化學敏感性檢驗器的制作方法

專利名稱：化學敏感性檢驗器的制作方法
化學敏感性檢驗器背景技術本發明涉及與生物人工組織切片 一起使用的化學敏感性檢驗 其中生物人工纟且織切片包4舌那些書亍生自"f壬"f可主要器官、器官系 統、克隆組織的切片，其中克隆組織利用體細胞移植、或任何其它 基于干細胞的方式，包括臍帶血、或任何形式的新生物(或贅生物，neoplasm )。化學敏感性檢驗器可以作為提供個體化藥物治療的方法 用以^H古、；險測、以及測試/f熒選藥物、藥物、以及藥物^C"i射物。最 后，化學壽丈感性才企-驗器可以用來研究組織中的疾病，如致癌作用， 其中組織的選擇是基于表型分析、或任何其它蛋白質組學、基因組 學、或^Ci射組學(metabonomic )分沖斤方法，包4舌納米系統生物學 方法。已經i正實，才尤上市前和上市后測i式而i侖，目前的療法存在兩個 主要的缺點。例如，萬絡③的災難性失敗(VIOXX debacle)清楚 說明，需要篩查(screen)用于特定疾病狀態治療的候選藥物以發 現部分民眾是否具有潛在的不良反應。利用目前可獲得的基因組和 蛋白質組分析方法，在經受這種潛在有害和致病的毒性化合物以 前，可以對高危患者和患者類型進行組織篩查。而且，逐步上升的成本影響了這種計算并強調了需要本發明所 披露內容的教導。在回顧了在這方面(in this space )已經確立的歷 史數字以后，這變得非常清楚。才艮據Tufts藥物開發研究中心(Tufts Center for the Study of Drug Development)的研究，在2001年，開發新藥的平均成本超過8億 美元。其中，平均每個公司大約使用1600萬美元用于臨床前研究。 因此，在藥物開發中減少測試時間和降{氐成本對于大多#t制藥7>司 的生存是關鍵的因素。此外，因為在相同的藥物領域通常有一個以 上的公司進行竟爭，所以任何有竟爭力的優勢都是受歡迎的。藥物 開發成本的主要部分產生于FDA批準過程。然而，許多這樣的成 本不能用管理臨床前成本的相同方式加以管理。為了解決高漲的臨 床前成本，體內和體外測試和選4奪潛在的新4美選藥物的更加有效 的、可負^旦的、并且適時的方法在本4亍業具有顯著的意義。在開發新藥時，毒性總是要考慮的重要問題。因為肝臟代謝大 多凄t藥物，所以要尤其關注肝臟損傷。而且，其它器官和系統、以 及它們如何對外來物質起作用，是才及端重要的。因此，在藥物開發 中，利用小動物和細胞培養技術進行的常規體內和體外測試廣泛地 用來評估肝功能。然而，這些常^L測試具有特定的缺點，如個體差 異、使用大動物的高成本、以及原位肝天然存在特性的喪失。對于 其它器官同樣如此。隨著我們對這些其它器官和它們如4可洞察哺乳 動物如何應答各種前藥、藥物、化合物以及系統的知識庫的增加， 本發明披露內容的相對重要性變得更加顯著和重要。為了克服這些缺點，使用了細胞培養系統。然而，借助于這些 模型，細胞與細胞的連接相互作用不能維持所希望的時間長度。一一 旦喪失細胞與細胞的連接性，之后，測試方案很快會失效，因為它 不再針對器官、系統、或生物體水平應答(response )。生物人工器官裝置目前正在開發中。人們相信，^又可以用需要 來自異種或人源的肝組織的可用性的生物基質，即，例如，肝切片 或整個肝樣品，來替代器官功能。最近的努力已經在組合型肝支持 裝置中結合了機械和生物支持系統。這些組合型裝置的機械部件用來除去毒素并在患者血清和肝支持裝置的生物部件之間產生屏障。 這些組合型肝支持裝置的生物部件可以由肝切片、顆粒化肝、或來 自低度腫瘤細胞的肝細胞或豬肝細胞構成。這些生物部件被設置在 通常稱為生物反應器的小室中。然而，就維持在這些裝置中使用的 個體細胞系的功能而論，仍然存在問題。大多數裝置使用永生化細 胞系。已經發現，隨時間流逝，這些細胞會喪失特定功能。有若千組正在開發中的生物人工肝裝置，例如，Circe Biomedical ( Lexington, MA )、 Vitagen ( La Jolla, CA )、 Excorp Medical ( Oakdale， MN )、 以及Algenix ( Shoreview， MN )。 Circe Biomedical裝置將有活力的肝細胞和生物相容性膜整合到體外的生 物人工肝輔助系統中。Vitagen的ELAD (體外肝輔助裝置)人工 肝是一種兩室中空纖維濾筒，其包含培養的人類肝細胞系(C3A)。 該濾筒包含具有特征性分子量篩截的半透膜。該膜考慮到了培養的 人類細胞系和患者超濾液的物理區室化。