專利名稱：一種芒草的組織培養方法
技術領域：
本發明涉及植物的組織培養方法，尤其涉及芒草的組織培養方法。
技術背景能源問題已成為全球最關注的話題之一，它不僅僅是面臨短缺的問 題，還與如何減輕溫室效應有關。同樣，溫室效應也是全球面臨的重大 問題之一。面對這些難題，各國都在積極尋找開發新能源的有效途徑， 例如，開發利用太陽能、風能、水能、生物質能源等。太陽能、風能、 水能、生物質能屬于可再生的清潔能源，開發利用這些可再生的清潔能 源，不但能有效地解決能源短缺的問題，還能減少C02的排放，減輕溫 室效應，有利于環境保護。開發利用生物質能大有可為，沼氣就是一種在我國已走進千家萬戶 的生物質能源。將植物根、莖、葉等的干物質直接作為燃料進行發電等， 也是近些年人們普遍思考的一個重大課題。為了推進這一設想的有效實 施，就需要解決作為燃料的植物的品種選擇、快速經濟的繁育、大面積 豐產栽培、機械化收割干燥處理等問題，走產業發展之路，形成快速經 濟的繁育——大面積豐產栽培——機械化收割干燥處理"利用的產業 鏈。芒草(Miscanthusxgiganteus)為一種多年生草本C4植物，高可達4 米，叢生狀。葉大部分基生，葉片扁平條形，長達1米。頂生總狀花序，主軸四周為散房狀穗狀花序，小穗上有成束的絲狀毛，秋季形成紅色花 序。喜陽光充足和濕潤的沙壤土。芒屬植物能適應多種類型土壤，具有良好的抗干旱能力。芒草(Miscanthusxgiganteus)就是一種有開發前景 的生物質能源植物品種。它不僅是有開發前景的生物質能源，還是優質 的造紙原料。但是，芒草(Miscanthusxgiganteus)人工快速經濟的繁育、大面積 豐產栽培、機械化收割干燥處理等問題，全世界剛剛起步，國內還是一 片空白，尤其首先要解決如何實現芒草的人工快速經濟的繁育。現有技 術中，芒屬植物作為商業開發時人工繁育的成本高，不適宜大面積的人 工種植。發明內容本發明旨在通過基因改良與組織培養，提供芒草(Miscanthus x giganteus) —種人工快速經濟的繁育技術，以實現芒草(Miscanthus x giganteus)的人工快速經濟繁育，適宜芒草大面積的人工種植，推進芒 草的產業開發。為了達到上述目的，完成上述任務，本發明一種芒草的組織培養方 法包括A、 選取芒草頂端莖尖或根狀莖作為組織培養的外植體；B、 對外植體進行處理；C、 將外植體放入培養基中誘導出愈傷組織塊；D、 將愈傷組織塊轉移到新的培養基中，生長成愈傷組織胚狀體；E、 將產生的胚狀體移入新的培養基繼續培養；F、 將形成的1 2毫米的愈傷組織胚狀體用常規的組織培養技術進 行地上部分的誘導；G、 將地上部分已誘導的小苗進行分離，進一步培養成苗。 下面，對上述技術方案進行進一步闡述。1、 選取外植體選取芒草頂端莖尖為組織培養外植體時，包括頂端分生組織和未成 熟花序。2、 外植體的處理步驟與方法對作為組織培養外植體，先進行消毒處理，然后進行清潔處理；如是頂端分生組織和未成熟花序，還要去掉外面的包葉，將未成熟花序切 割成小段。3、 愈傷組織誘導步驟① 配置組織培養基，組織培養基為基本的MS培養基加上20g/l的蔗 糖、750mg/l的氯化鎂(MgCL 6H20)、 2. 5mg/1的2， 4_D、 0.5 mg/1的 BAP、 12.5mmol/l的脯氨酸和0.8%的瓊脂，其pH為5.5 5.8;② 外植體放在盛有上述培養基的培養器皿里，然后用膜將培養器皿 封口包好；③ 外植體先在黑暗中或弱光中，溫度23。C 25TTF培養4 6個星期；④ 當愈傷組織塊誘導出來，然后轉移到新的培養基中。4、 胚狀體誘導方法把愈傷組織分成0.3克 0.5克，或直徑為0. 4 0. 6cm的小塊，將所述各小塊分別放在裝有8ml 12ml的液體培養基的器皿中進行胚狀體 的誘導，該液體培養基為含有20g/l的蔗糖、750mg/l的氯化鎂 (MgCL 6H20)、 2. 