大豆球蛋白的結構和特性的綜述。可以利用公共種質如“Moshidou Gong 503”用傳統的育種方法改變β-伴大豆球蛋α’與α亞單位的比例。術語β-伴大豆球蛋白在本申請中包括這些亞單位變種。提供有大于30％的蛋白質為β-伴大豆球蛋白和/或有小于25％的蛋白質為大豆球蛋白的本發明種子，其包含小于5,000μg/g的游離精氨酸和小于900μg/g的游離天冬酰胺。術語“游離”指不與大豆或大豆種子粉中存在的其它分子結合的氨基酸，其可被5％三氯乙酸(TCA)水溶液在4℃下過夜提取溶解出來。選擇包含低水平游離氨基酸的大豆以生產高質量大豆果肉、豆漿、大豆粉、大豆濃縮蛋白和大豆分離蛋白的價值先前沒有得到過說明。
根據本發明制得的大豆成分和食品的顏色可通過減少所形成的醛類(例如己醛和2，4-癸二烯醛)的水平來改進，因為醛類會與胺類反應形成褐色色素。脂質氧化產物水平降低還會限制黃色色素的氧化漂白，使得最終產物的顏色沒那么白。這一潛在的低漂白問題在本發明中通過選擇含有低水平黃色色素的大豆來解決。本發明提供這樣的大豆組合物，其黃顏色按“b*值”測量小于30，在溫和含水條件下氧化后每克磨碎種子產生小于20μg的總2，4-癸二烯醛加上己醛加上己醇。在本文中用以描述大豆種子的顏色的“b*”值代表CIE-L*a*b*色標(CIE，Colorimetry，Publication 15.2，Second Edition，Vienna(1986)，使用Colorflex procedure)，指大豆或大豆粉的藍色(負數)至黃色(正數)，類似地，“L*”值指大豆或大豆粉在CIE-L*a*b*色標上的光亮度。在本發明的一個實施方案中大豆或大豆粉的“L*”值大于80。
可通過常規的植物育種方法，將所需的野生型大豆、商用栽培種或者它們的雜交體與其種子具有本發明的低氣味產生表型的大豆植株進行雜交，來構建出包含低氣味產生性狀加上其它所需性狀(例如產量、高β-伴大豆球蛋白組成、除草劑抗性)的種子。然后選出顯示低氣味性狀和其它所需表型的雜交后代。根據本發明使用的育種方法包括例如Knowles和Briggs(1967)描述的方法和本領域公知的任何相似方法。用以選擇和發育出新的大豆品種的具體方法例如在美國專利第6,653,534號中公開。
本發明還提供從本發明的大豆組合物制得的供人類消費的加工食品。供人類消費的加工食品的實例可例如從本發明的脫殼大豆粉組合物制得。這些衍生物的實例包括但不限于方條狀食品(bar)、飲料、肉類和肉類替代物、大豆酸奶、干酪替代物、營養補充品。
本發明包括了以下實施例以舉例說明本發明的優選實施方案。本領域技術人員應認識到，以下實施例中所公開的技術代表了本發明人發現的在本發明實施中很好地發揮作用的技術，因此可被認為構成了本發明實施的優選方式。但是，本領域技術人員根據本公開應認識到，可對所公開的具體實施方案作出許多改變而不偏離本發明的概念、精神和范圍，且仍獲得同樣的或類似的結果。更具體的說，可以顯而易見的是，可用某些在化學上和生理上都相關的物質替換本文描述的物質，而又獲得相同或類似的結果。對本領域技術人員來說顯而易見的所有這些類似替換物或修改，都認為落入所附權利要求書所定義的本發明精神、范圍和概念之內。
實施例1 材料和方法 本實施例描述本發明的分析方法。這個分析方法的目的是測定不同大豆品系的氣味產生特性。
所述方法是通過首先引發氣味形成來測定選定的氣味的。將種子磨成細粉并用水激活酶類，促使氣味形成。對形成速率的研究表明，室溫下氣味的形成在約20分鐘后就大體上完成(表1)。這個時間對于成功定量氣味化合物和評估不同大豆品系的氣味產生特性是重要的。20分鐘后加入己醛、己醇和2，4-癸二烯醛的氘化替代物以提供內標。加入硫酸鈉終止反應，緊接著加入10％甲醇∶醚來提取醛類、醇類和酮類。所述方法并不限于所列舉的化合物。所有其它可檢測醛類、酮類和醇類都可進行定量，但精密度不如使用氘化替代物的上述三種氣味。
表1大豆粉與水混合(0.5g粉2mL水，即1∶4比例)后的時間對風味成分的形成的影響。四種不同大豆品系(A-4、A-5、A-10和A-14)的懸浮液的pH為約6.3。
測定175個樣品中的這些成分的分析時間花費24小時。這包括進行提取和用氣相色譜/質譜進行測定。分析用樣品的大小通常為0.5克(g)，但可在0.2g-0.7g的范圍。氣味濃度范圍以濕重計為0.2μg/g-120μg/g。
大豆果肉樣品制備收集整粒種子或大豆果肉作為樣品。將來自樣品的大約6-12顆隨機選擇種子或重量相當的大豆果肉片在球磨機中以大約1200轉每分鐘(rpm)研磨1分鐘，產生出細粉。用以研磨種子的球磨機在美國專利公開2003/0146313A1中描述。要確定種子或大豆果肉的數量，以在研磨結束時獲得大約0.5-1.0g的大豆粉。剛磨好的大豆粉用作進一步的分析。
大豆粉的提取將剛磨好的大豆粉用來提取主要的氣味。將大約0.5g(0.48-0.52g)的大豆粉放入20毫升(ml)帶蓋小瓶(VWRTraceCleanTM透明硼硅酸鹽玻璃特氟龍襯里的密封瓶)中。將去離子水加入到小瓶中的大豆粉中，然后蓋回蓋子。將小瓶中的內容物在旋渦混合器中混合大約30秒，確保所有的大豆粉在小瓶中得到完全水合。讓水合大豆粉在溫和含水條件下溫育，該條件在本文中定義為在室溫下(22℃)于水中溫育20分鐘。20分鐘后，將11±0.3克無水硫酸鈉加入到小瓶中，然后將10ml的10％甲醇∶醚溶液加入到小瓶中。接著將30微升的標準替代物(己醛、己醇和癸二烯醛的氘化標準品的混合物)示蹤劑溶液(spiking solution)加入到小瓶中，然后再蓋上蓋子，在往復振蕩器上200rpm下振蕩30-40分鐘。30-40分鐘后，將1ml的甲醇∶醚提取物放入自動進樣器樣品瓶(7683HP自動進樣器的自動進樣器樣品瓶。賣主是VWR)中，供進行進一步的分析。