Algenix提供了 一種系統， 在該系統中外部肝支持系統使用豬的肝細胞。個體豬的肝細胞經過 膜以處理人類血細胞。Excorp Medical的裝置包含中空纖維膜(具 有lOOkda篩截)生物反應器，該生物反應器將患者血液從大約100 克原代豬肝細胞分離出來，其中原代豬肝細胞得自專門飼養 (purpose-raised)的無病原體豬。血液通過裝滿中空聚合物纖維和 含有數以十億計的豬的肝細胞懸浮液的圓柱體。纖維作為屏障以防 止蛋白質和豬細胞的細胞副產物直接接觸患者血液但允許細胞之 間的必要接觸以便可以除去血液中的毒素。這些裝置的不同方面代表了相對于現有的技術的改進，但它們 仍然具有特定的缺點。這些裝置(均使用個體肝細胞)的作用是有 限的，這是由于缺乏表現出肝臟在體內狀態的特性的細胞與細胞的 相互作用。因此，生物人工器官將是有益的，例如，供藥物開發使 用的具有改善的效率、生存力、和功能的肝臟。這種長期存在的需要通過本發明的教導得以解決，本發明為藥物測試提供生物人工組 織切片。隨著生物人工器官系統技術的持續發展，用于篩選化合物的方 法得到了改進。本申請披露了將最近的改進應用于生物人工器官系 統的方法。發明內容本申請披露了 一種新的方法通過用至少 一種化合物處理生物 人工器官系統或細胞培養物并觀察對生物人工器官系統或細胞培 養物的影響來測試在生物人工器官系統或細胞培養物中物質的化 學敏感性。而且，本領域技術人員容易明了，進一步披露的是工作 方法(business method ):利用本發明披露的裝置和方法來為患者提 供組織和器官特異性篩選，以補充切緣基因組、蛋白質組、以及代 i射組分析。本文披露的是一種用于提供模擬體內條件的方法，包括在體外 提供用于顯著復制(或重復)體內組織功能的生物反應器，提供生 物反應器以容納至少一個等分試樣(等份用量，aliquot)的組織樣 品，以及^f吏至少一個等分試樣產生有用的凄史據。而且，披露了一種用于基本上模擬體內條件的方法，包括獲 得用于在體外基本上復制體內組織功能的生物反應器，獲得組織樣 品，以及利用至少一個等分試樣的組織樣品以產生有用的凝:據。進一步披露了一種用于基本上模擬體內條件的方法，包括提 供組織才羊品，將組織樣品分成組織切片(包4舌作為生物人工組織系 統的一部分的組織切片)，以及通過用至少一種藥物療法處理組織 切片以-使用生物人工組織系統產生有用的翁:據。披露了一種類似的方法，包括獲得包含組織切片的生物人工 組織系統，通過用至少一種藥物療法處理組織+刀片以-使用生物人工 組織系統產生有用的數據，以及比較數據以確定有絲分裂活性、化 合物的毒性、或組織病理學，基于數據比較選擇藥物療法。最后，披露了一種用于化學敏感性測試的工作方法，其包括 才是供用于力丈置組織切片的基于生物反應器的系統，將組織裝入(或 置于，p叩ulating)基于生物反應的系統，在組織上對方案進行測試， 以及收集結果。


連同附圖并參照以下描述，本發明4皮露的上述特點和目的將變 得更為明了 ，其中相同的標記凄t字表示相同的元件并且其中圖1是生物人工器官系統的一種實施方式的系統的示意圖；圖2是完整的生物人工器官系統的一種實施方式的透一見圖；圖3是安裝在生物人工器官系統中的生物反應器的一種實施方 式的透一見圖；圖4是生物反應器單元的一種實施方式的透^L圖；圖5是生物反應器單元的一種實施方式的透#見圖，其示出組織 切片裝置的設置；圖6是包含組織切片的組織切片裝置的一種實施方式的分解圖；圖7A是生物人工器官系統的一種實施方式的組織切片排列的 側剖一見圖；圖7B是圖7A的組織切片排列的透視圖；圖8是利用生物人工器官系統進行連續和間歇灌注的體外利多 卡因清除的圖解；圖9是利用生物人工器官系統運行6小時和24小時的體外利 多卡因清除的圖解；圖10是利用生物人工器官系統運行6小時和24小時的體外 DMX濃度的圖解；以及圖11是利用生物人工器官系統運行6小時和24小時的體外氨 清除的圖解；圖12是示出通過本發明的組織切片裝置所進行的過程的示意圖；來獲得有用結果的方法的 一 種實施方式的流程圖。
具體實施方式
