一種金龜子高毒力Bt新菌株、新基因篩選和生物測定方法

專利名稱：：一種金龜子高毒力Bt新菌株、新基因篩選和生物測定方法
技術領域：
：本發明涉及生物領域，具體的說，涉及一種金龜子高毒力Bt新菌株、新基因篩選和生物測定方法。
背景技術：
：金龜子屬鞘翅目，金龜總科(Scarabaeoidea),其幼蟲(俗稱蠐螬)是一類重要的世界性難防治地下害蟲，分布廣泛，為害糧食、棉花、油料、蔬菜、糖料、煙草、牧草、花丼、草坪、果樹等多種植物。據20年來的大量調查，其危害已居各類地下害蟲之首，占地下害蟲總蟲量的80%以上。據統計每年全國鱭螬發生面積在1億畝以上，產量損失約20%。1976、1977年，全國每年蠐螬發生面積達3.2億畝，產量損失40%,有些地塊甚至絕產，已成為生產上迫切解決的問題。為控制蠐螬的發生為害，我國植保科技工作者早在上世紀80年代以前進行了大量的研究工作，提出了運用農業、化學、物理等措施的綜合防治策略，取得了一定的成效。隨著種植結構和生態系的變化，地下害蟲矯螬呈逐年猖獗趨勢。目前我國金龜科地下害蟲的防治現狀依然嚴峻，生產上仍在使用高毒、高殘留的"3911"、"1605"、"呋喃丹"等化學農藥。由此引起的環境污染、殘留增高、抗藥性增強等一系列社會問題，已對我國土壤和水資源造成了極為嚴重的污染，嚴重影響著我國無公害、安全食品的生產，生產上急需研究金龜子有效的防治技術。蘇云金桿菌(Bfl"7Zwsf/mnVjg/e"s"，簡稱Bt)是世界上研究最深入、應用最廣泛的殺蟲微生物。由于Bt菌株殺蟲蛋白基因的多樣性和特異性，決定了殺蟲毒蛋白(InsecticidalCrystalProteins,簡稱ICPs)的殺蟲譜及活性不同，就為篩選對不同種類金龜子幼蟲具有特異殺蟲活性的新菌株提供了廣闊空間。1998年本課題組在我國首次篩選獲得一株對麗金龜科幼蟲高毒力的Bt新菌株HBF-l,并對其生物學特性進行了較深入研究，確定了其基因型為co;SC"。該菌株對麗金龜科幼蟲具有高毒力，但對鰓金龜科幼蟲的毒力較差。由于我國華北地區鱭螬以麗金龜科和鰓金龜科幼蟲混雜發生為主，這就需要篩選對不同種類金龜子具有特異活性的Bt菌株，才能達到控制危害的目的。因此，利用Bt殺蟲蛋白基因的多樣性來篩選對金龜科幼蟲高毒力的Bt菌株，不但可為我國持續有效的控制蠐螬的發生危害提供有效的生防菌株資源，而且也將為構建廣譜高效的殺蟲工程菌和轉基因植物提供基因資源。為此本項發明依據金龜子防治和人工飼養中存在的問題，通過對飼養器具、飼養條件、飼養食料等方面的研究，確立了不同金龜子的人工飼養方法，達到了滿足提供對金龜子高毒力Bt菌株篩選的生測用蟲的要求。同時通過對金龜子生物測定的條件、器具、餌料等的優選，建立了完善的對金龜子高毒力Bt新菌株、新基因篩選和生物測定方法。
發明內容本發明的目的在于提供一種金龜子高毒力Bt新菌株、新基因篩選和生物測定方法。為了實現本發明的目的，本發明提供了一種金龜子成蟲的飼料，由下列原料組成干榆葉粉或干花生葉粉20g、瓊脂粉3g、玉米淀粉2g、蔗糖3g、大豆粉10g、酵母粉10g、山梨酸0.5g、VclO片、復合Vb5片、等重量的NaCL和KCL組成的鹽0.5g和水300mL。Vc片每片0.1克，復合Vb每片0.1克。本發明還提供了一種金龜子的人工飼養方法，包括如下步驟1)將金龜子成蟲按雌雄數目1:1比例置于溫度24-27。