大豆粉提取物的分析將甲醇∶醚提取介質中的大豆粉提取物在裝有Agilent 7683系列自動進樣器的Agilent 6890氣相色譜儀(395Agilent Technologies，Palo Alto CA 94306)和帶有LECO Chrom TOF軟件的Leco Time of Flight質譜儀(LECO Corporation，St.Joseph，Michigan 49085)中作進一步的分析。氣相色譜儀還裝有10米長的DB-WAX或DB1701氣相色譜柱，膜厚0.4或以上，內徑0.18mm(Agilent Technologies)。甲醇(甲醇是EM Science吹掃捕集級甲醇)獲自VWR(VWR International，West Chester，PA 19380)；乙醚(無水乙醚)荻自Mallinckrodt(Mallinckrodt，Hazelwood，MO 63042)。2，4-癸二烯醛，85％反式(15％順式)、己醛98％、己醇99％、1-辛烯-3-醇98％、2-十一酮99％、2-壬烯醛97％和2，4-壬二烯醛99％獲自Sigma-AldrichCompany(Saint Louis MO 63103)。氘化D12己醛、D13己醇和D2 2，4-癸二烯醛按Lin等(1999)的描述在公司內制備。為分析樣品，將1微升(μl)的樣品通過氣相色譜儀(gc)的注射口注入。氣相色譜中用以分析樣品的參數如下色譜柱DB-Wax或DB 1701毛細管柱10m×0.18mm，0.4mm膜，注射體積1ul，注射套管(liner)裂口/無裂口套管。
溫度程序起始55℃1分鐘，40℃-175℃，40℃/min，保持0分鐘，175℃-240℃，35℃/min，保持0分鐘，入口溫度220℃，注射方式脈沖不分流，起始8psi 1.5分鐘分流比20∶1，載氣∶氦氣，1.8mL/min恒流。
LECO飛行時間參數溫度界面250℃；源溫度200℃；質譜儀源溫度150℃；掃描參數50-250m/z，每秒大約50次掃描。
分析的質量控制對于每一批樣品，同時運行方法空白和添加分析(spike)。添加分析是通過將待分析樣品中的一個分成兩部分。樣品應盡可能均勻。第二部分添加已知量的己醛、1-辛烯-3-醇和癸二烯醛。這一添加是在上述提取程序中氘化化合物的加入時進行的。添加和未添加化合物的濃度按以下公式測定為％回收率
其中 Cs＝添加樣品的濃度，單位μg/(克濕重) C0＝未添加樣品的濃度，單位μg/(克濕重) Wts＝添加樣品的濃度，單位克 Xs＝添加到樣品中的微克數 方法空白按照提取程序進行，但不加入大豆粉。
分析的準確度和精密度通過運行均勻的大豆粉樣品和給該樣品添加已知水平的己醛、1-辛烯-3-醇和2，4-癸二烯醛三種化合物，來測定準確度和精密度。也對未添加樣品進行分析，以測定添加化合物的回收量。可采用不同的添加水平，作為標準添加方法，以測定系統誤差所引起的本底。測定了平均值及標準偏差。將平均值與已知水平的所加入物質進行比較，以估計本方法的準確度。標準偏差給出測量的精密度。注意重要的是要知道，這些辦法只測量分析的差異，因為研磨40顆以上的種子以制備均勻的大豆粉可均分種子差異。由于種子與種子之間的差異，對于實際測定可能會發生更大的差異。對于己醛％回收率為83.8％。對于1-辛烯-3-醇％回收率為93.6％。對于2，4-癸二烯醛％回收率為99.3％。按添加辦法，己醛準確度最低。認為這是由于己醛的揮發性和所述方法對于己醛的回收率低這一事實。辛烯-3-醇和2，4-癸二烯醛用添加辦法準確度較高。回收值的％相對標準偏差所表示的精密度對于己醛和辛烯-3-醇為5％。對于2，4-癸二烯醛，回收值的％相對標準偏差所測出的精密度為1.1％。對于這一均勻樣品，樣品大小從0.2至0.9克沒有發現有什么影響。但樣品大小在各樣品之間可能是個問題，不過對此沒有進行過試驗。因此在已知樣品大小不會是個問題或對所述方法作出調整之前，樣品大小應為約0.5克。
對于所有的化合物，檢測范圍為0.5微克至25微克。向標準曲線加入更多的標準品可擴大這一范圍。
實施例2 低氣味產生大豆的鑒定和選擇 定量從對照大豆(Vinton 81)、缺乏脂加氧酶-2的大豆(QT-1)和缺乏脂加氧酶1、2和3的大豆(IA2025)制得的豆漿的濃烈氣味。豆漿是通過將所需的清潔種子以1∶5比例(1g重量∶5ml水)浸泡在25℃水中約8小時從每個大豆品種制得的。棄去浸泡水后，將原來重量兩倍的大豆排干水，與剛蒸餾得到的水(2X大豆干重)混和五分鐘。將另外的蒸餾水(7X大豆干重)20℃下混和到所得漿液中約2分鐘。將漿液在水浴中95°-98℃下慢煮20分鐘，然后濾過粗織造包布(wovencheesecloth)，并用手擠壓以擠出盡可能多的豆漿。將豆漿在水浴中85°-90℃下慢煮10分鐘進行巴氏滅菌，以減少微生物污染，然后在4℃下保存以備提取氣味作進一步的分析。
從豆漿樣品中提取氣味。用0.67份FreonTM 113將豆漿提取至少30分鐘。移出FreonTM 113提取物后，水相用0.67份乙酸乙酯進一步提取。收集了乙酸乙酯提取物后，棄去水相。將FreonTM和乙酸乙酯濾過硫酸鎂，以除去盡可能多的水，然后用Buchi 0.1旋轉蒸發儀濃縮至1ml。Freon提取物在48千帕(kPa)下蒸發，乙酸乙酯提取物在86kPa下蒸發。
豆漿中產生的濃烈氣味用GC-氣味測定法(Acree T.E，AnalyticalChem.69170A-175A，1997)進行定量。GC-氣味測定法是帶有嗅辨口(sniffing port)的氣相色譜，其可測量某一化學化合物作為氣味物質(odorant)的效力(potency)，作為人對空氣流或呼氣中的氣味物質的反應的量度。將裝有12m×0.32mm交聯聚甲基硅氧烷熔融石英毛細管柱(膜厚＝0.33μm)的Hewlett Packard 6890氣相色譜儀用于CharmAnalysisTM(Acree，T.E.；Bamard，J；Cunningham D.G.；FoodChem.14，273-286，1984)。色譜流出物由作為載氣的氦氣(2ml/min)和作為補充氣體的氮氣(約30ml/min)組成。將色譜流出物與吸入空氣(sniffing air)(20L/min，為99％實驗室空氣，濕度調至50％至75％之間)混合，經直徑10mm的甲硅烷基化pyrax管通過嗅辨儀。GCMS爐程序設定為其溫度開始以6℃/min的速度從35℃的起始溫度增加到225℃。有關將CharmAnalyisTM用于豆漿的方法的更多細節可參見Yu-Wen Feng遞交給康奈爾大學研究生院全體教員的博士學位論文。
兩種缺乏脂加氧酶-2的大豆(IA2025，QT-1)均比對照大豆產生更低水平的己醛(表2)。缺乏所有三種脂加氧酶的大豆(IA2025)產生最高水平的2，4-癸二烯醛和1-辛烯-3-酮，而缺乏脂加氧酶-2的大豆(QT-1品種)所有五種濃烈氣味的水平都最低(表2)。從結果可看出，有脂加氧酶-2之外的未知組成因素參與控制大豆中的脂質氧化。QT-1大豆品種被鑒定為用以構建包含或不包含脂加氧酶-2的商用低氣味大豆品種的有用品種。實施例1的方法被開發來鑒定QT-1和其它可產生低含量2，4-癸二烯醛、己醛、己醇和1-辛烯-3-醇的大豆品系的后代。