如在本文中所4吏用的，術i吾"方案(或療法，regimen)"可以 理解為是指一種或多種藥物、化合物、治療劑、核酸、肽、代謝產 物、病毒、細菌、或可以施加于細力包或組織的其它制劑。本發明人已經發現了 一種改進的調節系統，其用于在來自動物 的器官切片的周圍循環血漿，以產生尤其用于4b學壽丈感性測試的系統。本發明的另一個目的是4是供一種有效方法，其中在將化合物實 際給予有生命的患者以前利用 一種平臺來測試化合物的效力。通過體內和體外動物試驗來了解化合物的毒性和藥理效應。然而，本發 明使人和動物的組織的使用可以被培養并用于在組織上測試化合物。對于新的藥物化合物，FDA要求新藥申請者最少要(l)表現 藥物的藥理范圍(profile); ( 2 )在至少兩種動物物種中確定藥物的 急性毒性；以及(3)進行兩周至3個月的短期毒性研究，其取決 于在建議的臨床研究中使用的物質和建議的時間。該過程是復雜且 昂貴的，其中要測試數百種并且有時是數千種化合物。本發明的進一步的目的是提供一種方法，基于該方法藥物療 法，例如，化療方案，可以針對單個4吏用者實現個體化。 一般i兌來， 在使用化療方案的情況下，并不是所有方案在所有患者中以相同的 方式起作用。對一位患者有效的藥物合劑(drug cocktail)對不同的 患者可能是無效的。本發明提供了一種在給予患者以前測試藥物療 法的效力的方法，從而對每位患者僅實施最有效的方案。本發明的進一步的目的是l是供用于研究疾病和化合物影響組 織的方式的研究平臺和方法。對于本發明而言，術i吾組織沖羊品、組織切片、或組織等分試沖羊 是指生物人工器官系統或組織細胞的細胞培養物，其中組織細胞培 養物不是生物人工器官系統的 一部分。根據本發明的 一 種實施方式，提供了 一種化學敏感性測試方 法，其使用生物人工器官系統來評估、檢測并測試候選藥物、藥物 以及藥物代謝物(結合于此作為參考)。該系統具有組織切片培養 裝置。明顯;也可以:沒想^更于測:逸生物人工器官的其它類4以的系統。 此外，在其它實施方式中，本發明的方法可以和常規組織樣品一起 使用。本發明提供了 一種用于化學敏感性測試的方法，其提供了 一種 方式來4吏用于單個患者的化療方案個體化，預測4匕合物在正常組織 中的毒性，以及研究疾病。根據一種實施方式，在外科手術期間，例如活片企，^是取組織樣品。才羊品^皮切成許多組織切片。3夸各種"fb療方案應用于每個組織切片。在方案完成以后，比專交結果以確定每種方案的效力。通過比l交不同方案，則基于測試結果可以i殳計個體4匕 的化療方案。化學敏感性檢驗器的其它應用是研究和評估毒性、以 及研究和評估組織病理學。圖1是根據本發明的藥物測試系統10的示意圖。將培養基13 從容器12引入生物反應器15。在生物反應器15內有至少一個組織 切片裝置20，其包^"至少一個組織切片23,該切片4非列在兩個絲 網21之間(參見圖7A和7B ),該組織切片裝置垂直且相互平4亍地 放置在生物反應器15內。當培養基被引入生物反應器中時，培養 基水平面開始上升直到它接觸組織切片，其4吏組織切片23可以4妄 觸通過培養基引入的多種(a myriad of)化合物。通過在小室頂部的氣閥151引入氧化了的氣體(含氧氣 體,oxygenated gas )。雖然氣閥示在小室的頂部，但在本文中也可以 設想，氣閥可以在小室的側面或底部，只要具有適當的密封來防止 液體培養基的滲漏。氣體優選是以體積計95%的02和以體積計5% 的C02的混合物，并且在1至10 ATM的壓力范圍下通過氣閥供給 到小室并從其中排出，同時通過壓力控制器(未示出)對壓力進行 控制。電磁閥(也未示出)可以與壓力控制器連接以維持預設 (pre-set)氣體壓力。氣體滅菌裝置18，例3口，具有大約0.22 ]dm 孔徑的注射器式濾器(syringe filter),優選安裝在氣閥151中以濾 出微生物，從而對供給小室的氣體進行滅菌。帶有氣體滅菌裝置18 的氣體止回閥11設置在培養基容器上并用來平衡容器和大氣之間 的壓力。組織切片的穩定性是本發明的一個重要特點。在供給培養基和 氧化氣體的條件下培養組織切片。液體培養基或血漿是通過容器供 給到小室中，而氧化了的氣體是通過小室的頂部供給的。每一種以 規則間隔供給，使得每一個組織切片交替地暴露于培養基和暴露于氣體，其中暴露時間比率為大約1:1至大約1:4。已經發現大約1:2.5 至大約1:3.5的比率是有效的，并且還發現大約1:1或1:3的比率是 有效的，雖然改變這些參數無疑是在技術人員的正常技術水平之 內。泵19控制培養基的流動。組織切片交替暴露于氣體和培養基 的速率大體上相當于代謝速率。在本發明中Waymouth MB 752/1培養基優于血漿。培養基或血 漿類型的特定選擇是普通技術人員熟知的并且可以因細胞類型而 異。為了防止中心性壞死，以上描述的氣體混合物為95% 02和5% co2。因為這種混合物可以產生游離的氧自由基，其通常對于組織 培養細胞是毒性的。