5mg/1的2， 4-D、 0.5mg/l的BAP、 12.5mmo1/1的脯 氨酸的MS培養基，培養溫度25'C 3(TC，光照強度5 8^mol/m2/s，每 天照光時間為14 20小時，培養2 3個星期。 5、成苗誘導方法將經過上述"4"處理的胚狀體放入裝有35ml 40ml的液體培養基 的器皿中，放在搖床上繼續培育，2 3個星期之后轉移到新的培養基中， 1 2腿大小的愈傷組織形成后用常規的組織培養技術進行地上部分的誘 導，該液體培養基為含有20g/l的蔗糖、750mg/l的氯化鎂(MgCL *6H20)、 2. 5mg/1的2， 4-D、 0.5 mg/1的BAP、 12.5mmo1/1的脯氨酸的MS培養基。本發明的一種芒草的組織培養方法，具有突出的優點其一，培養 快速，從開始誘導傷愈組織，4 6個星期之后，胚狀體開始形成，8 IO個星期之后，形態已經開始發生，然后把地上部分已誘導的小苗進行 分離，進一步培養成苗；其二，經濟適用，每克傷愈組織可以再生500 1500個莖，這取決于材料，培養基與激素的應用， 一般地來講，通過3--4 星期的培養可以擴大8 10倍；其三，能促進芒草的商業開發，滿足開 發生物質能源和造紙原料的需求；其四，芒草作為生物質能源開發，有 利于改善環境，正如有關研究人員指出的"雖然芒草等植物在燃燒時會 向空中排放二氧化碳，但在它們的生長過程中，會吸收大量空氣中的二 氧化碳，算起來，它們對空氣二氧化碳含量的影響為零。"；其五，本發 明的方法易于實施，便于推廣。
具體實施方式
下面，結合實踐介紹本發明一種芒草的組織培養方法的具體實施方式
。1、 選取外植體以芒草Miscanthus x giganteus作為組織培養品種，選取芒草頂端莖 尖為組織培養外植體時，取1 2年生芒草頂端莖尖分生組織，包括頂端 分生組織和未成熟花序6 9cm長，先放在25 28。C的自然光下進行光 照處理，每天照光時間為16小時，培養1 2天。2、 外植體的處理步驟與方法作為組織培養外植體，先用2%次氧酸鈉溶液浸泡消毒30分鐘，然 后用無激素的液體培養基沖洗三次，去掉外面的包葉，取未成熟花序， 用解剖刀切割成l 2mm長。3、 愈傷組織誘導步驟愈傷組織誘導培養基為基本的MS培養基加上20g/l的蔗糖、750mg/1 的氯化鎂(MgCl2 '6&0)、 2. 5mg/1的2， 4-D、 0.5 mg/1的BAP、 12.5mmo1/1 的脯氨酸，調pH為5.5，然后加0.8%的瓊脂，高壓滅菌鍋12(TC滅菌15 分鐘；外植體放在直徑9cm含有25ml培養基的培養器皿里，然后用膜將 培養器皿封口包好。外植體先在弱光中(0.5nmol/m2/s)，溫度27。C培養，前兩個星期， 每個星期繼代培養一次，以后4個星期每隔一個星期繼代培養一次。在 愈傷組織誘導和生長過程中，不定期地用立體顯微鏡進行檢查。當白色的愈傷組織塊誘導出來后進行分離。4、 胚胎體誘導方法把愈傷組織分成直徑為0. 5cm的小塊，將上述各小塊轉移到10ml含 有20g/l蔗糖、750mg/l的氯化鎂(MgCL 6H20)、 2. 5mg/1的2， 4-D、 0.5 mg/1的BAP、 12.5mmo1/1的脯氨酸的MS培養基中進行再生，光強為 6.7|imol/m2/s，溫度為27。C。5、 成苗誘導方法3個星期之后用包括40ml液體培養基的厄倫美式(燒)瓶，放在搖 床(100rpm)上繼續培育，3個星期左右之后轉移到新的培養基中，l 2mm大小的愈傷組織形成后用常規的組織培養技術進行地上部分的誘導。 該液體培養基為20g/l的蔗糖、750mg/l的氯化鎂(MgCL 6比0)、 2. 5mg/1 的'2， 4-D、 0.5 mg/1的BAP、 12.5mmo1/1脯氨酸的MS培養基。本發明不局限于具體實施方式