表2從三個品種的大豆制備得到的豆漿中存在的氣味魅力值(Charmvalue)。Monsanto品系比無三種脂加氧酶的大豆(IA2025)和tofu大豆(Vinton 81)產生更低水平的異味。
表3描述大豆雜交體，其用于產生描述本發明的后代。用標準的植物育種方法來產生這些品系。
表3產生用于描述本發明大豆和方法的后代的大豆雜交體。
實施例3 根據本發明選擇的大豆品系中低氣味產生、低顏色和低游離氨基酸特性的年間和地點間一致性的證明 為進行顏色評估，收集完整種子作為樣品。從樣品中選出所需數量的種子，在Mega-Grinder中1200rpm下研磨1分鐘，產生磨細的大豆粉。用以研磨種子的Mega-Grinder描述于美國專利公開2003/0146313A1中。將剛磨好的大豆粉用作進一步的分析。
使用Hunter labs(Hunter Associates Laboratory Inc，Reston VA，USA)制造的ColorFlex Spectrocolorimeter Model 45/0顏色測量系統，按廠商建議的標準操作程序來測量大豆粉的顏色。使用ColorFlex程序，根據CIE-L*a*b*色標(CIE，Colorimetry，Publicaion 15.2，SecondEdition，Vienna，1986)對顏色進行測量。國際照明委員會(InternationalCommission on Illuminaion，按其法語名稱Commission Internationalede l’Eclairage縮寫為CIE)是致力于其成員國間的有關涉及照明科學和技術的一切事務的信息國際合作和交流的組織。L*值指大豆粉的光亮度，而b*值則指大豆粉的藍色(負數)至黃色(正數)。從不同品系制得的大豆粉的顏色值在表4和5中顯示。
游離氨基酸未研磨的樣品保存在溫度/濕度控制的密閉(APHIS認可)場所中。用CAT Mega-Grinder研磨樣品產生大豆粉，保存在4℃種子儲藏室中。用5％TCA 4℃下過夜提取大豆粉，提取物在-80℃下保存。將提取物進行過濾，如有必要進行稀釋，然后用OPA方法進行游離氨基酸分析。OPA方法使用鄰苯二甲醛(OPA)在注射到C18反相HPLC柱上之前先衍生化樣品。衍生化的基本氨基酸可通過R基團得到有效分離，并由靈敏的熒光計進行定量檢測。這個方法的相對標準偏差為～3％。
脂加氧酶活性樣品用Mega-Grinder研磨。各剛磨好的樣品稱出一式三份(5mg±1)，放入2-ml 96孔提取板的特定孔中。用0.1MK2HPO4(pH7.0或pH9.0)在室溫下提取樣品1小時。離心后所得上清液用于用分光光度計測量亞油酸(底物)的消耗，然后用Bio Rad蛋白染料測定各樣品的總蛋白質。用1分鐘反應過程中在230nm處的吸光度變化值和用消光系數(ε＝23,000M-1cm-1)計算脂加氧酶單位。通過將每個數值代入方程式A＝εbC，計算出反應過程中所消耗的底物濃度。一單位的脂加氧酶定義為每mg總提取蛋白質每分鐘消耗的底物μmole數。使用在pH7.0或pH9.0下制備的試劑溶液，這種測定法可以分別測量脂加氧酶-2/-3或脂加氧酶-1的水平(酶單位)。對于脂加氧酶-2和3活性，脂加氧酶單位結果以LOX單位pH7.0給出，對于脂加氧酶-1活性以LOX單位pH9.0給出。
結果盡管在多個地點(表4)和多個年份(表4和5)栽培大豆，但大豆氣味特性持續存在。在氣味測定(實施例1中描述)中產生低水平己醛、己醇和2，4-癸二烯醛及1-辛烯-3-醇的大豆品系，與產生水平高的品系始終不同(表4)。將表4中的各大豆品系按其產生的己醛+己醇+2，4-癸二烯醛水平的順序進行排序。例如表頂部的品系A-1產生18.21+/-4.21μg/g的所述三種氣味，與之對比，表底部的品系A-18產生65.74+/-21.97μg/g的所述三種氣味。由來自同一雜交體(例如雜交類型A)的大豆產生的己醛加上己醇的量與所產生的2，4-癸二烯醛的量有關聯(表6，R2＝0.85)，這提示遺傳和組成變化的相似機制及控制。所產生的1-辛烯-3-醇水平獨立于己醛、己醇和2，4-癸二烯醛(表6，R2＝0.01)，這提示形成和控制的機制不同。在2-3個地點栽培的產生低水平1-辛烯-3-醇的大豆品系與產生高水平1-辛烯-3-醇的品系始終不同。例如品系A-18產生4.70+/-0.88μg/g的1-辛烯-3-醇，而品系A-12產生14.67+/-2.37μg/g的1-辛烯-3-醇。可以選擇出具有遺傳組成的組合的品系，其產生更低水平的1-辛烯-3-醇和更低水平的2，4-癸二烯醛加上己醛加上己醇(例如A-6)。
表4A和B由表3所示雜交類型A、B、C、D和E的后代制得的磨碎大豆產生的顏色和氣味。各數值是2002年在兩個或三個地點(Ames，Iowa；Oxford，Indiana；Gladbrook，Iowa)栽培的各品系的平均值和標準偏差(Stdev)。所列雜交類型B的后代具有占總脂肪酸的2.9+/0.4％的低亞麻酸含量。所有的品系都刮去黃色種臍。磨碎大豆的水分含量為8％。顏色值為L*(光亮度)、a*(綠-紅)和b*(藍-黃)。縮寫Stdev＝標準偏差。
表5A和B從商品大豆(對照)和2001年栽培的雜交類型A、B、C、D和E的后代制得的磨碎大豆的特性。磨碎大豆的水分含量為7％。各品系的順序同表4。所列雜交類型B的后代具有低亞麻酸性狀(占總脂肪酸的2.9+/0.4％)。有兩個后代缺乏一種或多種脂加氧酶，其它的含有所有三種脂加氧酶(標號為LI、L2和L3)。脂加氧酶活性單位為每mg蛋白質所消耗的底物微摩爾數。顏色值為L*(光亮度)、a*(綠-紅)和b*(藍-黃)。縮寫Stdev＝標準偏差。
表62001年和2002年大豆后代收獲物所產生的氣味之間R平方值確定的線性關系。線性回歸從表4和5中的數據計算得出。縮寫H+H＝己醛+己醇；D＝2，4-癸二烯醛；O＝1-辛烯-3-醇；DHH＝2，4-癸二烯醛+己醛+己醇。
使用本發明的方法和大豆，有可能第一次地培育出產量優良、低氣味產生、低顏色的大豆品種。例如品系A-1、A-4和A-6的產量為商業標準品系(commercial check)的90、90.5和104％。