例如，對于肝樣品，加入高濃度的谷胱甘肽和 維生素E (作為氧自由基清除劑和抗氧化劑)并補充10%的滅活胎 牛血清和L-谷氨酰胺。現參照圖2，其示出生物人工器官系統10的一種實施方式。生 物人工器官系統10包4舌一個或多個i殳置在i咅養箱32中的生物反應 器15，培養箱32調節小室中的溫度和濕度。培養箱32使使用者可 以調節生物人工器官的狀態，確保生物人工器官隨時間暴露于對生 存力來說最佳的條件。適宜的用于組織培養的培養箱系統的選擇在 本技術領域是眾所周知的，因而不需要進一步的陳述。設置在恒溫室中的是一個或多個生物反應器15。每一個生物反 應器15容納一個或多個組織切片或樣品。^走轉器30轉動生物反應 器15，分別處于濕相和干相。濕相對應于組織切片基本上暴露于培 養基的時間。同樣，干相對應于組織切片基本上暴露于氣體的時間。 控制才莫塊34提供用于控制生物人工器官系統10操作的參數的界面。例如，利用控制才莫塊，可以調節組織切片暴露于氣體和培養基的時間期限，其大體上對應于代i射速率。類似地，利用控制才莫塊34, 可以調節氣體與培養基的比率、以及其它必要的操作參數。如本領 域技術人員明了的，在培養箱32內供給氣體和培養基。現參照圖3，其示出安裝在培養箱32中的生物反應器15的近 -現圖。為了便于進入和退出，生物反應器15和凝:轉器30可以固定 于平臺，該平臺可以滑進和滑出培養箱32。當安裝在培養箱32中 時，每個生物反應器15分別連接于氣體和培養基供給管36和38。 如圖3的實施方式所示，氣閥151 (每個組織切片裝置小室155有 一個)連接于氣體供給管36。如圖3所示，歧管系統17i殳置在氣 閥151和氣體供給管36之間。如前所述，氣體過濾器18安裝在氣 體供給管36和氣閥151之間。類似地，培養基閥153連4妄于i咅養 基供給管38。如前所述，培養基過濾器18設置在培養基供給管38 和培養基閥153之間。現參照圖4，其示出生物反應器15的一種實施方式。雖然許多 構造是可得到的并且將為本領域普通技術人員所明了，但示于圖4 的實施方式包括許多組織切片裝置小室155 (參見圖5)。生物反應 器基座157和生物反應器蓋158相互連接，由密封空腔形成每一個 組織切片裝置小室155。氣閥151可以通常連接于氣體供給管36并 且氣體連通于組織切片裝置小室155,以便為包含在組織切片裝置 小室155中的組織切片提供所需氣體混合物。培養基閥153流體連 通于組織切片裝置小室155并且對于培養基起到與氣閥151對于氣 體的功能相同的功能。根據這些實施方式，生物反應器蓋密封器159 密封生物反應器蓋158和生物反應器基座157。生物反應器蓋密封 器159可以是0形環或其它類似裝置，當生物反應器基座157和生 物反應器蓋158處于相互連4妄構造時其可以防止:^u體、滲漏，并且當 倒轉時，本領域普通技術人員將明了和理解用作生物反應器蓋密封 器159的實際選擇。才艮據圖5示出的實施方式，每一個組織切片裝置小室155容納 至少一個組織切片裝置20。當未相互連接時，組織切片裝置20可 以插入空腔，其形成生物反應器基座157中的組織切片裝置小室155 的一部分。根據該示例性實施方式，將單個組織切片裝置20插入 每個空腔；然而，通過在生物反應器15中提供多個組織切片裝置 小室155,可以在單個生物反應器15中采用多個組織切片裝置20。 然而，本發明設計這樣的生物反應器15構造其包4舌不同數目的 組織切片裝置小室155，并且每個組織切片裝置小室155具有不同 數目的組織切片裝置20。在將每個組織切片裝置20插入組織切片 裝置小室155以后，將生物反應器蓋158與生物反應器基座157相 互連接。在相互連接以后，就用生物反應器蓋密封器159密封生物 反應器15。然后可以將生物反應器15放入培養箱32中并連接于氣 體供給管36和培養基供給管38，并相應地進行實驗。如前所述并且如圖6中的實施方式所示，《且織切片裝置20可 以包4舌多個絲網21。如前所述，絲網21可以由不銹鋼或本4頁i或普 通技術人員已知的其它材料制成。將一個或多個組織切片23設置 在相鄰絲網21之間并且用組織切片裝置夾24將絲網21扣緊在一 起。技術人員應當明了 ，對于每個試驗記錄(protocol)可能需要對 組織切片的尺寸和厚度進行優化并且組織薄片的尺寸和厚度可因 實-瞼和纟且織而異。才艮據示于圖6的示例性實施方式，兩個絲網21形成組織切片 裝置20。才艮據該示例性實施方式，將組織切片23置于組織切片裝 置20的下部40%處。在組織切片裝置20中的組織切片23的這種 構造可確4呆組織切片完全暴露于干循環和濕循環。