C,相對濕度50~70%，光照L13:Dll，2000~4000LX的養蟲室中，養蟲籠中土壤相對濕度18~20%，放入金龜子成蟲的人工飼料或天然飼料飼養產卵，天然飼料每日下午更換一次，人工飼料每2天更換一次，每隔23天挑取卵l次，其中，所述天然飼料為鮮榆葉；2)將挑出的卵過40目篩，篩除多余的土，浸入0.2%的次氯酸鈉水溶液中5分鐘，然后用清水沖洗45次至無味，吸去多余水分；3)將土壤在日光下暴曬2天消毒，過20目篩后加水，使含水量為18~20%,接入步驟2)中處理后的卵，在25。C條件下孵化，也可在10~15"C條件下保存30~40d;4)在直徑20cm的養蟲盒中放入5cm的濕土(陽光下消毒2天，含水量18-20%),再放入發芽的玉米和馬鈴薯塊(暗黑金龜幼蟲放入發芽的花生)，供幼蟲取食，將每日挑出初孵幼蟲接入飼養盒中，每盒接入初孵幼蟲100頭，再覆蓋35cm的濕土，置于2527。C條件下飼養1020天，作為生物測定的供試蟲源；另外，按上述方法在250ml的塑料盒中接入初孵幼蟲5頭進行飼養，每2030天更換一次新土和食料，當幼蟲生長到2齡未3齡初時，按上述方法分單頭詞養，以免幼蟲之間相互殘殺，作為室內常年詞養蟲種；5)伺養至3齡后期時，幼蟲停止取食，體色變黃有皺紋，做蛹室準備化蛹，將已停食的幼蟲單獨飼養，這時可不加食料，并減少換土次數和過多的翻動，以免破壞蛹室影響化蛹，但應每5天打開盒蓋觀察有無成蟲鉆出的痕跡，一旦發現成蟲羽化，及時將羽化的成蟲辨別雌雄后挑入成蟲飼養籠。本發明提供了一種蘇云金桿菌對金龜子幼蟲的高毒力新基因源的篩選方法，包括如下步驟生測餌料①馬鈴薯細絲，選新鮮馬鈴薯塊切成細絲(2mt^粗細)，用水沖洗2遍后，控去多余水分；②發芽玉米根，將玉米在水中浸泡12小時，然后撒入濕土中讓其生根發芽，待根長至3cm時挖出，用水沖去泥土備用；③發芽花生，將花生在水中浸泡12小時，然后在保濕的條件下12小時讓其發芽備用(用于暗黑金龜子測定)；稱取馬鈴薯絲40g(或玉米根邊同玉米20粒、發芽花生20粒)，加入到40mL—定濃度為2xl()7孢于/ml的菌懸液中攪拌混合均勻，連同菌懸液倒入200g土中，放置2h,使土壤含水量為20%。先將生測鉺料均勻分裝于20個養蟲管中，再加入拌勻的菌土，按照優選的生測條件，即釆用15日齡銅綠麗金龜幼蟲、5日齡暗黑鰓金龜幼蟲、3曰齡華北大黑鰓金龜幼蟲，每管接幼蟲i頭，每一處理20頭幼蟲，重復3次，在3(TC、RH6(T/。的人工氣候箱中感染飼養，使用的土壤為紫外線照射處理5h的壤土；調查記載方法分別于處理后7、14天調查幼蟲的的死亡數量，計算幼蟲死亡率。本發明提供了一種轉cry基因植物對金龜幼蟲抗性檢測方法，包括如下步驟幼蟲存活率鑒定法在直徑15cm高15cm的花盆中種植轉基因煙草或草坪草，種植約15天后，使之完全存活，選擇生長一致的植株進行接蟲試驗，每一花盆接初孵金龜子幼蟲5頭，接蟲后注意保持土壤的濕度，每一處理5盆，重復3次，以不轉基因植株作為對照。接蟲后15天調查幼蟲的存活數量，計算各處理的幼蟲死亡率，明確不同植株的抗蟲效果;地下部分危害程度與抗蟲性鑒定方法以煙草為鑒定對象，釆用分別種植pSmCN和pBI植株以及混合種植pSmCN、pBI、pTmCN、pTGN和對照山西煙的種植方法，每個處理12株，將轉基因煙草各處理12株分別種植在48x33x13cm的塑料盒子中，土壤深度12cm,每棵煙苗接20日齡的黃褐麗幼蟲5頭或15曰齡的銅綠麗金龜幼蟲5頭，在接蟲15天后，按照分級標準，對各種煙草植株進行統一分級，并計算危害率和危害指數；地上部分危害程度與抗蟲性鑒定方法以草評草為鑒定對象，在48x33x15cm的塑料盒子中加土12cm，隨機種植生長一致的轉基因植株8株和對照植株4株，待植株生長15天后，使植株很好地存活，每穴草坪接20日齡的黃褐麗幼蟲5頭或15日齡的銅綠麗金龜幼蟲5頭，重復4次，在接蟲15天后，按照分級標準，對各種植株進行統一分級，并計算危害率和危害指數。