pH7和9下的脂加氧酶活性與水合大豆粉的2，4-癸二烯醛+己醛+己醇形成之間沒有或有極少的關系(R平方值＜0.35，表7)。在pH7和9下產生顯著脂加氧酶活性的大豆(品系A-1)其氣味特性與缺乏脂加氧酶活性的品系(品系C-1)類似(表5)。還測定了缺乏脂加氧酶1、2和3的市售大豆(IA2032，來自1999年收獲季節)的脂加氧酶活性和氣味形成情況。對于無三種脂加氧酶的大豆粉，在pH7和9下沒有發現脂加氧酶活性，但在本發明的氣味測定中有顯著水平的己醛(23.3μg/g)、己醇(14.9μg/g)和2，4-癸二烯醛(5.8μg/g)形成。在用脂加氧酶抑制劑進行實驗后得出結論，在此大豆組合物中有至少一種另外的脂加氧酶存在活性。
顏色淺的蛋白質成分為食品工業所青睞，特別是對于奶制品類型的制品。在2-3個地點栽培大豆，以確定是否能夠選擇出低顏色大豆。結果發現，可從磨碎大豆的b*值來選擇出低顏色的大豆(高b*值表示黃色更深，綠色更淺；表4)。例如，大豆A-2的b*值為22.16+/-1.39，大豆A-6的b*值為27.35+/-2.85(表4)。2001年和2002年栽培的大豆品系的b*值之間存在相關性(R平方＝0.7；表7)。
表7R平方值確定的2001年和2002年收獲大豆后代所產生的氣味、游離氨基酸和顏色的線性關系。線性回歸從表4和5中的數據計算得出。對于2002年數據，游離氨基酸相關性在排出三個離群數據(outlier)(A-4、B-5和B-6)下得出的。
除遺傳因素外，環境因素也會影響大豆的組成，從而影響其氣味產生特性。將2001年和2002年這兩季栽培的大豆品系的氣味產生特性進行比較，就可明顯看出環境的影響。對于所構建的各品系，2，4-癸二烯醛+己醛+己醇的范圍是，2001年12-44μg/g，2002年17-65μg/g(表4，5)。大豆的1-辛烯-3-醇產生特性似乎對環境因素最為敏感，這由2001年和2002年栽培的同一品系所產生的1-辛烯-3-醇之間缺乏相關性(R平方＝0.07，表6)得到證明。與此對比，2001年和2002年中大豆品系的2，4-癸二烯醛+己醛+己醇產生水平有相關性(R2＝0.62，表6)。
對大豆后代中的游離精氨酸(Arg)和天冬酰胺(Asp)的量進行了測定。游離精氨酸和天冬酰胺的量有相關性(R2＝0.81，表7)，總精氨酸加上天冬酰胺在353-3300μg/g的范圍(2001)(表5)。大豆中游離精氨酸+天冬酰胺與大豆的選定氣味或顏色特性沒有關系(R平方＜0.3，表7)，因此有必要對游離氨基酸進行測定，以選擇具有低2，4-癸二烯醛、低顏色和低游離氨基酸的組合的品系。在兩個不同年份收獲的各品系中游離精氨酸+天冬酰胺之間的良好相關性(R平方＝0.8；表7)證實了選擇低游離氨基酸大豆品系的可行性。
實施例4 低氣味產生特性與高β-伴大豆球蛋白組成及低游離精氨酸和天冬酰胺組成及低顏色特性的組合 高β-伴大豆球蛋白性狀的來源是缺乏大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白占總蛋白質約55％的突變大豆(美國專利第6,171,640號)。如上所述，脂加氧酶測定對于選擇低氣味產生品系沒有用。構建了其蛋白質、脂肪和氨基酸性質(profile)在商品大豆正常范圍內的大豆。
大豆蛋白質亞單位的定量用Mega Grinder(美國專利公開2003/0146313A1)研磨約8顆種子。對于每個樣品，將～30mg的粉在章動器(nutator)或多板旋渦震蕩器上用0.1M DTT在1.0mL LaemmliSDS緩沖液pH6.8中提取45-60分鐘。將管子離心3-5分鐘。一部分上清液轉移到微量離心管中，用上述緩沖液稀釋，產生1.2-1.5μg/μL總蛋白質。將樣品煮沸3分鐘，冷卻，離心。將各樣品的15-20μg蛋白質加樣到預制的10-20％梯度Tris-HCl Criterion凝膠上。將凝膠在1X Tris-甘氨酸-SDS運行緩沖液中于180-200V下進行電泳，直到示蹤染料達到凝膠的底部(約1.2小時)。將凝膠在40％甲醇/10％乙酸中固定30-60分鐘，用膠體考馬斯藍G-250染色；最少要過夜，或者最長達3天。為除去背景，用去離子水使凝膠退色。用GS 800CalibratedDensitometer顯像密度計使凝膠顯影。用Bio-Rad Quantity OneSoftware軟件進行定量。該軟件用來確定樣品泳道中每個條帶的相對量。％大豆球蛋白亞單位和％β-伴大豆球蛋白亞單位報告為泳道中總蛋白質的相對百分比。
總氨基酸分析用三種方法來測定樣品，以獲得完整概況(fullprofile)。色氨酸需要用氫氧化鈉進行堿水解。含硫氨基酸在用鹽酸水解前需要用過甲酸進行氧化。用鹽酸進行直接酸水解，就可以完成樣品的其余氨基酸的分析。各氨基酸一旦水解出來，就用自動氨基酸分析儀進行定量(AOAC官方分析方法(Official Methods ofAnalysis of AOAC International)，2000)。
灰分將樣品放入550℃電爐中，使其燃燒除去所有的揮發性有機物質。剩余的非揮發性物質用重量分析法進行定量，計算確定灰分百分比。AOAC官方分析方法，(2000)。
碳水化合物總碳水化合物水平用鮮重得出的數據和以下方程式通過減差法計算％碳水化合物＝100％-(％蛋白質+％脂肪+％水分+％灰分)。美國農業部(1973)。
索氏抽提法脂肪將樣品稱重至含有砂子或硫酸鈉的纖維素套管中，干燥除去過量的水分。用戊烷浸透樣品，以提取出脂肪。然后將提取物蒸發，干燥和稱重。AOAC官方分析方法，(2000)。
水分將樣品在大約100℃真空爐中干燥至恒重。確定水分重量損失并換算成水分百分比。
蛋白質使樣品中的含氮化合物在沸騰的硫酸和汞催化劑混合物存在下還原形成氨。使酸消化物變成堿性。將氨蒸餾出來，然后用標準的酸滴定。計算出氮百分含量，用系數6.25換算成蛋白質含量。AOAC官方分析方法，(2000)。Bradstreet，(1965)。Kalthoff和Sandell(1948)。
結果由己醛、己醇、2，4-癸二烯醛和1-辛烯-3-醇的形成測出(表8)，從與含有低氣味產生性狀的大豆的雜交體選出的高β-伴大豆球蛋白大豆品系群體，顯示出變化很大的氣味產生特性。商品大豆的β-伴大豆球蛋白占總蛋白質的約22％，大豆球蛋白占約38％，與此相比，表8中的大豆其有大于30％的蛋白質為β-伴大豆球蛋白，有小于25％的蛋白質為大豆球蛋白。構建出了這樣的大豆，其有大于30％的總蛋白質為β-伴大豆球蛋白，在實施例1的氣味測定中產生小于20μg/g的總己醛加上己醇和2，4-癸二烯醛，且還包含低水平的游離天冬酰胺和游離精氨酸(表8)。例如本發明構建出20個β-伴大豆球蛋白品系，其產生小于20μg/g的總2，4-癸二烯醛加上己醛加上己醇，總游離精氨酸加上天冬酰胺在360-2,840μg/g磨碎大豆之間(表8)。這些品系的游離天冬酰胺在35-1,000μg/g磨碎大豆之間，游離精氨酸在500-2400μg/g磨碎大豆之間。