圖7A和7B示出組織切片裝置20的類似的實施方式。兩個不 4秀鋼絲網21，其尺寸可以基于小室的尺寸來選4奪。這兩個絲網優選 平4亍排列。在一種實施方式中，絲網具有大約0.26mm的孔徑。此外，在一種實施方式中，可以壓制(press)絲網以確4呆一致的平面 度。在絲網21之間是多個組織切片23，如以有序方式排列的肝切 片。兩個絲網^f立于組織切片的每一側并具有足夠的空間以致不會才齊 壓組織切片，但還足以保持它們以使它們不會被培養基沖走。雖然 圖7A和7B示出相對較少數目的位于在絲網之間的組織切片，但應 當明了 ，裝置的效率取決于組織切片的數目和所采用的組織切片的 尺寸。另外，雖然示出兩個絲網21，但設想可以使用任何數目的絲 網21。如果使用單個絲網21，其被設計成包圍(至少部分地)組 織切片23,從而形成空間并將它們保持在該空間中。例如，絲網可 以形成適當尺寸的U形。在本發明中4吏用的組織切片23可以獲得自適宜的動物，例如， 兔、豬、狗、嚙齒類動物、或人，其取決于裝置的所希望的用途。 特別地可以考慮人類組織并且可以與動物組織互換使用。組織切片 23可以具有適合于維持其生存和基本功能的任何尺寸或形狀。在本 發明中，示出的有效的組織切片23的厚度具有大約10 pm至大約 2,000 |um的厚度范圍。已經確定，在特定的實-險中，大約100 pm 至大約500 pm的厚度是有效的。本發明理想;也適合于測試藥物的毒性和歲文率(療歲文，efficiency ) 的方法。通過將組織切片暴露于藥物或<夷選藥物并7見測組織(如肝 組織)代i射化合物的能力來完成測試，其中化合物或其代i射產物可 以加以檢測。例如，氨和利多卡因是可以由健康肝臟代謝的常見化 合物。以下實施例示出了這種測試，如將其用于肝切片。本領域技 術人員認識到本發明可應用于其它器官。為了在組織切片或等分試樣上測試化療方案，將至少一種化合 物施加于生物人工器官系統中的至少 一個組織等分^式才羊。經過預定 時間以后，收集數據。在每一個實驗中，條件可以復制。在完成每個組織切片或等分試才羊的測試以后，對凄t才居進4亍比 較。數據的比較便于本發明的不同應用，包括，例如，有絲分裂活 性、細胞毒性參數、以及組織病理學的沖企測。 一旦從數據推導出， 這些結果可用于，例如，為患者制定最有效的化療方案，用于一般 預測給定化合物或多種化合物的毒性，或用于致癌作用研究。當然， ,人數據可以獲得其它推i侖，并且利用組織切片或等分試沖羊進4于實-瞼 的設計上的變化便于推導出不同的信息。圖8至11說明了本文披露的使用肝切片作為組織樣品的原理 和裝置的應用。在圖8和圖9中提供的數據證明了生物人工器官系 統隨時間清除利多卡因的能力。類似地，圖10示出隨時間測;彈的 濃度增加，其基本上模擬樣品的體內生理過程。最后，圖11證明 了本發明教導的在對氨進行解毒方面的能力。圖8至11提供的數 據并不用來限制或用來說明本發明的教導將獲得的實際結果，而只 是用來證明本發明的教導所達到的效用。因此希望不同的構造將獲 得類似的結果，其并不是本文提供的數據的完全復制。現參照圖12，其示出應用本文4皮露的裝置的方法的一種實施方 式。根據一種實施方式，使生物反應器15負載組織切片23并將其 密封。生物反應器15可以與本文披露的實施方式完全相同或是具 有類似功能的其它裝置。將生物反應器連接于至少一個包含可提供 量的(a supply of)培養基的培養基容器l2。根據其中生物反應器 包括多個組織切片裝置小室155的實施方式，可以用不同的培養基 容器供給培養基，其取決于實驗所追求的特定目標。例如，根據一 種實施方式，生物反應器15包括6個組織切片裝置小室155(參見， 例如，圖5)。第一'J、室可以用作對照，其中沒有對培養基供《合添加 劑。其它5個小室可以供給含有要在組織切片23上進行測試的化 合物(如不同濃度的利多卡因或氨)的培養基。類似地，可以對所 有或部分組織切片裝置小室155供給完全相同的化合物以《更具有多 組結果或防止特定組織切片裝置小室155的污染(fouling)妨礙結果的修正(retrieval )。然而，精確的實驗設計和試驗記錄在許多變 量(如本領域技術人員所已知和明了的)上是可配置的。根據一些 實施方式，可以將過濾器18i殳置在培養基容器12和生物反應器15 之間。生物反應器15還連接至氣體供給管40。根據實驗設計和試驗 記錄，氣體供給管可以供給各種組合和濃度的氣體。通常，可以將 單個氣體供給管40連接至所有組織切片裝置小室155。