本發明主要涉及對地下害蟲高毒力蘇金芽胞桿菌新基因的篩選，通過對不同種類金龜子的飼養，為新菌株的篩選提供生測蟲源，建立一套適于蘇云金芽胞桿菌新菌株的篩選方法，該方法的建立將針對不同種類的金龜子篩選出具有特異活性蘇云金芽胞桿菌菌株資源，為研制地下害蟲金龜子生物農藥提供了科學依據。依據該方法將擴展蘇云金芽胞桿菌的基因資源，同時確立了轉Bt基因抗蟲作物對金龜子幼蟲的抗性鑒定方法，為進一步進行轉Bt基因抗蟲植物的培育奠定基礎。達到可持續控制地下害蟲金龜子危害的目的，具有廣闊的應用前景。圖l華北大黑鰓金龜成蟲，成蟲在田間交配。圖2金龜子所產的卵和初孵的幼蟲。圖3人工飼養的金龜子幼蟲(鱭螬)。圖4以人工飼料飼養金龜子成蟲，成蟲正在取食。圖5室內大量飼養的金龜子幼蟲。圖6對金龜子高效Bt生物測定操作。圖7感染Bt的鱭螬和正常發育的鱭螬。圖8不同土壤條件對銅綠麗金龜幼蟲體重增長的影響。圖9不同土壤條件對銅綠麗金龜幼蟲死亡率的影響。具體實施例方式以下實施例用于說明本發明，但不用來限制本發明的范圍。實施例l人工飼料的配制成蟲人工飼料配方榆葉粉或花生葉粉20g、瓊脂粉3g、玉米淀粉2g、蔗糖3g、大豆粉10g、酵母粉10g、山梨酸0,5g、VclO片、復合Vb5片、等重量的NaCL和KCL組成的鹽0.5g和水300mL。配制與飼養方法在500ml的燒杯中加入水，并放入瓊脂，沸騰并溶化，先加入山梨酸，再加入混合均勻的其它成份，待溫度降至60'C時加入維生素，充分攪拌均勻后，倒入培養皿中，在冰箱中保存待用。把人工飼料切成lxlx2cm的塊，放在塑料紙上進行飼喂，根據成蟲的數量確定放飼料的多少，依據取食情況可每2天更換一次飼料。其中，Vc片每片0.1克(石家莊莊制藥集團產品)，復合Vb每片O.l克(天津金世制藥有限公司)。實例2、金龜子成蟲銅養與產卵金龜子成蟲飼養的關鍵在于獲得較多的卵量，為此在明確了成蟲飼養器具和飼養條件的基礎上，重點研究了不同食料對金龜子成蟲產卵的影響，通過飼喂天然飼料(鮮榆葉，玉米苗、梨樹葉、花生葉、大豆葉)、人工飼料(以榆葉粉、花生葉粉、大豆葉粉、白菜葉粉為主要原料配制)。飼養方法將雌雄成蟲各10頭放入飼養籠內，讓其取食和產卵，每日更換一次飼料，并在取食前后對飼料進行稱重，觀察成蟲的取食數量。每隔2d挑出卵，記載產卵數量。明確成蟲取食對成蟲產卵數量及壽命的影響。表l結果表明，華北大黑鰓金龜產卵數量與飼料的關系，配方l(榆葉粉)>配方2(大豆葉粉)>配方3(白菜葉粉)>配方4(花生葉粉)>配方5(玉米葉粉)〉鮮榆葉〉梨葉〉玉米葉〉草葉。在供試飼料中以取食人工飼料的產卵量明顯高于天然詞料，華北大黑鰓金龜最喜食配方l(榆葉粉)，平均單雌產卵50.4粒，次之是配方2(大豆粉)和配方3(白菜葉粉)。從取食量上看天然飼料高于人工飼料，華北大黑鰓金龜子取食量最大的飼料不一定是產卵最多的飼料，這與伺料中金龜子所需營養成份有關。多數金龜子成蟲在產卵之前需補充營養，營養的好壞直接影響著金龜子的產卵數量和壽命。5個配方是單成分，而人工飼料是組合物表l不同飼料對華北大黑腮金龜產卵量的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>實例3卵的孵化與保存為了明確不同銅養介質對金龜子卵孵化的影響，進行了壤土、壤土+沙土、沙土、蛭石四種介質中進行卵的孵化的試驗。