專利名稱：一種花生離體快速繁殖的方法
技術領域：
本發明涉及植物組織培養技術領域，具體涉及一種采用組織培養技術對花 生離體培養進行快速繁殖的方法。
背景技術：
植物組織培養技術日趨完善，并在科學研究與現代化農業生產中充分顯示 出其優越性。在農林作物的脫毒快繁、突變誘發、改革作物栽培、細胞工程和 基因工程育種以及種質保存等方面都發揮巨大的作用，是一項具有廣闊發展潛 力的高新技術。植株再生途徑常用離體的器官或組織，進行離體培養，經細胞 的脫分化、再分化誘導產生不定芽，不定芽逐漸伸長并生葉片形成試管苗后， 然后切成單株，在生根培養基上生根，形成完整植株。
目前通過組織培養對花生進行離體繁殖一般包括如下步驟
(1) 以上胚軸或子葉為外植體，采用已有技術對外植體表面進行消毒，
既用10~12質量％次氯酸鈉溶液在常溫下浸泡5~15分鐘，或采用75%乙醇和 0.1~0.2%升汞表面消毒各0.5~1分鐘和5~10分鐘；
(2) 將上述消毒后的外植體置于不定芽發生培養基中誘導不定芽發生(將 已經過表面消毒的外植體切成0.3 1厘米長的方塊，分別放在MS、B5或White 固體培養基中，10~20天誘導不定芽發生)；
(3) 選擇上述誘導后高度為0.1~0.5厘米不定芽組成的單個叢生芽團塊轉 移到芽伸長培養基上培養，促進不定芽伸長；
(4) 選擇上述高度為3~7厘米且有葉片的試管苗分切成單株，在加有0.1~5 mg/L的吲哚類或萘類生長素的生根固體培養基上培養生根。
在生根固體培養基上進行生根培養，即得再生幼苗。
現有技術中，以花生上胚軸或子葉為外植體，通過不定芽器官發生再生途 徑的適宜培養基分別為不定芽發生培養基MS+0.1mg/LTDZ+2mg/L6-BA; 芽伸長培養基MS+0.1mg/L4-PU+4mg/LBA;所述生根固體培養基的配制以 及生根培養條件采用本領域的通用配方及培養條件。
花生高效再生技術是遺傳轉化研究的基礎，以花生的上胚軸和中胚軸為外 植體，在植物生長物質6-BA和NAA的作用下，可誘導不定芽發生，但其發生 效率最高僅為10%左右(吳綺和韓碧文，花生(Ar"c/^卸/70g"eflL.)胚芽的離體 培養，實驗生物學報，1983， 16 (2): 119-131);在培養里添加細胞分裂素物 質6-芐基腺嘌呤(6-BA)和TDZ提高花生上胚軸的不定芽發生頻率達到80.0免 (何紅衛和賓金華，花生上胚軸的叢生芽誘導和植株再生[J].華南農業大學學 報自然科學版,2003， 24(3):46-49;張斌,范仲學，柳絮,秦嶺,李長生，畢玉平.花生再 生體系的建立[J].安徽農業科學，2006,34 (15): 3590-3592),但是，在芐基腺 嘌呤(6-BA)和TDZ誘導不定芽發生過程中，外植體接近培養基面的組織常 出現黑色，影響了不定芽的伸長，其生長極其緩慢，甚至長時期處于芽點狀態。
一般用于促進植物器官組織不定芽發生的植物生長物質有細胞分裂素類 物質6-BA (6-節基腺嘌呤)、4-PU (4-吡效隆)和TDZ (噻唑隆)，以及生長 素類物質(IAA吲哚乙酸，NAA萘乙酸)；這些物質處理的方法是將一定濃 度的物質溶解后，加入培養基中，培養材料按照常規方法進行表面消毒后，放 置培養基中，在弱光、27"C條件下培養。
現有的花生離體培養技術中，對植物生長物質要求濃度比較高，有些還需要專用設備，成本高，操作復雜，而且培養效果不太好，不利于大規模推廣。
發明內容
本發明的目的在于針對現有技術的不足，提供一種能提高出芽率和芽伸長 的花生離體快速繁殖的方法，該方法操作簡便、效果好。 本發明的上述目的是通過如下方案予以實現的
本發明針對現有技術中通過組織培養對花生進行離體繁殖，所常采用的