然而，如果 實驗設計或試驗記錄需要和要求的話，則可以使用多個氣體供給管 40。根據一些實施方式，過濾器18可以設置在氣體供給管40和生 物反應器15之間。在將培養基和氣體供給到每個組織切片裝置小室155以后，將 生物反應器15溫育給定的時間。在溫育期間，將組織切片交替地 暴露于培養基和氣體。這可以用多種方式來完成。例如，可以交替 地注入和回收培養基和氣體，以致在任一給定時間氣體或培養基都 處于組織切片裝置小室155中。可替換地，可以旋轉生物反應器15 以便組織樣品交替地暴露于培養基和氣體，二者均保持在組織切片 裝置小室155中。這可以通過下述方式來完成確併:組織樣品23 〈叉占據一定容積的組織切片裝置小室155,以致在一種構形 (configuration )中它完全浸沒在培養基中，但在旋轉以后則完全暴 露于氣體。圖6說明了反映這種想法的實施方式，其中組織樣品23 占據組織切片裝置20的40%。本領域技術人員將明了這種想法的 其它等同替換。在實驗期間的不同點，可以移取(remove)培養基的樣品用于 測試。才艮據圖12所示的實施方式，排泄泵60可以除去培養基的等 分試樣。 一旦除去，培養基可以具有任何抽提同時被捕獲在氣泡收 集器(除泡器，bubble trap) 70中的氣體。其后，培養基等分試樣存于處理過的培養基容器50中并測試。在測試以后，它可以#1送 回到生物反應器15或廢棄。i殳置在系統中的過濾器18保持無菌。圖13示出的實施方式舉例-說明了測i式不同4b合物和物質的化^ 學每文感性的方法。在該示例性方法中，在外^f牛手術期間^是取組織才羊 品。組織可以是人或動物纟且織，其取決于所述纟且織的所希望的應用。 例如，為了制定(create)個體化的化療方案，,人要為其制定方案的 患者除去組織。例如，可以除去癌性組織，然后暴露于各種各樣的 抗癌藥物合劑，以確定用于所測試的特定癌癥的最好合劑。類似地， 在毒性測試應用中，可以〗吏用來自任何適合的人或動物宿主的組 織。才艮據一些實施方式，起初可以使用動物組織。在一種化合物在 動物研究中被認為是安全的以后，可以用人類組織樣品進一步測試 4匕合物或物質的毒，I"生。可以在其它外科手術中附帶獲得或在專門用來獲得組織樣品 的操作(例如活組織檢查)中獲得組織切片。對于個體化化療方案， 組織必須來自患者，因此在無關的外科手術期間或在專門用來獲得 組織樣品的操作期間，需要直接從患者獲得組織樣品。其它化學敏 感性應用可以z使用其它來源的組織沖羊品，其取決于特定的試-瞼方案 (protocol )。才艮據一些實施方式，當用組織測試各種化合物時，適當地依一 定尺寸制造的組織樣品用來獲得結果。這樣的結果(包括個體化的美國專利第6,678,669號、第6，905，816號、第6,983,227號以及第 6,999,607號中的至少一個中找到，上述每個專利以引用方式(就像 在本文中完全提出的一樣)清楚地結合于本文。在從患者除去以后，將該組織樣品切片或用其它方式將其分成 組織的至少一個等分試才羊。在一種實施方式中，在如前所述的組織切片裝置小室155和生物反應器15中單獨培養每個切片或等分試 樣，如利用圖12所示的方法。使用多個、復制的組織切片使研究 人員和醫生可以在器官水平將相同的組織切片暴露于化合物，其中 起作用的變量僅是實施的方案。其后，對結果進行分析。由于僅有的變量是實施的方案，所以 本發明提供了一種與其它可行的方案相比來評價每個給定方案的 效力的有力工具。此外，如在以下實施例中所描述的，由于該系統 和方法被設計為用于來在器官、系統、以及在某些情況下在生物體 水平上進行測試。因此，利用本發明的方法和裝置，研究人員和醫 生具有一種評價有絲分裂活性、細胞毒性參數、組織病理學、以及 在器官、系統、以及生物體水平上的"^午多其它相關應用的有力工具。根據一種實施方式，利用本發明的技術可以體外重建(recreate ) 系統或生物體，但通過利用來自系統的各種組織的組織切片并平行 連接它們來提供提示體內過程的結果。借助于培養基從一種組織類 型到下一種類型的轉移而發生連接(connection),其使研究人員可 以^L察方案對不同器官沖羊品的逐步歲丈應(stepwise effect )。才艮據類似的實施方式，組織切片或來自組織切片的不同組織類 型可以以各種排列結合在單個組織切片裝置20中。這種類型的實 驗使研究人員可以在體外環境中控制在體內系統中的組織類型，用 于研究和治療用途。本領域普通4支術人員可以明了在將本發明的裝 置和方法用于觀測方案的效應和效力時的許多變化。