表8A和B在美國收獲的高β-伴大豆球蛋白大豆后代的特性。構建出了這樣的大豆，其有大于30％的總蛋白質為β-伴大豆球蛋白，有小于25％的蛋白質為大豆球蛋白，且在實施例1的氣味測定中每克大豆粉產生小于20μg/g的2，4-癸二烯醛加上己醛加上己醇。脂加氧酶測定對于鑒定低氣味產生品系沒有用。
表8A 表8B 各高β-伴大豆球蛋白大豆樣品的脂加氧酶活性差別很大。同一大豆粉pH7和pH9下的脂加氧酶活性與所產生的2，4-癸二烯醛加上己醛加上己醇的總量之間沒有關系(R2值＜0.02)。
進行了另一個實驗，以證明可選擇出有大于30％的β-伴大豆球蛋白和小于25％的大豆球蛋白的大豆，其顏色低，氨基酸組成在商品大豆的范圍內。選擇出了四種也含有Roundup Ready性狀的高β-伴大豆球蛋白大豆，其在三個地點的產量等于或高于商業標準品系的平均產量。平均約22的b*和平均約85的L*(表9)證明這些大豆具有低顏色性狀。氨基酸組成(表9)落入國際生命科學研究所農作物組成數據庫(International Life Sciences Institute Crop CompositionDatabase，1.0版本，2004年3月22日訪問)中公布的商品大豆范圍(表10)之內。將三種高β-伴大豆球蛋白大豆品系的平均氨基酸組成(表9)與ILSI數據庫中的平均大豆組成(表10)進行比較。高β-伴大豆球蛋白品系的四種氨基酸(精氨酸、賴氨酸、組氨酸和絲氨酸)與商品大豆的平均組成相差10-15％之間，但仍在商品大豆組成的范圍之內。
還期望將高β-伴大豆球蛋白大豆與低亞麻酸含量、中油酸含量的大豆進行雜交，以進一步改進其感官特性。低亞麻酸含量、中油酸含量的大豆是在Monsanto公司用傳統育種方法構建的，總脂肪酸中包含約2％的亞麻酸含量、約25％的亞油酸含量和約59％的油酸含量。
表92003年在三個地點栽培的大豆的組成、顏色和氣味性質。所有的大豆均具有Roundup Ready性狀和深色種臍。
表10三種高β-伴大豆球蛋白大豆的平均組成與國際生命科學研究所農作物組成數據庫(1.0版本)的平均大豆組成的比較。用以獲得數據的選擇標準作物類型大豆-甘氨酸max，組織類型種子，農事年全部，國家全部，州全部。縮寫FW＝大豆粉重量，DW＝干重。
實施例5 商品大豆與根據本發明選擇的大豆氣味和顏色性狀的比較 測定了商品大豆的氣味和顏色性狀，以與本發明大豆的氣味和顏色性狀進行比較。在氣味測定中，有一些大豆產生小于17.5μg/g的己醛加上己醇，有一些則產生小于11μg/g的2，4-癸二烯醛(表11)。但是，沒有商品大豆在溫和含水條件下氧化后每克磨碎種子產生小于20μg的總2，4-癸二烯醛加上己醛加上己醇。構建了本發明的四個含脂加氧酶品系，其在兩季中產生小于20μg/g的己醛+己醇+2，4-癸二烯醛(表4，5)。例如，2001年和2002年收獲的品系A-1分別產生8.0和18.2μg/g的己醛+己醇合計和2，4-癸二烯醛(表4，5)。本發明創建了20個以上的高β-伴大豆球蛋白品系，其產生小于20μg/g的總己醛+己醇和2，4-癸二烯醛(表8)。例如，一個高β-伴大豆球蛋白大豆產生9.7μg/g的己醛+己醇和3.2μg/g的2，4-癸二烯醛(表8)。
商品大豆顏色范圍很寬。例如b*值在27-34的范圍(表11)。發現本發明的大豆品系可將b*值延伸至22(表4，表9)。
表11A和B收獲的商品大豆的顏色和氣味產生特性 表11A氣味 實施例6 組合低氣味產生性狀與低亞麻酸組成性狀的能力的證明 本實施例證實有可能將低氣味產生性狀與低亞麻酸組成性狀組合，還進一步研究將大豆脫殼對氣味產生的影響。大豆脂肪酸中亞麻酸的百分比通常為約8％。用傳統的育種方法有可能構建出含有小于6％亞麻酸和具有低氣味產生特性的大豆(表12)。
在氣味測定中測量出，1-辛烯-3-醇的形成獨立于其它揮發性化合物的形成。一種假設是大豆表面上的真菌酶類是測定中1-辛烯-3-醇快速形成的來源。推論認為將大豆種子在研磨成粉之前先脫殼，應當會降低氣味測定中的真菌酶類的水平。通常是研磨完整大豆以產生用于氣味測定的大豆粉。故用六顆經小心脫殼的低氣味、低亞麻酸大豆品系種子進行再測定。從脫殼種子形成的1-辛烯-3-醇的量約為完整種子的一半，這證實了大豆皮殼中諸如真菌和真菌酶類的成分會促使1-辛烯-3-醇形成的這一假設(表13)。無脂加氧酶大豆常常產生更高水平的1-辛烯-3-醇(表3)。推論認為脂加氧酶在抑制霉菌的生長中可起到作用，因此在脂加氧酶不存在時，霉菌污染會更大，使得有更多的真菌酶類，從而1-辛烯-3-醇的形成更多。經本發明的篩選鑒定出的含脂加氧酶低氣味大豆，趨向于具有比較高氣味大豆更低的1-辛烯-3-醇范圍(例如表12)。
表12 A1-A4低亞麻酸大豆品系的顏色和氣味產生特性。顏色值為L*(光亮度)、a*(綠-紅)和b*(藍-黃)。
表13大豆在制成大豆粉之前先脫殼時，氣味測定中1-辛烯-3-醇的形成減少 實施例7 pH對氣味形成的影響 本發明提供的標準氣味測定涉及家大豆粉加入到水中，在約pH6.3下導致氣味形成。以下實驗的目的是確定在此條件下產生低水平氣味的品種，在其它pH條件下是否也能產生低水平的氣味。將商業對照大豆的氣味產生特性與低氣味產生品系(A-4)進行比較。品系A-4在pH3.0和pH5.5及pH7和pH9.2下產生更低水平的癸二烯醛和己醛(表14)。這些數據證明不用緩沖液進行的測定，可用作選擇可以在很寬pH條件范圍內產生低水平氣味的大豆的方法。己醛和2，4-癸二烯醛的最高濃度是在pH9下產生的，在該pH下1-辛烯-3-醇的產生量最少(表14)。
表14pH對商品對照大豆和低氣味產生大豆(圖4和5的A-4在2003年收獲)的氣味產生的影響。本測量所用的氣味測定和實施例1的相同，例外的是大豆粉加入到各pH(3.02、5.45、7.01和9.16)下的0.1M K2HPO4中。
實施例8 大豆蛋白質組成對豆漿沉淀物的影響 本實施例說明從具有改進蛋白質組成的本發明大豆制得的豆漿中所形成的沉淀物水平較低。含蛋白質的沉淀物對豆漿的感官質量具有負面影響，因為不希望在飲料中感覺到有顆粒。