結果見表2，結果表明四種飼養介質對卵孵化率無明顯影響，以濕土最優，土壤濕度應掌握在用手捏后能自行散開為宜。在沙子中的卵孵化相對早一些，并且在其中的卵能吸收到充足的水分，以便其發育，而在砂子中挑取幼蟲時易損傷小幼蟲，在蛭石中挑取幼蟲時不易發現幼蟲。為了延長金龜子幼蟲的生物測定時間，所以進行了金龜子卵在不同溫度條件下的保存試驗，如表3。結果表明5。C條件下的卵不宜長時期保存，1(TC可進行30d的保存，隨著時間的加長卵的孵化率明顯降低，30d的孵化率為48呢，而15。C條件下保存，雖對卵的孵化率影響較小，但到40d后，金龜子的卵在保存的溫度下即可孵化。所以金龜子的卵可在10-15"條件下保存30-40d。表2不同介質對華北大黑鰓金龜卵孵化率的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>表3不同溫度條件下保存天數對卵的孵化率的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>實例4提高低齡幼蟲存活率的方法金龜子幼蟲在土中生長發育，極易受到病原微生物的感染，在低齡幼蟲期就引起大量死亡，為了提高金龜子低齡幼蟲的存活率，通過卵面0.2%次氯酸鈉溶液處理和陽光曬土飼養的試驗。結果表明金龜子卵面消毒后卵的孵化率達95%以下和不消毒卵的孵化率相當，卵消毒后不影響孵化，從對幼蟲的影響看出，卵和土都消毒后幼蟲的存活率最高達96.5%，如有一方面不消毒將增加幼蟲的死亡率，所以通過卵面消毒和土壤消毒可減少土壤中昆蟲病原微生物，提高幼蟲的成活率。見表4。表4卵面消毒對幼蟲成活率的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>實例5華北大黑鰓金龜幼蟲對詞料的選擇以壤土為銅養介質，通過飼喂不同飼料，明確不同飼料對華北大黑鰓金龜各齡幼蟲生長發育的影響，由表5可看出，詞喂土豆幼蟲成活率高，且體重增長最明顯，由此看來，土豆適宜飼養華北大黑鰓金龜一齡、二齡幼蟲，花生、玉米次之。人工飼料四個配方對低齡幼蟲的成活率和幼蟲體增重都很低，目前人工飼料與天然飼料相比，無論是存活率還是幼蟲體重都明顯低于天然飼料。因此，在華北大黑鰓金龜幼蟲飼養中，依據幼蟲的發育和飼養成本綜合考慮，利用馬鈴薯塊和發芽玉米根進行飼養最為適宜。表5不同飼料對華北大黑鰓金龜幼蟲的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>實例6不同土壤濕度對幼蟲生長發育的影響分別設16%、18%、20%、22%4個土壤濕度，接入初孵金龜子幼蟲，分別飼養20、40天后調查幼蟲增重和死亡率，結果表明(表6)，在16%的土壤濕度條件下，金龜子幼蟲生長慢；而22%土壤濕度下雖然生長速度快，可是死亡率高；18%、20%土壤濕度下金龜子幼蟲生長發育狀況良好，死亡率低，所以18%-20%的土壤濕度適宜金龜子幼蟲的詞養。表6不同土壤濕度對金龜子幼蟲生長發育的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>實例7Bt菌株生物測定條件的優選1、不同日齡幼蟲的存活率比較分別挑取l、5、10、15、20曰齡的銅綠金龜幼蟲，采用保定市東郊菜田壤土飼養，伺養3、7、14天后，比較各曰齡幼蟲的死亡率。