專利名稱：一種測定腸上皮緊密連接完整性的方法及其應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種測定腸上皮緊密連接完整性的方法，本發明還涉及該方法在腸屏障功能障礙的動物實驗研究中的應用。
背景技術：
生物體中，各種上皮細胞通過細胞之間的連接，形成了保護組織的上皮屏障，包括腸上皮屏障、呼吸道上皮屏障等。相鄰上皮細胞之間的連接方式有很多種，其中緊密連接是最重要的連接方式之一。它可以調控水、可溶性物質的細胞旁轉運，阻止一些毒性大分子和微生物的通過。這種通透性調節在維持上皮屏障方面起著重要作用(見圖1)。最近的研究發現，腸屏障功能障礙總是伴隨著腸上皮細胞緊密連接完整性的改變。如在克隆氏病和潰瘍性結腸炎中，發現病變腸段的緊密連接受到明顯破壞，這種緊密連接完整性的改變被認為是腸屏障功能障礙的一個重要特征。因此，腸上皮緊密連接完整性的測定對于腸屏障功能的監測有重要意義。
目前，腸上皮緊密連接完整性的測定主要通過大分子物質通透性試驗進行。緊密連接調控這些大分子物質(乳果糖、纖維雙糖、EDTA和葡聚糖等)的細胞旁轉運，大分子物質通透性的改變可以間接反映緊密連接的完整性。但這種方法也存在缺陷，包括通透性易受血流量、腎功能等因素的影響，個體差異大。從解剖結構上看，不同節段腸上皮緊密連接的完整性是不同的，正常小腸上皮細胞間緊密連接比結腸寬松，而大分子物質通透性試驗不能反映不同腸段緊密連接的完整性。
體外培養細胞實驗中，上皮電阻抗(TEER)是反映單層細胞緊密連接完整性的一個重要指標。根據生物電阻抗原理，緊密連接完整性的改變會引起上皮電阻抗的改變。TEER可以通過上皮細胞電位儀(EVOM)進行測定。EVOM產生低頻電流作用到單層細胞，利用歐姆定律直接測出電阻值。目前，關于利用細胞電位儀(EVOM)測定腸上皮緊密連接完整性的研究，未見報道。
發明內容
本發明的目的是提供一種簡單、準確、靈敏、有效的測定腸上皮緊密連接完整性的方法。本發明另一個目的是提供該方法在腸屏障功能障礙動物實驗中的應用。
本發明技術方案是根據低頻率(＜50Hz)下測定的腸上皮電阻抗反映腸上皮細胞間緊密連接完整性的原理。生物組織中，細胞外液的電子感應度比細胞內液大地多，低頻率電流無法透過細胞膜進入細胞內液，因此低頻率下測定的電阻抗是上皮細胞之間的電阻抗。緊密連接是細胞之間的重要結構，緊密連接的完整性決定了細胞之間電阻抗值的高低。本發明技術利用該電生理特征進行腸上皮電阻抗的測定，從而可以反映腸上皮緊密連接的完整性。
腸上皮細胞緊密連接是腸上皮屏障的重要組成部分，大量研究證明腸上皮屏障功能的破壞總是伴隨著緊密連接完整性的改變。因此，腸上皮電阻抗的降低可以反映腸屏障功能的破壞。
本發明的目的是通過下列技術措施實現的一種測定腸上皮緊密連接完整性的方法，該方法是通過體外測定動物腸段的腸上皮電阻抗，根據腸上皮電阻抗值的降低反映腸段的腸上皮緊密連接的破壞。
所述的測定腸上皮緊密連接完整性的方法，其中腸上皮電阻抗的測定方法是將細胞培養實驗中所用的細胞小室去除聚乙烯膜，改為三腳中空的測試杯，然后將待測定部位的腸組織體外固定在測試杯上用于電阻抗測定。
所述的測定腸上皮緊密連接完整性的方法，其中腸上皮電阻抗的測定方法中腸標本采用3-0絲線沿杯口套扎固定。
所述的測定腸上皮緊密連接完整性的方法，其中腸上皮組織電阻抗的測定方法中采用EVOM單值電流探頭和STX2電極測定腸上皮電阻抗。
上述的腸上皮緊密連接完整性的測定方法在腸屏障功能障礙動物實驗中的應用。