豆漿制備.用Mega Grinder研磨對照低氣味大豆(A-4)和含有約39％β-伴大豆球蛋白和約13％大豆球蛋白的大豆，制成大豆粉。將每種大豆粉樣品加入到50mL一次性聚丙烯離心管中的36.75克水(4℃)中，加入量要使混合物中的蛋白質終濃度為3.3％重量，并在輸出功率控制設定值為8下超聲處理15秒。用Eppendorf Centrifuge5804R離心機在4℃、8,000rpm下將超聲處理過的樣品離心10分鐘。將上清液(豆漿)傾析到50mL一次性聚丙烯離心管中。每種豆漿取一部分(27.25克)轉移到另一個50mL一次性離心管中。上述樣品制備一式兩份，以解決以下蔗糖加入中出現的差異問題。將蔗糖(0.6987克)在熱處理之前或之后加入到27.25克豆漿中。
將50mL一次性聚丙烯離心管放入95℃硅油浴中5分鐘，對豆漿樣品進行熱處理，然后將樣品轉移到冰浴中冷卻，接著冷凍保存30天。隨著時間的推移，樣品中有沉淀物形成。如下定量所形成的沉淀物。將離心管來回傾側，使離心管底部的沉淀物分散。將豆漿樣品轉移到已稱重的離心管中，記錄最終重量。將離心管放入EppendorfCentrifuge5804 R離心機中，在25℃、8,000rpm下離心2分鐘。傾析出豆漿上清液，計算剩余的沉淀物的重量。沉淀物的量記錄為占豆漿重量的百分比(％沉淀物＝100x沉淀物重量/豆漿重量)。
結果.對照豆漿的沉淀物量至少是高β-伴大豆球蛋白豆漿的兩倍(表15)。
表15大豆蛋白質組成對豆漿沉淀物的影響.A-4是對照大豆。HBC是高β-伴大豆球蛋白、低大豆球蛋白大豆。
以上實例顯示，即使當大豆含有脂加氧酶1、2和3時，也制備出了氣味產生水平低的獨特組合物。還證明能夠選擇出具有改進的感官特性的大豆，其中根據以下對大豆進行選擇大豆中大豆球蛋白、游離精氨酸和天冬酰胺、黃色色素及多不飽和脂肪酸的量，以及磨碎大豆水懸浮液所產生的2，4-癸二烯醛、己醛、己醇和1-辛烯-3-醇氣味的量。公開的方法用于估計大豆在大豆成分和食品中產生2，4-癸二烯醛、己醛、己醇和1-辛烯-3-醇及其它更濃烈氣味的潛力。在這一大豆氣味估計方法中，將大豆粉以1∶4比例在水中溫育的價值在于獲得以下獨到觀察結果懸浮液中常溫下2，4-癸二烯醛快速形成，有可能培育出氣味產生水平非常低的含有脂加氧酶1、2和3的大豆。
在各實例中還證實，有可能產生出以下內生大豆組成，其具有大于30％的β-伴大豆球蛋白和小于25％的大豆球蛋白，具有正常或偏低的游離精氨酸和游離天冬酰胺。還進一步證明，可將低氣味和顏色特性與高β-伴大豆球蛋白組成特性組合，且還進一步設想了與低亞麻酸和中油酸大豆的組合。大豆球蛋白是大豆成分和食品中不溶性蛋白質的來源，會在飲料中產生沉淀物，造成令人不快的口感。游離精氨酸和天冬酰胺在加工過程中可產生氨，后者進一步與氣味化合物如2，4-癸二烯醛反應形成濃烈的氣味如2-戊基吡啶。亞油酸和亞麻酸是多不飽和脂肪酸，是氣味形成的底物；降低它們在大豆中的含量將有助于降低氣味的形成。大豆的色素會促成大豆制品的不良顏色，從而進一步影響到感官反應。統共地說，高β-伴大豆球蛋白、低游離精氨酸和天冬酰胺、低氣味和低顏色及低多不飽和脂肪酸大豆組合物，是本發明為產生感官上悅人的大豆蛋白成分和食品的最有價值組合物。還認識到，這些組合物不會缺乏大豆蛋白成分所伴有的健康特性，因為β-伴大豆球蛋白與大豆蛋白的膽固醇和甘油三酯降低特性有關(Duranti等，2004)，涉及對動脈粥樣硬化的抑制(Adams等，2004)。
實施例9 低氣味大豆組合物另外的沉淀分析 重復進行實施例8的研究，但作以下改變。加入了商品大豆對照(AG3302)。大豆在制粉前先脫殼，大豆粉在加入到水中前先過篩。將上清液(豆漿)轉移到預稱重的離心管中。將蔗糖在熱處理前加入，使最終蔗糖濃度為2.5％(w/w)。將樣品保存在冰箱中21天。測量離心管中豆漿沉淀物的高度，然后將樣品在8,000rpm下離心5分鐘。將上清液傾析出并稱重，測定上清液的pH(所有樣品均為pH＝6.7)，并對含有粒狀沉淀(pellet)的離心管進行稱重。計算出各樣品的濕大豆沉淀物的重量百分比(大豆沉淀物的重量％＝100x濕大豆沉淀物的重量/(濕大豆沉淀物的重量+大豆上清液的重量)。
用脫殼大豆發現了HBC和低氣味大豆在減少蛋白質沉淀物形成中的有益作用(表16)。HBC豆漿與低氣味大豆品系相比沉淀物減少2.2倍，與對照大豆相比沉淀物減少7倍。將低氣味大豆的沉淀物與對照相比，驚異地發現減少了3.1倍。有可能是低氣味性狀通過限制自由基形成和蛋白質氧化來減少沉淀物形成。因此這表明組合了高β-伴大豆球蛋白性狀和低氣味性狀的優化組合物的更多有益特性。
表16與對照大豆組合物相比，高β-伴大豆球蛋白性狀和低氣味性狀對豆漿沉淀物高度和沉淀物-粒狀沉淀重量的影響 實施例9 脫殼大豆粉和大豆分離蛋白成分的制備 將對照大豆(AG3302)以及大于30％總蛋白質為β-伴大豆球蛋白、小于25％總蛋白質為大豆球蛋白且含有小于2500微克/g游離精氨酸加上天冬酰胺的大豆(DJB2104GOR，EXP319AP)脫殼，制得脫殼大豆粉，然后按照以下步驟進一步加工制得大豆分離蛋白成分。
表17不同大豆品系中β-伴大豆球蛋白和大豆球蛋白的組成 1.將大豆調整至約10％水分，在室溫下調和(temper)。
2.用破碎機將大豆破碎。
3.用吸氣器使破碎大豆脫殼。
4.用蒸煮器將破碎和脫殼的大豆在50-60℃下軟化。
5.軋片機將軟化的大豆軋片。
6.用己烷提取大豆片。
7.將脫脂大豆粕除溶劑，得到大豆片。
8.將大豆片研磨，制成大豆粉。
9.將水加入到300升夾層罐中，用40％NaOH調至50℃和pH9.0。加入脫脂大豆粉并混合。水與大豆粉之比為12/1(w/w)。提取時間為45分鐘。
10.用自動清洗碟式離心機(反壓58-60psi)從提取漿液中回收溶解的大豆蛋白質。
11.加入鹽酸(18％)使澄清的蛋白質溶液調至pH4.5，讓其在45℃下反應30分鐘。
12.用自動清洗碟式離心機回收沉淀下來的蛋白質。
13.用酸化水(pH4.5+/-0.1，30-35℃)洗滌蛋白質凝塊兩次。洗滌水與壓實的濕固形物之比為6∶1(w/w)。每次洗滌后用自動清洗碟式離心機回收蛋白質凝塊(反壓58-60psi)。
14.將洗滌過的凝塊與氫氧化鈉(30％)混合，用30％NaOH將pH調至6.8，然后在116℃下熱處理7.5秒。然后將pH調至6.8。
15.將蛋白質溶液調至45-55℃，用204-215℃的入口空氣溫度和82-88℃的出口空氣溫度進行噴霧干燥。