結果表明(表7),選擇IO、15日齡幼蟲進行生物測定能夠保證死亡率較低，能保證生物測定的可靠性，而20天齡幼蟲雖然死亡率較低,但由于隨著幼蟲長大，對蘇云金桿菌的敏感性降低，不應作為被測幼蟲。對不同曰齡的暗黑鰓金龜幼蟲死亡率的調查中(表8),初孵幼蟲7、14d的死亡率分別為1.4%、2.5%,5日齡幼蟲死亡率在三天的調查中均為O。因此，采用5日齡幼蟲進行生測較為適宜。華北大黑鰓金龜幼蟲抗逆性較強，因此，初孵、3、5、10d的幼蟲死亡率均為0(表9),采用3日齡的幼蟲進行生測即可。表7不同日齡銅綠麗金龜幼蟲的死亡率<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>表9不同日齡華北大黑鰓金龜幼蟲的死亡率<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>2不同土壤條件對幼蟲存活率的比較釆用保定市東郊菜田壤土、定州巿西城區沙壤土以及保定淶源白石山松針腐殖土作為被測土壤，每種土壤設以下3個處理121。C濕熱滅菌30min(S)、紫外線照射處理(40W,距離50cm,5h)(UV)、不處理(N)。比較IO曰齡幼蟲在飼養7天、14天時的死亡率和平均體重增長率。通過以下3個處理121'C濕熱滅菌(S)、40W紫外線照射處理5h(UV)以及不處理(N)后，接入銅綠麗金龜幼蟲飼養，幼蟲體重增長的情況見附圖8。在7天時，腐殖土3個處理的幼蟲體重增長率最低，壤土、沙壤土各處理之間差異不顯著；14天時，腐殖土處理的幼蟲體重增長率仍為最低，不處理的沙壤土幼蟲體重增長率最高，其次為滅菌處理的沙壤土、紫外線處理的壤土。附圖9可以看出，在7天時，紫外線處理的壤土和不處理的腐殖土幼蟲死亡率為O。14天時，腐殖土各處理死亡率均偏高，而濕熱滅菌處理的各土壤中幼蟲死亡率均高于紫外線處理和不處理的對照，紫外線處理的壤土和沙壤土中幼蟲死亡率最低，平均低于5.85%。實例8Bt菌株的標準化生物測定將Bt菌株在裝有普通細菌培養基(蛋白胨10g、牛肉膏5g、氯化鈉2g、葡萄糖3g、瓊脂20g、蒸餾水1000mL)的克氏瓶中劃線，3(TC培養至孢晶游離。用水洗下斜面培養物作為菌懸液，將40g馬鈴薯絲加入到20mL菌懸液中混合均勻，連同菌懸液倒入200g土中，放置2h,使土壤含水量為18%。先將馬鈴薯絲均勻分裝于20個養蟲管中，再加入拌勻的菌土，每管接蟲l頭，每一處理20頭幼蟲，重復3次。釆用1.4中優選的最佳蟲齡和土壤條件進行生測，在3(TC、RH60。/。的人工氣候箱中感染飼養，計算幼蟲死亡率。按照優選的生測條件，即采用15日齡銅綠麗金龜幼蟲、5曰齡暗黑鰓金龜幼蟲、3日齡華北大黑鰓金龜幼蟲和紫外線照射處理5h的壤土進行Bt菌株的生測，空白對照的幼蟲死亡率在測定7天時為0，在14天時平均為0.0-2.8%±0.5%，Bt菌株的毒力測定結果重現性較好。通過對銅綠麗金龜子幼蟲高毒力的蘇云金桿菌菌株篩選中發現(表IO)，在供試的1082株Bt菌株中，有殺蟲活性的菌株均為球形伴孢晶體，占被篩選菌株總數的7.3%。銅綠麗金龜幼蟲死亡率達到100%的菌株占球形伴孢晶體菌株總數的0.8%,占被篩選菌株總數的0.3%,比如，HBF-1、H06菌株。因此，對銅綠麗金龜幼蟲高毒力的蘇云金桿菌菌株的篩出率是較低的。通過對華北大黑鰓金龜幼蟲高毒力的蘇云金桿菌菌株篩選中發現(表ll),在供試的369株供試菌株中，使華北大黑鰓金龜幼蟲死亡率達到80-99%的占0.27%,比如HBF-18菌株，死亡率為60-79%的占1.08%,比如HF29、HF32、HF-28、FSH8等，對華北大黑鰓金龜幼蟲高毒力的蘇云金桿菌菌株的篩出率是極低的。