(1)外植體表面消毒、(2)誘導不定芽發生、(3)芽伸長培養和(4)生根培
養這四步，進行了如下改進，從而使得花生離體繁殖的操作更加簡單，效果更
加好
1. 對歩驟(2)中的不定芽發生培養基，本發明改進后的配方為在MS
培養基和/或B5培養基中加入了 0.0001~0.006mg/mL細胞分裂素類物質，該不 定芽發生培養基的pH為6.0，所述MS培養基和/或B5培養基可以為固體培 養基也可以為液體培養基，所述細胞分裂素類物質為6-BA (6-芐基腺嘌呤)、 4-PU (4-吡效隆)或TDZ (噻唑隆)中的兩種或兩種以上。
2. 對步驟(3)中的芽伸長培養基，本發明改進后的配方為在1/2MS培 養基和/或MS培養基中加入0.0005~0.003mg/mL赤霉素和/或細胞分裂素類物 質，該芽伸長培養基的pH=6.0，所述細胞分裂素類物質為6-BA、 4-PU和TDZ 中的一種或多種，所述赤霉素(GA)是指具有赤霉烷骨架，能夠剌激細胞分 裂和伸長的一類化合物的總稱，本發明可選擇赤霉素中的任意一種，起到調節 細胞分裂和伸長的作用；
3. 對步驟(2)中誘導不定芽發生的培養條件改進為將上胚軸或子葉消 毒后，置于改進后的不定芽發生培養基中，在25士2'C,光照強度為2000-3000勒科斯的條件下靜止培養7~10天。
本發明的MS培養基，1/2MS培養基，B5培養基都是本領域通用的，其 配制方法都是本領域技術人員所共知的。
本發明的進一步優化改進方案是
1. 對上述步驟(2)中不定芽發生培養基的配方做進一步優化，則不定芽 發生培養基配方為向MS培養基中加入(0.0001~0.0008mg/mL)的4-PU和
(0.001-0.006 mg/mL)的6-BA，該不定芽發生培養基的pH為6.0;
2. 對上述步驟(3)中芽伸長培養基的配方做進一歩優化，則芽伸長培養 基配方為1/2MS培養基和/或MS培養基中加入0.0005~0.003mg/mL的赤霉素 或0.001~0.003mg/mL的細胞分裂素類物質，所述芽伸長培養基的pH為6.0， 所述赤霉素類物質為任意一種，所述細胞分裂素類物質為6-BA、 4-PU和TDZ 中的一種或多種。
本發明的更佳改進方案是
1. 步驟(2)中不定芽發生培養基的配方最好是在MS培養基中加入 (0.0002~0.0006 mg/mL)的4-PU和(0.002~0.005mg/mL)的6-BA，該不定
芽發生培養基的pH為6.0;
2. 步驟(3)中芽伸長培養基的配方最好是在1/2MS培養基中加入 (0.0005~0.002 mg/mL)的赤霉素，或在MS培養基中加入(0.001~0.003
mg/mL)的6-BA，該芽伸長培養基的pH-6.0;
3. 步驟(2)中誘導不定芽發生的光照強度為2500勒科斯。
4. 步驟(3)中的芽伸長培養條件為在25±2°C、光照強度為2000~3000 勒科斯的條件下靜止培養培養9~12天。與現有技術相比，本發明具有如下有益效果
1. 本發明采用4-吡效隆作為主要成分，促進植物組織發生不定芽，與已 有促進不定芽發生的物質相比，作用濃度低，效果顯著，方法簡便，避免了生 芽過程中外植體基部出現黑色，促進不定芽高質量生長；
2. 本發明方法與已有促進不定芽伸長的方法相比，無需增加專用設備， 赤霉素與細胞分裂素類使用濃度小，成本低，伸長培養所需時間短且效果顯著。
具體實施例方式
下面結合實施例對本發明進行進一步的說明。 實施例1
本實施例的花生離體快速繁殖方法，其具體步驟如下
(1) 將花生上胚軸用10質量％次氯酸鈉溶液在常溫下浸泡5分鐘，表面 消毒；