16.測定大豆分離蛋白成分的氮溶解度指數。將一部分樣品攪拌懸浮在30℃水中2小時，然后用水將其稀釋至已知體積。將一部分樣品提取物離心，取等分試樣進行蛋白質分析。將另一部分樣品用同樣的方法分析總蛋白質。水溶性蛋白質計算為總蛋白質的百分比，與作為總氮百分比的水溶性氮成比例。
結果 大豆蛋白粉的氮溶解度指數(表18)與用以制備大豆蛋白質成分的大豆中β-伴大豆球蛋白的量成正比NSI＝1.4716(％β-伴大豆球蛋白)+7.4502；R平方＝0.9975。可溶性蛋白質水平的下降可改進用大豆蛋白質配制的食品的感官質量(例如更爽滑更清新的口感)。
表18氮溶解度指數 從各大豆制得的大豆分離蛋白成分其氨基酸組成相似，例外的是高β-伴大豆球蛋白(HBC)成分的賴氨酸含量比對照高約6％。
表19大豆分離蛋白成分的總氨基酸組成 實施例10 從脫殼大豆粉制備發酵大豆制品 從商品大豆(AG3302)、高β-伴大豆球蛋白大豆(DJB2104GOR)和低氣味產生大豆品系(03JBK8-25)(這些大豆品系都在2004年在美國收獲)制備脫殼大豆粉。
用于從大豆制備發酵制品的方法和檢測方法 1.用破碎機將大豆破碎。
2.用吸氣器將破碎大豆脫殼。
3.使大豆果肉(脫殼大豆)經過錘磨機1次和經過針磨機5次，進行碾磨。
4.將脫殼大豆粉用塑料袋包裝，放入纖維板桶中。
5.測定大豆粉的蛋白質含量。
6.將脫殼大豆粉(3℃)加入到水(3℃)中，使得蛋白質含量為3.5％(重量)，用手提式均質機混合約1-2分鐘. 7.將大豆粉懸浮液在板式換熱器中溫熱，然后注入蒸汽141℃下處理懸浮液3.5秒，接著脫氣，冷卻至約4℃。
8.將熱處理的懸浮液過濾除去纖維，得到豆漿。
9.向豆漿中加入乳風味成分、糖(3％)和鹽(0.2％)，用手提式均質機進行混合。
10.將調味的豆漿在板式換熱器中溫熱，然后注入蒸汽141℃下處理懸浮液3.5秒，接著脫氣，冷卻至約4℃，包裝在無菌容器中。
11.將各含有2.2％蛋白質的豆漿樣品稱重放入已滅菌的夸脫罐(quart jar)，在微波中溫熱45-60秒(約24℃)。
12.將糖(3.1％)、香草精(0.4％)和發酵大豆酸奶(L.Bulgaricus，S.Thermophilus，L.Acidophilus，B.Bifidum，L.Casei，L.Rhamnosus)(8％)加入到豆漿中，將樣品混合。
13.將含有的豆漿培養物放入43℃培養箱中溫育4小時，然后取出來冷凍過夜(4℃)。
14.對冷凍樣品進行pH和粘度測量，并由不知樣品配方的3人品嘗小組進行感官評定。粘度用帶Spindle#3的布氏粘度計在20rpm下進行測量。
結果從DJB2104GOR制得的發酵制品其風味概況(flavor profile)悅人，應該適合于制造水果風味的冰沙(smoothie)。從03JBK8-25制得的制品其風味概況悅人，應該很好地適合于制造酸奶油或浸漬制品(dip product)。推論認為，高β-伴大豆球蛋白性狀和低氣味產生性狀的組合應該還能產生出悅人的發酵豆漿制品。高β-伴大豆球蛋白蛋白質物料的較低粘度可有助于在相同厚度水平下產生出蛋白質更高的制品。
表20大豆組成和氣味特性 表21發酵制品的風味概況 實施例11 低氣味和高β-伴大豆球蛋白的組合的證明 本實施例說明低氣味產生特性與高β-伴大豆球蛋白組成的組合。它證明能夠產生出大豆球蛋白含量降低和β-伴大豆球蛋白含量增加的低氣味大豆組合物。將雜交類型如A和E(表3)與具有A3233/B2G2/A1923譜系的高β-伴大豆球蛋白種質組合。
如下進行蛋白質分析集中八顆大豆種子，用CAT Mega-Grinder(SOP Asci-01-0002)研磨。磨碎的樣品在4℃下保存。為進行分析，將各樣品的～30mg的粉稱重至96孔2ml微量滴定板的一個孔中。將蛋白質在含有0.1M二硫蘇糖醇(DTT)作為還原劑的1.0mL LaemmliSDS緩沖液pH6.8中振搖下提取1小時。離心后，各提取物取一部分在SDS緩沖液中進一步稀釋，以產生0.2-0.5μg/μL總蛋白質，然后加熱至90-100℃保持1分鐘，接著冷卻。對于各樣品，用12通道移液器將1-2μg總蛋白質加樣到26泳道15％T梯度Tris/HCl Criterion凝膠上。各凝膠中有兩個泳道加入分子量標準和親本對照。將凝膠進行電泳，直到示蹤染料達到凝膠的底部(～1.2小時)，然后在膠體考馬斯藍G-250中染色過夜，在去離子水中退色，用GS 800CalibratedDensitometer顯像密度計顯影。用Bio-Rad Quantity OneTM Software軟件進行定量。該軟件用來確定樣品泳道中每個條帶的相對量。％大豆球蛋白亞單位條帶和％β-伴大豆球蛋白亞單位條帶報告為泳道中總蛋白質的相對百分比。a5-大豆球蛋白亞單位沒有定量，不包括在總酸性大豆球蛋白值中。樣品身份和重量用Master LIMSTM追蹤。
將具有高β-伴大豆球蛋白性狀的低氣味產生大豆與一些不具有低氣味性狀的品系對比來進行說明(表22)。表中的第一品系進行了重復氣味分析。表中顯示有幾個品系缺乏大豆球蛋白，產生的組合物在溫和含水條件下氧化后每克磨碎種子有小于20μg/g的總2，4-癸二烯醛加上己醛加上己醛。還對所產生的組合物的其它特性(例如產量、游離氨基酸顏色和脂肪酸組成)進行進一步的評估。
表22高β-伴大豆球蛋白大豆組合物氣味產生特性和蛋白質亞單位組成。
Gly＝酸性大豆球蛋白.ND＝未檢測出 保藏信息 已經按照布達佩斯條約，將在上文中公開和在權利要求書中描述的Monsanto Technology LLC大豆0119149種子保藏在美國典型培養物保藏中心(ATCC，10801 University Boulevard，Manassas，Va.20110)。在本文中用于各工作實施例和表格中的保藏品系0119149還標識為“A-4”和“03JBK8-25”。該保藏物的ATCC檢索號為PTA-6197，保藏日期為2004年9月10日。保藏物將在保藏機構中保持30年的時間，或者在最后一次索求之后保持5年的時間，或者保持到本發明有效期結束為止，視哪個時間更長而定，而且在保持時間內按需進行替換。
根據本公開，不用進行太多的實驗就可制備和執行本文公開和要求保護的所有組合物和方法。雖然已通過優選實施方案描述了本發明的組合物和方法，但對本領域技術人員顯而易見的是，可對本文描述的組合物和方法及方法的步驟和步驟順序作出改變而不偏離本發明的概念、精神和范圍。更具體的說，可以顯而易見的是，可用某些在化學上和生理上都相關的物質替換本文描述的物質，而又獲得相同或類似的結果。對本領域技術人員來說顯而易見的所有這些類似替換物或修改，都認為落入所附權利要求書所定義的本發明精神、范圍和概念之內。