通過對暗黑鰓金龜幼蟲高毒力的蘇云金桿菌菌株篩選中發現(表12)，在供試的210株供試菌株中，使華北大黑鰓金龜幼蟲死亡率達到100%的菌株占12.4%,比如185、145、283、202、248、67、166等，死亡率為80-99%的菌株占16.7%。其中，Su4菌株對暗黑鰓金龜及銅綠麗金龜均有較高殺蟲活性，達到80%以上。表10對銅綠麗金龜幼蟲有殺蟲活性的Bt菌株占分離的球形晶體Bt菌株的百分比<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>表12對暗黑鰓金龜幼蟲有活性的Bt菌株占分離的圓形晶體Bt菌株的百比<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>實例9轉Cry基因煙草對金龜幼蟲抗性檢測方法按照建立的危害程度分級標準，黃褐麗金龜幼蟲對供試轉基因植物的危害程度、危害指數(圖13)。PSmCN植株的危害率為61.1%,危害指數為20.8;pTmCN植株危害率為77.8%，危害指數為34.6,與PSmCN植株相當；pBI植株危害率100%,危害指數為70.8，與山西煙危害指數75相當。pSmCN植株和pTmCN植株表現出了良好的抗黃褐麗金龜幼蟲的特性。銅綠麗金龜幼蟲對供試轉基因植物的危害程度、危害指數。PSmCN植株危害率為66.7%,危害指數為22.6;pTmCN植株危害率為50%,危害指數為13.9，低于PSmCN植株；pBI植株危害率為100%，危害指數為65.3，與山西煙危害指數70.8相當。pTmCN植株和pSmCN植株表現出了良好的抗銅綠麗金龜幼蟲的特性。權利要求1、一種金龜子成蟲的飼料，其特征在于，由下列原料組成干榆葉粉或干花生葉粉20g、瓊脂粉3g、玉米淀粉2g、蔗糖3g、大豆粉10g、酵母粉10g、山梨酸0.5g、Vc10片、復合Vb5片、等重量的NaCL和KCL組成的鹽0.5g和水300mL。2、一種金龜子低齡幼蟲的人工飼養方法，包括如下步驟1)將金龜子成蟲按雌雄數目1:1比例置于溫度2427",相對濕度50~70%,光照L13:Dll，2000~4000LX的養蟲室中，養蟲籠中土壤相對濕度18-20%,放入金龜子成蟲的人工飼料或天然飼料飼養產卵，天然詞料每曰下午更換一次，人工飼料每2天更換一次，每隔23天挑取卵l次，其中，所述天然飼料為鮮榆葉；2)將挑出的卵過40目篩，篩除多余的土，浸入0.2%的次氯酸鈉水溶液中5分鐘，然后用清水沖洗45次至無味，吸去多余水份；3)將土壤在日光下暴曬2天消毒，過20目篩后加水，使含水量為18~20%,接入步驟2)中處理后的卵，在25'C條件下孵化，也可在1015。C條件下保存30~40d;4)在養蟲盒中放入5cm的濕土(陽光下消毒2天，含水量18~20%),再放入發芽的玉米和馬鈴薯塊(暗黑金龜幼蟲放入發芽的花生)，供幼蟲取食，將每日挑出初孵幼蟲接入飼養盒中，每盒接入初孵幼蟲100頭，再覆蓋35cm的濕土，置于2527X:，條件下飼養10~20天，作為生物測定的供試蟲源；另外，按上述方法在250ml的塑料盒中接入初孵幼蟲5頭進行詞養，每20-30天更換一次新土和自然飼料，當幼蟲生長到2齡未3齡初時，按上述方法分單頭飼養,作為室常年詞養蟲種；5)飼養至3齡后期時，幼蟲停止取食，體色變黃有皺紋，做蛹室準備化蛹，將已停食的幼蟲單獨飼養，這時可不加食料，并減少換土次數和過多的翻動，以免破壞蛹室影響化蛹，但應每5天打開盒蓋觀察有無成蟲鉆出的痕跡，一旦發現成蟲羽化，及時將羽化的成蟲辨別雌雄后挑入成蟲飼養籠。