以下結合圖2對本發明作詳細的描述1、腸標本的獲取和固定。首先將細胞培養實驗中的細胞小室的聚乙烯膜去除，改為三腳中空的測試杯。將測試腸段(約1cm長)在充滿95％O2/5％CO2的KRB緩沖液(Krebs-Ringer bicarbonate buffer)中沿系膜緣剪開，小心浸洗去除腸內容物，暴露腸粘膜面，保持組織平展，粘膜面向外固定在測試杯杯口上，然后將測試杯倒置于培養池中。腸組織將培養池分為上室和下室，分別加入200μl和1ml的37℃充滿95％O2/5％CO2的KRB緩沖液。
本發明所用的測試杯杯口直徑為6.5mm，面積為0.33cm2。腸標本固定采用3-0絲線沿杯口套扎固定。培養池采用Transwell24孔培養板。
2、EVOM測定腸組織電阻抗。采用EVOM單值電流探頭和STX2電極。測試前，將STX2電極用70％酒精浸泡，再用消毒的PBS沖洗。將STX2長電極插入下室，短電極插入上室，腸組織位于兩個電極之間，保持位置恒定。測定三次取平均值。測得的電阻抗計算公式TEER＝(Rtotal-Rblank)×A(Ω·cm2)公式中Rtotal為實測電阻值，Rblank為未固定腸組織的空白的電阻值，A為腸上皮面積。
3、該測定方法在腸屏障功能障礙實驗中的應用。通過建立腸缺血缺氧、缺血再灌注損傷、炎性腸病、腸道細菌易位等動物模型，測定腸屏障功能損傷時腸上皮電阻抗的變化，結合電鏡觀察緊密連接結構，從而反映緊密連接完整性的改變。
本發明的有益效果本發明將EVOM用于腸上皮電阻抗的測量。這是簡單方便的，非破壞性的，可靠的檢測方法。本發明采用EVOM單值電流探頭和STX2電極，產生低頻交流電流作用到腸上皮組織，對組織不會造成損傷，電阻抗值在緊密連接受損時變化靈敏準確，可以真實反映不同部位腸段緊密連接的完整性。本發明從動物的少量腸組織標本中能夠有效檢測出數據，僅需幾分鐘，所用樣本量小，實驗操作簡單方便，不受血流量和機體代謝的影響。
緊密連接完整性的重要性在腸缺血缺氧、缺血再灌注、炎性腸病、創傷應激、腸道細菌異位等腸屏障功能障礙的研究中得到證實，已成為當今腸屏障功能研究中的熱點。本發明方法通過測定腸上皮電阻抗，為緊密連接完整性的檢測提供了新的方法和指標，可用于腸屏障功能障礙的動物實驗研究。
圖1是腸上皮緊密連接示意圖。
圖2是EVOM測定腸上皮電阻抗示意圖。
圖3是腸組織標本固定的實物圖。
圖4是EVOM測定腸組織電阻抗的實物圖。
具體實施例方式
以下通過實施例對本發明作進一步的闡述，但不限制本發明。
以下實施例所用的實驗材料為250-300g雄性SD大鼠，KRB緩沖液(NaCl 119mM，KCl 4.74mM，CaCl22.54mM，MgCl21.19mM，Na2HPO41.19mM，NaHCO325mM，HEPES 10mM，Glucose 5.5mM，PH7.4)，單層細胞小室(Transwell Insert，Corning，USA)，24孔細胞培養板(Transwell，Corning，NY，USA)，EVOM細胞電位儀(WPI，Aston，England)，STX2電極(WPI，Florida，USA)，動物手術器械，3-0絲線，氯胺酮。
實施例1測定正常大鼠不同部位腸上皮電阻抗值1、將SD大鼠肌注鹽酸氯胺酮(100mg/kg)麻醉，劍突下腹部中線切口開腹，迅速取近端空腸(距屈氏韌帶2cm)、末端回腸(距盲腸2cm處)、橫結腸各1cm，保存在4℃充滿95％O2/5％CO2的KRB緩沖液中，20分鐘內送至實驗室。
2、將單層細胞小室的聚乙烯膜去除，改造為三腳中空的測試杯。在充滿95％O2/5％CO2的KRB緩沖液中將測試腸段沿系膜緣剪開，小心浸洗去除腸內容物，暴露腸粘膜面，粘膜面向外平展在測試杯杯口上，3-0絲線沿杯口套扎固定，剪去多余腸組織，然后將測試杯置于37℃充滿95％O2/5％CO2的KRB緩沖液中保持組織活性。(見圖3)3、將固定好的測試杯杯口向下倒置于培養池中，測試杯杯腳懸掛在培養池外壁，腸組織將培養池分為上室和下室，分別加入200μl和1ml的37℃充滿95％O2/5％CO2的KRB緩沖液。