參考文獻
以下參考文獻在提供示例性程序或其它方面的細節以補充本文所述內容的程度上，通過引用明確結合到本文中。
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權利要求
1.一種從包含脂加氧酶1、2和3的大豆生產的大豆果肉組合物，所述組合物按總脂肪酸的百分比包含大于10％的亞油酸，在溫和含水條件下氧化后每克包含小于20μg的總2，4-癸二烯醛加上己醛加上己醇。
2.權利要求1的組合物，所述組合物按總脂肪酸的百分比包含小于4％的亞麻酸。
3.權利要求1的組合物，所述組合物包含小于2000μg/克的游離精氨酸和小于400μg/克的游離天冬酰胺。
4.權利要求1的組合物，所述組合物的顏色按其中L*表示光亮度和b*表示藍(-)-黃(+)色軸上色調的CIE-L*a*b*系統進行監測，測出為b*值小于30和L*值大于80。
5.權利要求1的組合物，所述組合物在溫和含水條件下氧化后每克包含小于4μg的1-辛烯-3-醇含量。
6.權利要求1的組合物，所述組合物有大于30％的蛋白質為β-伴大豆球蛋白。
7.權利要求1的組合物，所述組合物有小于25％的蛋白質為大豆球蛋白。
8.權利要求1的組合物，所述組合物的亞油酸濃度占總脂肪酸的10％-60％之間。
9.一種大豆果肉組合物，所述組合物有大于30％的蛋白質為β-伴大豆球蛋白，有小于25％的蛋白質為大豆球蛋白，包含小于5,000μg/克的游離精氨酸和小于900μg/克的游離天冬酰胺。
10.權利要求9的組合物，所述組合物包含小于2,000μg/克的游離精氨酸和小于400μg/克的游離天冬酰胺。
11.權利要求9的組合物，所述組合物在溫和含水條件下氧化后包含小于4μg/克的1-辛烯-3-醇含量。
12.權利要求9的組合物，所述組合物在溫和含水條件下氧化后包含小于20μg/克的總2，4-癸二烯醛加上己醛加上己醇。
13.權利要求9的組合物，所述組合物的亞麻酸濃度占總脂肪酸的1.5％-14％之間。
14.權利要求9的組合物，所述組合物的亞油酸濃度占總脂肪酸的10％-60％之間。
15.權利要求9的組合物，所述組合物定義為缺乏脂加氧酶-2。
16.權利要求9的組合物，所述組合物定義為缺乏脂加氧酶。
17.權利要求9的組合物，所述組合物的顏色特征為，按其中L*表示光亮度和b*表示藍(-)-黃(+)色軸上色調的CIE-L*a*b*系統進行監測，b*值小于30和L*值大于80。
18.權利要求9的組合物，所述組合物包含67-69mg賴氨酸/克蛋白質。
19.權利要求9的組合物，所述組合物包含72-80mg精氨酸/克蛋白質。
20.權利要求9的組合物，所述組合物包含28-30mg組氨酸/克蛋白質。
21.一種大豆果肉組合物，所述組合物有大于30％的蛋白質為β-伴大豆球蛋白，有小于25％的蛋白質為大豆球蛋白，在溫和含水條件下氧化后每克包含小于20μg的總2，4-癸二烯醛加上己醛加上己醇。
22.權利要求21的組合物，所述組合物定義為缺乏脂加氧酶-2。
23.權利要求21的組合物，所述組合物的亞麻酸濃度占總脂肪酸的1.5％-14％之間。
24.權利要求21的組合物，所述組合物的亞油酸濃度占總脂肪酸的10％-60％之間。
25.權利要求21的組合物，所述組合物定義為缺乏脂加氧酶-2。
26.權利要求21的組合物，所述組合物的顏色特征為，按其中L*表示光亮度和b*表示藍(-)-黃(+)色軸上色調的CIE-L*a*b*系統進行監測，b*值小于30和L*值大于80。
27.一種分析大豆的氣味產生特性的方法，所述方法包括測定至少一種選自2，4-癸二烯醛、己醇、己醛和1-辛烯-3-醇的化合物的水平。
28.權利要求27的方法，其中所述測定化合物的水平包括將約1份大豆種子粉和約4份水的混合物溫育約1至約40分鐘的時間，和用己醛、己醇和癸二烯醛的氘化標準品定量至少一種選自2，4-癸二烯醛、己醇、己醛和1-辛烯-3-醇及其組合的化合物的量。
29.權利要求28的方法，其中所述大豆種子粉從脫殼大豆制得。
30.一種獲得大豆品種的方法，所述大豆品種用以生產氣味產生特性下降的大豆，所述方法包括測量來自第一和第二大豆品種的一顆或多顆大豆中至少一種選自2，4-癸二烯醛、己醇、己醛和1-辛烯-3-醇及其任何組合的化合物的水平，和選擇生產出較低所述化合物水平的種子的品種。
31.權利要求30的方法，所述方法進一步包括使選定品種的植株與另一植株雜交產生后代，和測量來自所述后代的一顆或多顆大豆中至少一種選自2，4-癸二烯醛、己醇、己醛和1-辛烯-3-醇及其任何組合的化合物的水平。
32.一種選擇抵抗真菌感染的大豆品種的方法，所述方法包括選出包含小于5μg 1-辛烯-3-醇/克種子的品種，所述含量通過將約1份大豆種子粉和約4份水的混合物溫育約1至約40分鐘的時間并測量1-辛烯-3-醇而測出。
33.標號0119149的大豆植株的種子，所述植株的代表性種子已保藏于ATCC，檢索號為PTA-6197。
34.大豆植株0119149或部分，所述植株通過栽培權利要求33的種子而生產。
35.權利要求34的大豆植株，所述植株進一步定義為包含轉基因。
36.一種產生衍生自大豆植株0119149的大豆植株的方法，所述方法包括以下步驟
(a)通過使大豆植株0119149的植株與另一大豆植株雜交，制備衍生自大豆植株0119149的后代植株，其中大豆植株0119149的種子樣本已保藏于ATCC，檢索號為PTA-6197；
(b)使所述后代植株自身雜交或與第二植株雜交，以產生下一代后代植株的種子；
(c)從所述種子生長出下一代后代植株，并使所述下一代后代植株自身雜交或與第二植株雜交；和
(d)再重復步驟(b)和(c)3-10代，產生衍生自大豆植株0119149的近交大豆植株。
全文摘要
本發明提供感官特性改進的大豆果肉組合物和用以鑒定感官質量改進的大豆的方法。本發明還提供用以產生感官特性改進的大豆組合物的方法和構建產生具有這種特性的大豆的植株的方法。
文檔編號A01H5/10GK101123887SQ200580029898
公開日2008年2月13日 申請日期2005年7月8日 優先權日2004年7月9日
發明者N·A·布林奇, R·G·奧爾思 申請人:孟山都技術有限公司