3、蘇云金桿菌對金龜于幼蟲的高毒力新菌株、新基因源的篩選方法，包括如下步驟生測餌料①馬鈴薯細絲，選新鮮馬鈴薯塊切成細絲(2mn^粗細)，用水沖洗2遍后，控去多余水份；②發芽玉米根，將玉米在水中浸泡12小時，然后撒入濕土中讓其生根發芽，待根長至3cm時挖出，用水沖去泥土備用；③發芽花生，將花生在水中浸泡12小時，然后在保濕的條件下12小時讓其發芽備用(用于暗黑金龜子測定)；稱取馬鈴薯絲40g(或玉米根邊同玉米20粒、發芽花生20粒)，加入到40mL濃度為2xl(^孢子/ml的蘇云金桿菌菌懸液中攪拌混合均勾，連同菌懸液倒入200g土中，放置2h，使土壤含水量為20%;先將生測鉺料均勻分裝于20個養蟲管中，再加入拌勻的菌土，按照優選的生測條件，即釆用15日齡銅綠麗金龜幼蟲、5日齡暗黑鰓金龜幼蟲、3日齡華北大黑鰓金龜幼蟲，每管接幼蟲l頭，處理20頭幼蟲，重復3次，在3(TC、RH6(T/。的人工氣候箱中感染飼養，土壤使用紫外線照射處理5h的壤土；調查記載方法分別于處理后7、14天調查幼蟲的的死亡數量，計算幼蟲死亡率。4、轉c77S基因植物對金龜幼蟲抗性檢測方法，包括如下步驟幼蟲存活率鑒定法在花盆中種植轉基因煙草或草坪草，種植后15天后待很好地存活后，選擇生長一致的植株進行接蟲試驗，每一花盆接初孵金龜子幼蟲5頭，接蟲后注意保持土壤的濕度，每一處理5盆，重復3次，以不轉基因植株作為對照；接蟲后15天調查幼蟲的存活數量，計算各處理的幼蟲死亡率，明確不同植株的抗蟲效果；地下部分危害程度與抗蟲性鑒定方法以煙草為鑒定對象，釆用分別種植pSmCN和pBI植株以及混合種植pSmCN、pBI、pTmCN、pTGN和對照山西煙的種植方法，每個處理12抹，將轉基因煙草各處理12株分別種植在48x33xl3cm的塑料盒子中，土壤深度12cm,每棵煙苗接20日齡的黃褐麗幼蟲5頭或15曰齡的銅綠麗金龜幼蟲5頭，在接蟲15天后，按照分級標準，對各種煙草植株進行統一分級，并計算危害率和危害指數；地上部分危害程度與抗蟲性鑒定方法以草坪草為鑒定對象，在48x33xl5cm的塑料盒子中加土12cm,隨機種植生長一致的轉基因植株8株和對照植株4株，待植株生長15天后，使植株很好地存活，每穴草坪接20日齡的黃褐麗幼蟲5頭或15日齡的銅綠麗金龜幼蟲5頭，重復4次，在接蟲15天后，按照分級標準，對各種植株進行統一分級，并計算危害率和危害指數。全文摘要本發明涉及主要種類金龜子的人工飼養方法，為高毒力Bt菌株的篩選提供生物測定的蟲源。涉及對金龜幼蟲高毒力Bt菌株篩選、生物測定、毒力比較的方法，進而獲得了對銅綠麗金龜、黃褐麗金龜、華北大黑鰓金龜、暗黑鰓金龜幼蟲高毒力的HBF-1、HBF-18、185等菌株，同時明確了Cry8蛋白活性檢測方法和轉cry8基因植物對金龜子幼蟲抗蟲鑒定方法。本發明為金龜子幼蟲的生物防治提供了菌株資源，也為抗金龜子作物的培育提供了基因資源。本發明為金龜子幼蟲的室內飼養提供了適宜的飼養條件和飼養飼料，并為防治金龜子幼蟲的高毒力Bt菌株、Cry蛋白及轉基因植物的抗蟲性鑒定提供了標準化的生測方法。文檔編號A23K1/18GK101190006SQ20061014426公開日2008年6月4日申請日期2006年11月30日優先權日2006年11月30日發明者馮書亮,健宋,宋福平,杰張,曹偉平,杜立新,王容燕,王金耀,黃大昉申請人:河北省農林科學院植物保護研究所