4、測試前，將STX2電極用70％酒精浸泡，再用消毒的PBS沖洗。將EVOM細胞電位儀打開，測試檔調在R，量程調至2000Ω，調零后將STX2長電極插入下室，短電極插入上室，腸組織位于兩個電極之間，保持位置恒定。測定三次取平均值，得到腸上皮電阻抗。(見圖4)測得的電阻抗計算公式TEER＝(Rtotal-Rblank)×A(Ω.cm2)公式中Rtotal為實測電阻值，Rblank為未固定腸組織的空白的電阻值，A為腸上皮面積。
本實驗中，空白對照電阻抗為100Ω，腸上皮面積為0.33cm2。
5、根據結果(見表1)可以得出正常大鼠不同節段腸上皮的電阻抗，符合文獻報道的正常小腸上皮細胞間緊密連接比結腸緊密連接寬松的解剖特點。
表1 正常SD大鼠不同部位腸上皮電阻抗測定結果
實施例2測定腸缺血再灌注損傷后大鼠腸上皮電阻抗的變化1、選用250-300g雄性SD大鼠，隨機分為四組(每組10只)對照組，缺血再灌注損傷1小時、2小時、4小時組。
2、將試驗組大鼠肌注鹽酸氯胺酮(100mg/kg)麻醉，劍突下腹部中線切口開腹，分離腸系膜上動脈，用無創微血管夾將其夾閉使腸缺血。缺血60分鐘再次麻醉(肌注50mg/kg鹽酸氯胺酮)松開微血管夾，分別于松開血管夾后1小時，2小時，4小時取測試腸段。對照組行假手術。
3、從大鼠體內迅速取近端空腸(距屈氏韌帶2cm)、末端回腸(距盲腸2cm處)、橫結腸各1cm。按實施例1所述方法測定各組大鼠不同部位腸上皮電阻抗值。對所測得的電阻抗值采用單因素ANOVA統計分析，P＜0.05認為有顯著差異，P＜0.01認為有極顯著差異。
4、另分別于近端空腸、末端回腸、橫結腸各取1cm腸段戊二醛固定，透射電鏡觀察緊密連接結構改變。
5、根據結果(見表2)可以發現大鼠腸上皮電阻抗值隨缺血時間延長而降低，回、結腸電阻抗值變化較空腸更為明顯。腸上皮電阻抗的改變和電鏡下緊密連接結構的破壞程度相符。該實驗證實了腸上皮電阻抗隨著緊密連接完整性的破壞而降低，且不同部位腸上皮緊密連接破壞程度不同。
表2 缺血再灌注損傷大鼠腸上皮電阻抗測定結果
*P＜0.05，**P＜0.0權利要求
1.一種測定腸上皮緊密連接完整性的方法，其特征在于通過體外測定動物腸段的腸上皮電阻抗，根據腸上皮電阻抗值的降低反映腸段的腸上皮緊密連接的破壞。
2.根據權利要求1所述的測定腸上皮緊密連接完整性的方法，其特征在于腸上皮電阻抗的測定方法是將細胞培養實驗中所用的細胞小室去除聚乙烯膜，改為三腳中空的測試杯，然后將待測定部位的腸組織體外固定在測試杯上用于電阻抗測定。
3.根據權利要求2所述的測定腸上皮緊密連接完整性的方法，其特征在于腸上皮電阻抗的測定方法中腸標本采用3-0絲線沿杯口套扎固定。
4.根據權利要求1所述的測定腸上皮緊密連接完整性的方法，其特征在于腸上皮組織電阻抗的測定方法中采用EVOM單值電流探頭和STX2電極測定腸上皮電阻抗。
5.權利要求1所述的腸上皮緊密連接完整性的測定方法在腸屏障功能障礙動物實驗中的應用。
全文摘要
本發明公開了一種測定腸上皮緊密連接完整性的方法及其應用。該方法通過體外測定動物腸段的腸上皮電阻抗，根據腸上皮電阻抗值的降低反映腸段的腸上皮緊密連接的破壞。該方法操作簡單方便，所用樣本量小，不受血流量和機體代謝的影響，可有效反映不同節段腸上皮緊密連接的完整性。該方法可用于腸屏障功能障礙的動物實驗研究。
文檔編號A61D99/00GK1883385SQ20061004079
公開日2006年12月27日 申請日期2006年6月9日 優先權日2006年6月9日
發明者李寧, 王萌, 李秋榮, 黎介壽 申請人:中國人民解放軍南京軍區南京總醫院