(2) 配制不定芽發生培養基(MS固體培養基中加入0.0006 mg/mL 4-PU 和0.005 mg/mL 6-BA， pH 6.0)將上述消毒后的花生上胚軸置于該不定芽發 生培養基內，在25±2°C、光照強度為2000勒科斯的條件下靜止培養9天；
(3) 配制芽伸長培養基(在MS固體培養基中加入0.003 mg/mL赤霉酸G A3， pH6.0)，將生芽后的上胚軸置于該芽伸長培養基中，在25±2°C、光照 強度為2000勒科斯的條件下培養12天；
(4) 生根培養得到幼苗。
以花生上胚軸在不含4-PU 、 6-BA和其他任何激素的MS固體培養基培 養為對照組，不定芽發生率為10.3%,經本方法培養的上胚軸接近培養基面的 組織不出現黑色，不定芽發生率為52.2%，芽點致密；經MS+0.003 mg/mL GA3芽伸長培養基培養后，芽長度平均為1.2厘米。而對照組只有0.4厘米。 實施例2
本實施例的花生離體快速繁殖方法，其具體步驟如下.-
(1)將花生子葉用11質量％次氯酸鈉溶液在常溫下浸泡8分鐘，表面消
毒；
(2)配制不定芽發生培養基(1/2MS培養基中加入0.0006 mg/mL 4-PU 和0.002 mg/mL6-BA， pH6.0)將上述消毒后的花生子葉置于該不定芽發生培 養基內，在25土2。C、光照強度為3000勒科斯的條件下培養9天；
(3) 配制芽伸長培養基(在MS固體培養基中加入0.003 mg/mL 6-BA， p H 6.0)，將生芽后的子葉置于該芽伸長培養基中，在25±2°C、光照強度為2 000勒科斯的條件下培養12天；
(4) 生根培養得到幼苗。
花生子葉在不含4-PU、 6-BA和其他任何激素的1/2MS固體生芽培養基 培養9天，不定芽發生率為12.1%,經本方法培養的上胚軸接近培養基面的組 織不出現黑色，不定芽發生率為72.2%。經加有0.003 mg/mL 6-BA的MS固 體培養基(伸長培養基)培養后，芽長度平均為1.6厘米，而對照只有0.5厘米。
實施例3
本實施例的花生離體快速繁殖方法，其具體步驟如下
(1)將花生子葉用12質量免次氯酸鈉溶液在常溫下浸泡5分鐘，表面消
毒；
(2)配制不定芽發生培養基(B5培養基中加入0.0002 mg/mL 4-PU和0.005mg/mL6-BA， pH6.0)將上述消毒后的花生子葉置于該不定芽發生培養基內， 在25土2X:、光照強度為3000勒科斯的條件下培養10天；
(3) 配制芽伸長培養基(在MS固體培養基中加入0.001 mg/mL 6-BA， p H6.0),將生芽后的外植體置于該芽伸長培養基中，在在25土2X:、光照強度 為2500勒科斯的條件下培養12天；
(4) 生根培養得到幼苗。
花生子葉在不含4-PU 、 6-BA和其他激素的MS固體生芽培養基培養9 天，不定芽發生率為16.1%，經本方法培養的子葉不定芽發生率為85.2%，接 近培養基面的組織不出現黑色；經0.001 mg/mL 6-BA的MS固體培養基(伸 長培養基)培養后，芽長度平均為2.1厘米，而對照只有0.8厘米。
實施例4
本實施例的花生離體快速繁殖方法，其具體歩驟如下
(1)將花生上胚軸用10質量％次氯酸鈉溶液在常溫下浸泡6分鐘，表面 消毒；
(2)配制不定芽發生培養基(MS培養基中加入0.0002 mg/mL 4-PU和0.002 mg/mL 6-BA， pH 6.0 )將上述消毒后的花生上胚軸置于該不定芽發生培養基內， 在25士2。C、光照強度為2000勒科斯的條件下培養10天；
(3) 配制芽伸長培養基(在MS固體培養基中加入0.001 mg/mL GA3， p H 6.0)，將生芽后的上胚軸置于該芽伸長培養基中，在25±2°C、光照強度為 2000勒科斯的條件下培養12天；