類似地，在體 內系統中控制變量的各種方法作為獲得結果的有力方式對技術人 員是有吸引力的，否則將不能缺少人類或動物實驗。例如，才艮據一種實施方式，多個動物肝切片#皮安全地定位在生 物反應器15中，以使暴露于培養基的肝切片的表面積最大化。有 一種向組織切片裝置小室內選擇性地供給培養基并除去培養基的方式，以使小室中的培養基上升以接觸組織切片。小室中培養基上 升，以致肝切片被完全浸沒。反向的相同過程也可以用來除去培養 基使其不接觸組織切片。還有一種將氣體供給到小室頂部的方式， 以使組織切片交替地暴露于氣體和培養基。這項工作是如前所述加 以完成。另外，提供了一種用于當培養基進入和離開小室時容納培 養基的容器。優選對小室進行溫度調節。對于人類組織切片，溫度優選保持在大約36.5°C。對于嚙齒類動物組織切片，溫度保持在大 約36至38。C之間。然而，豬組織切片對于溫度波動非常每丈感，因 此溫度必須^f呆持在38°C (豬的正常體溫)。實施例1在一種實施方式中，醫生可以利用本發明的教導來確定用于癌 癥患者的化療藥物合劑的最佳濃度。醫生對來自患者的癌性組織進 行活組織檢查并將組織樣品分成等分試樣。醫生將等分試樣分成兩 組。醫生使用第一組來確定對于所述患者的最有效的藥物合劑。然 后醫生使用第二組等分試樣來確定藥物合劑的最佳濃度。對于第 一 組等分試樣，醫生使用該組來確定最有效的藥物合 劑。如前所述，對組織等分試樣進行培養。將各種藥物合劑給予組 織等分試樣。通過本領域普通技術人員常用的方法測量等分試樣中 癌性組織的細胞凋亡百分率。然后，醫生選擇與健康組織相比在最 大程度上誘導癌性細胞組織凋亡的藥物合劑。然后醫生<吏用第二組組織等分試樣來確定用于癌性組織的藥 物合劑的最佳濃度。用與第 一組組織等分試樣相同的方式對該組織 等分試樣進行培養。醫生將各種濃度的藥物合劑施加于每個組織等 分試樣并選擇與健康組織相比在最大程度上使癌性組織凋亡的藥 物合劑的濃度。作為優化化療方案(患者將接受該方案以治療癌癥)的結果， 患者將接受最有益的治療而使不希望的副作用降至最小。如果醫生 愿意，則在單個實驗中將各種濃度的多種藥物合劑施加于多個組織 等分試樣可以獲得相同的結果。
實施例2
在另 一種實施方式中，本發明的教導可以用來預測化合物對《老 康組織的毒性。根據新藥上市申請或新藥報審簡表的批準，這樣的 結果可用于產生凄t據并l是交FDA。動物或人類組織樣品可以通過活 組織4企查或作為外^hf術的一部分來獲得。通常4吏用兩個物種的動 物， 一種嚙齒類動物和一種非嚙齒類動物，因為藥物對一個物種的 影響可以與對另一個物種的影響不同。其它器官同樣提供關鍵數據 并且在本發明的范圍內是有用的。在另一種實施方式中，組織是部 分獲得自死亡的器官供體，克隆的、再生的或其它通過本領域纟支術 人員已知的技術提供的包括通過體細胞移植的臍帶血和干細胞等。
如前所述，組織等分試樣來自組織樣品并加以培養。如前所述， 在對組織進行培養以后，將化合物施加于每個組織等分試樣以確定 化合物的效力以達到所希望結果。如由FDA所失見定的或才艮據本領 域普通技術人員i殳置的參數來收集數據并解釋，以確定化合物在組 織中的歲丈力。
實施例3
類似地，在疾病研究中，可以利用各種化合物進行疾病研究。
們對化學途徑的影響。此外，可以將化合物施加于組織以^L察它們 在組織水平上的影響(與細胞水平或生物體水平不同)。本發明揭_供了使用生物人工器官系統的方法；實l全參數對于本領域普通技術 人員來說是顯而易見的而無需進行過度實驗。
可以由獨立的第三方進行測試，以排除任何偏見的影響。盡一 切努力確保盡可能少 <吏用動物作為組織樣品的來源并人道地對4寺 它們。可替換地，本發明還設想使用人類組織，其樣品可以獲自器 官供者。因為大多數藥物在肝臟中被代謝，毒性研究自然地集中于 對肝臟的影響。
實施例4
本發明還提供了觀察器官系統之間的相互作用的新方式。組織 切片可以獲自不同的器官。然后將組織切片平行放入多個生物反應 器組織切片裝置小室中。將培養基施加于第 一 小室并允許其與組織 切片接觸一段時間。在開始一段時間以后，從第一組織切片裝置小 室除去培養基并轉移入第二組織切片裝置小室，第二組織切片裝置 小室含有來自不同實驗條件下的不同器官或相同器官的組織樣品， 如增加的代j射、不同的原^細月包類型、或感興趣的細月包類型的不同 濃度。在一些實施方式中，在將培養基轉移到第二組織切片裝置小 室之前或同時，可以獲得培養基的樣品以暫停測試。然后，使移入 第二組織切片裝置小室的培養基起作用 一段時間。對每個組織切片 裝置小室重復該程序直到實驗結束。