，只要是采用了本發明方法提供的組 織培養方法、培養基成分、培養條件以及操作方法，在不脫離本發明構 思的前提下，無論是采用何種組織培養方法，進行何種等同變換和修飾， 都將落入本發明的保護范圍之內。
權利要求
1、一種芒草的組織培養方法，其特征是，它包括A、選取芒草頂端莖尖或根狀莖作為組織培養的外植體；B、對外植體進行處理；C、將外植體放入培養基中誘導出愈傷組織塊；D、將愈傷組織塊轉移到新的培養基中，生長成愈傷組織胚狀體；E、將產生的胚狀體移入新的培養基繼續培養；F、將形成的1～2毫米的愈傷組織胚狀體用常規的組織培養技術進行地上部分的誘導；G、將地上部分已誘導的小苗進行分離，進一步培養成苗。
2、 根據權利要求1所敘述的一種芒草的組織培養方法，其特征是 選取芒草頂端莖尖為組織培養外植體時，包括頂端分生組織和未成熟花 序。
3、 根據權利要求1所敘述的一種芒草的組織培養方法，其特征是， 外植體的處理步驟與方法包括對作為組織培養外植體，先進行消毒處 理，然后進行清潔處理；如是頂端分生組織和未成熟花序，還要去掉外 面的包葉，將未成熟花序切割成小段。
4、 根據權利要求1所敘述的一種芒草的組織培養方法，其特征是， 愈傷組織誘導步驟包括①配置組織培養基，組織培養基為基本的MS培養基加上20g/l的蔗 糖、750mg/l的氯化鎂(MgCL 6H20)、 2. 5mg/l的2， 4-D、 0.5mg/l的BAP、 12.5mmol/l的脯氨酸和0.8%的瓊脂，其pH為5.5 5.8;②外植體放在盛有上述培養基的培養器皿里，然后用膜將培養器皿 封口包好；(D外植體先在黑暗中或弱光中，溫度23。C 25r下培養4 6個星期；④當愈傷組織塊誘導出來，然后轉移到新的培養基中。
5、 根據權利要求4所敘述的一種芒草的組織培養方法，其特征是 當愈傷組織塊誘導出來之后，把胚狀體愈傷組織分成0.3克 0.5克， 或直徑為0. 4 0. 6cm的小塊，將所述各小塊分別放在裝有8ml 12ml的 液體培養基的器皿中進行胚狀體的誘導，該液體培養基為含有20g/l的蔗 糖、750mg/l的氯化鎂(MgCL 6H20)、 2. 5mg/l的2， 4-D、 0.5mg/l的 BAP、 12.5mmol/l的脯氨酸的MS培養基，培養溫度25°C 30°C，光照 強度5 8|imol/m2/s，每天照光時間為14 20小時，培養2 3個星期。
6、 根據權利要求5所敘述的一種芒草的組織培養方法，其特征是 將胚狀體放入裝有35ml 40ml的液體培養基的器皿中，放在搖床上繼續 培育，2 3個星期之后轉移到新的培養基中，1 2mm大小的愈傷組織形 成后用常規的組織培養技術進行地上部分的誘導，該液體培養基為含有 20g/l的蔗糖、750mg/1的氯化鎂(MgCl2 '6H》)、2. 5mg/1的2， 4-D、0.5mg/1 的BAP、 12.5mmol/l的脯氨酸的MS培養基。
全文摘要
一種芒草的組織培養方法，本發明涉及植物的組織培養方法。本發明一種芒草的組織培養方法包括A、選取芒草頂端莖尖或根狀莖作為組織培養的外植體；B、對外植體進行處理；C、將外植體放入培養基中誘導出愈傷組織塊；D、將愈傷組織塊轉移到新的培養基中，生長成愈傷組織胚狀體；E、將產生的胚狀體移入新的培養基繼續培養；F、將形成的1～2毫米的愈傷組織胚狀體用常規的組織培養技術進行地上部分的誘導；G、將地上部分已誘導的小苗進行分離，進一步培養成苗。具有突出優點培養快速，從開始誘導傷愈組織，4～6個星期之后，胚狀體開始形成，8～10個星期之后，形態已經開始發生；經濟適用，每克傷愈組織可以再生500～1500個莖；能促進芒草的商業開發。
文檔編號A01H4/00GK101278651SQ20081006629
公開日2008年10月8日 申請日期2008年4月2日 優先權日2008年4月2日
發明者鄭炳松 申請人:王 俊