(4) 生根培養得到幼苗。
花生上胚軸在不含4-PU 、6-BA和其他激素的MS固體生芽培養基培養9天，不定芽發生率為18.1%,經本方法培養的上胚軸不定芽發生率為93.6%， 接近培養基面的組織不出現黑色，芽體呈白色；經0.001 mg/mL GA3的MS固 體培養基(伸長培養基)培養后，芽長度平均為2.5厘米，而對照只有0.7厘 米。
權利要求
1、一種花生離體快速繁殖的方法，包括如下步驟(1)對外植體表面進行消毒；(2)消毒后的外植體置于不定芽發生培養基中誘導不定芽發生；(3)將誘導后不定芽組成的單個叢芽轉移到芽伸長培養基上繼續培養；(4)生根培養；其特征在于所述步驟(2)中的不定芽發生培養基是在MS和/或B5培養基中加入0.0001～0.006mg/mL細胞分裂素類物質，pH6.0；所述步驟(3)中的芽伸長培養基是在1/2MS培養基和/或MS培養基中加入0.0005～0.003mg/mL赤霉素和/或細胞分裂素類物質，pH6.0。
2、 根據權利要求1所述花生離體快速繁殖的方法，其特征在于步驟(2) 中所述細胞分裂素類物質為6-芐基腺嘌呤、4-吡效隆或噻唑隆中的兩種或兩種 以上；步驟(3)中所述細胞分裂素類物質為6-芐基腺嘌呤、4-吡效隆和噻唑 隆中的一種或多種。
3、 根據權利要求1所述花生離體快速繁殖的方法，其特征在于所述步驟 (2)中不定芽發生培養基配方為MS培養基中加入O.OOOl 0.0008mg/mL4-吡效隆和0.001W.006mg/mL6-芐基腺嘌呤；所述步驟(3)中的芽伸長培養基是 在1/2MS培養基和/或MS培養基中加入0.0005~0.003mg/mL赤霉素或 0.001~0.003 mg/mL細胞分裂素類物質。
4、 根據權利要求3所述花生離體快速繁殖的方法，其特征在于所述步驟 (2)中不定芽發生培養基配方是在MS培養基中加入0.0002 0.0006mg/mL4-吡效隆和0.002 0.005mg/mL6-芐基腺嘌呤；所述步驟(3)中芽伸長培養基的 配方是在1/2MS培養基中加入0.0005~0.002mg/mL赤霉素，或在MS培養基 中加入0.001 0.003mg/mL6-節基腺嘌呤。
5、 根據權利要求1的花生離體快速繁殖的方法，其特征在于所述步驟(2)的不定芽誘導培養條件為25±2°C，光照強度為2000~3000勒科斯的條件下靜 止培養7 10天。
6、 根據權利要求1的花生離體快速繁殖的方法，其特征在于所述步驟(3) 中芽伸長的培養條件為25±2°C、光照強度為2000~3000勒科斯的條件下靜止 培養培養9 12天。
7、 根據權利要求5的花生離體快速繁殖的方法，其特征在于所述步驟(2) 的培養光照強度為2500勒科斯。
全文摘要
本發明公開一種花生離體快速繁殖的方法，該方法是在現有組織培養花生離體繁殖所包括的如下四個步驟(1)外植體表面消毒、(2)誘導不定芽發生、(3)不定芽伸長培養和(4)生根培養的基礎上，對步驟(2)中的不定芽發生培養基以及誘導不定芽培養條件和步驟(3)中的芽伸長培養基以及培養條件進行了優化改進。本發明采用4-吡效隆作為主要成分，促進植物組織發生不定芽，與已有促進不定芽發生的物質相比，作用濃度低，效果顯著，在不定芽發生過程中外植體接近培養基面的組織不會出現黑色，促進芽生長。本發明方法與已有促進不定芽伸長的方法相比，無需增加專用設備，赤霉素與細胞分裂素類使用濃度小，成本低，伸長培養所需時間短且效果顯著。
文檔編號A01H4/00GK101411305SQ20081021940
公開日2009年4月22日 申請日期2008年11月25日 優先權日2008年11月25日
發明者璨 劉, 玲 李, 銘 覃 申請人:華南師范大學