例如，研究人員可對蛋白質消化感興趣。從而組織樣品可以獲 自口腔內部、食管、胃、小腸切片(對應于十二指腸、空腸、以及 回腸)、以及大腸。因此含有蛋白質樣品的培養基樣品可以和每種 不同的組織類型起反應以確定在系統水平上特定器官對想要消化 的蛋白質的影響。雖然通過目前祐:i人為是最實用和優選的實施方式對裝置和方 法進4亍了描述，^旦應當明了，本發明不限于所纟皮露的實施方式。而 是涵蓋包括在權利要求的精神和范圍內的各種改進和等同替換，權 利要求的范圍應符合最廣泛的解釋，以Y更包4舌所有這些改進和類似 結構。本發明包括以下權利要求的任何和所有實施方式。
權利要求
1.一種用于提供模擬體內狀態的方法，包括提供用于在體外基本上模擬體內組織功能的生物反應器；供給所述生物反應器以容納組織樣品的至少一個等分試樣；以及使至少一個等分試樣產生有用的數據。
2. 根據權利要求1所述的方法，其中，通過在所述組織中維持細 胞與細胞的相互作用來實現體內狀態。
3. 才艮據片又利要求1所述的方法，其中，通過利用所述組織才羊品和 生物反應器的組合來產生化學敏感性數據。
4. 根據4又利要求1所述的方法，其中，所述生物反應器用于下述 的至少一種確定最佳化療方案、預測方案的毒性、或研究疾 病。
5. 根據權利要求1所述的方法，其中，所述數據描述有絲分裂活 性、毒性研究、以及組織病理學組成的組中的至少一種。
6. 根據權利要求1所述的方法，其中，所述生物反應器基本上在 生物體水平上復制組織功能。
7. 根據權利要求6所述的方法，其中，所述生物反應器基本上在 系統水平上復制組織功能。
8. 根據權利要求7所述的方法，其中，所述生物反應器基本上在 器官水平上復制組織功能。
9. 才艮據4又利要求1所述的方法，其中，通過應用至少一種方案來 產生所述有用的數據。
10. —種用于基本上才莫擬體內狀態的方法，包括獲得用于在體外基本上復制體內組織功能的生物反應器；獲得組織才羊品；以及利用所述組織才羊品的至少 一 個等分試才羊來產生有用的據。
11. 根據權利要求IO所述的方法，其中，通過在所述組織中維持 細胞與細胞的相互作用來實現體內狀態。
12. 根據權利要求10所述的方法，其中，所述生物反應器用于下 述的至少一種確定最佳ib療方案、予貞測4b合物的毒性、或研 咒疾病。
13. 根據權利要求IO所述的方法，其中，所述數據描述有絲分裂 活性、毒性研究、以及組織病理學組成的《且中的至少一種。
14. 根據權利要求10所述的方法，其中，所述生物反應器基本上 在生物體水平上復制組織功能。
15. 根據權利要求14所述的方法，其中，所述生物反應器基本上 在系統水平上復制組織功能。
16. 根據權利要求15所述的方法，其中，所述生物反應器基本上 在器官水平上復制組織功能。
17. 才艮據4又利要求10所述的方法，其中，通過應用至少一種方案 來產生所述有用的數據。
18. 才艮據4又利要求10所述的方法，其中，通過利用所述組織沖羊品 和生物反應器的組合來產生化學敏感性數據。
19. 一種用于基本上才莫擬體內狀態的方法，包括提供組織樣品；將所述組織樣品分成組織切片；包括所述組織切片作為生物人工組織系統的一部分；以及通過用至少一種方案處理所述組織切片〗吏所述生物人工 組織系統可以用來產生有用的凝j居。
20. —種方法，包4舌獲得包含組織切片的生物人工系統；通過用至少一種方案處理所述組織切片以利用所述生物 人工組織系統來產生有用的數據；并對所述數據進行比較以確 定有絲分裂活性、化合物的毒性、或組織病理學；以及基于數 據的比較，選4奪方案。
21. —種用于4b學壽文感性測^式的工作方法，所述工作方法包4舌提供用于容納組織切片的基于生物反應器的系統； 將組織裝入基于所述生物反應的系統； 在所述纟且織上測i式方案；以及收集結果。
22. 根據權利要求21所述的方法，進一步包括利用所述結果來判 斷有絲分裂活性、毒性、或組織病理學中的至少一種。
全文摘要
一種用于在生物人工組織切片系統中測試物質的化學敏感性的新方法，比常規細胞培養系統更有效，并且通過用至少一種化合物處理生物人工組織切片系統的樣品并觀察對留在其中的生物人工組織切片，或細胞、組織樣品或來自測試過程的其它衍生物的影響來進行。
文檔編號A01N1/00GK101268365SQ200680034950
公開日2008年9月17日 申請日期2006年8月24日 優先權日2003年12月16日
發明者樸圣秀 申請人:海帕浩普公司