專利名稱：一種可抑制水中游離或成膜微藻的微生物抑藻劑及制備方法
技術領域：
本發明涉及微生物學和生物技術，特別是一種用于抑制水體中微藻生長的微生物抑藻劑及該抑藻劑的制備方法。
背景技術：
微型藻類(微藻類)大量生長導致嚴重的經濟社會問題。微藻類可以以兩種形式存在懸浮(浮游生物)形式或者生物膜(“墊子”)形式。這兩種形式的微藻類的生理生化特征差異很大。工業生產、家庭生活和農業生產產生的污水未經處理即排放導致了自然界的水體污染，引起各類微藻的生長，其中首當其沖就是藍綠細菌(藍細菌)的大量生長。水體中大量微藻類生長會導致嚴重的環境災難性后果，如形成三維結構的生物膜(“墊子”)， 即水華。水華發生后可伴隨著大量微藻死亡、毒素積累、氧氣消耗方式的改變和腐敗氣味的出現。微藻類膜的各種成分在分解和腐爛的過程會伴隨著一些毒素化合物(例如酚類、吲哚和糞臭素等)的釋放，而大量微藻類死亡可導致水中氧氣不足從而引起大量好氧微生物死亡以及魚類死亡。某些微藻類甚至可產生多種特有的毒素，包括神經毒素和肝毒素，對人和動物健康造成極大危害。目前還沒有發現或研究出針對微藻類毒素的解毒劑。微藻類還會引起諸多過敏性疾病。與全球氣候變暖相關的全球性微藻類循環已帶來世界性難題。由微藻過度生長引起重大的經濟損失和微藻類毒素對環境的影響都迫切要求我們采取措施抑制微藻類過度生長和監測水生生態系統。目前已有多種物理、化學和生物方法來抑制微藻類生長。紫外照射、超聲和水電解都被用于產生抑制微藻類生長的條件，包括干擾微藻類生長或破壞已形成的微藻類群落(“墊子”)。對有水華的水體進行紫外照射和超聲處理相當有效，但它們會導致包括PH降低、水體中總氮、磷的含量減少和水溫升高等不良后果。 另外，水電解成本太高，且不宜大規模應用。化學除草劑(如敵草隆、西瑪律、阿特拉嗪等)可減少藻類數量，但對水體和生物共生的負面影響實際上排除了其應用的可能性。這些負面影響包括缺乏選擇性、致命、致突變和致畸效應。利用細菌及其代謝產物開發的生物抑藻劑可抑制水體中的微藻類生長，研究證明這個方法是可行的。現在已發現某些菌株可抑制微藻類生長，但源于細菌的微生物抑藻制劑未見報道。發明目的本發明的目的在于獲得一種可以抑制水體中各種形式微藻生長的微生物抑藻劑。本發明的另一目的在于獲得一種由活力因子——側孢芽孢桿菌VKPMB-10531 [拉丁文名稱Brevil3acillus Iaterosporus 16-336 ；保藏單位俄羅斯國家工業微生物保藏中心(簡稱VKPM)；地址俄羅斯聯邦莫斯科多羅日1號胡同1號；保藏日期2010年2月 25日；保藏編號VKPM B-10531]與膨脹珍珠巖顆粒載體組成的微生物抑藻劑“Algaelat”的制備方法，其初始質量比為4 1，經干燥制備完成后質量比為3 2。Algaelat可抑制水環境中浮游微藻生長及微藻生物膜的形成。發明人經過研究獲得了微生物抑藻劑Algaelat制備方法首先、對側孢芽孢桿菌VKPM B-10531進行培養，將側孢芽孢桿菌VKPM B-10531在 NBY培養基中培養；其所用培養基組分(質量比％ )為營養肉湯0. 8 ；酵母提取物0. 3 ；適量的水；制備固體瓊脂培養基時，添加2. 0%瓊脂于NBY液體培養基中。其次，選擇合適的固定活力因子的載體；經過反復研究選用膨脹珍珠巖顆粒為固定Algaelat活力因子(即側孢芽孢桿菌VKPM B-10531培養物)的載體。珍珠巖顆粒源于經900-1200°C高溫加工的天然巖石，具有質輕、多孔、珍珠白等特性，顆粒大小約 0. 16-0. 25mm，堆積密度為75到100-150kg/m3。膨脹珍珠巖顆粒是一種天然材料，具有開發微生物抑藻劑所必須的特性無菌、化學惰性、質輕、快速處理、不可燃、不被生物分解、無污染。珍珠巖砂不易被分解，透氣性、透水性好，吸收能力強，可吸收400%重量的水。膨脹珍珠巖顆粒具有良好的浮力特性，這使微生物抑藻劑可長期保持在水體表面，從而使其長期保持活力。第三，微生物抑藻劑Algaelat的組成選用側孢芽孢桿菌發酵液和固定載體膨脹珍珠巖顆粒組成，發酵液包括芽孢、營養細胞(8X108到l-2X109cfu/ml)和代謝產物。微生物抑藻劑Algaelat具有易儲存、運輸、體積穩定、不可壓縮使其在水中表現出殺藻活性的優點。
具體實施例方式下面結合實施例進一步詳細說明本發明，但不應理解為是對本發明的限制。實施例1殺藻菌側孢芽孢桿菌的培養將50-100ml NBY培養基(pH7. 0)在120°C、0. 8個大氣壓下滅菌30min后，置于 750ml無菌細口瓶，冷卻至20°C。側孢芽孢桿菌接種于培養基后30°C、250rpm/min培養16h， 獲培養物5-10ml。鏡檢確保無污染，培養產物濃度通過瓊脂培養基檢查，細胞數目應達到 109cfu/mlo實施例2微藻培養對有無固氮能力的微藻均適用。固氮微藻菌株采用Anabaena sp. 5781 (來自列寧格勒州立大學)和Nostoc sp. A-IO (來自IMET菌種保藏中心)。微囊藻Microcystis aeruginosa 562和905菌株購于中科院水生生物研究所(中國武漢)。Anabaena和Nostoc 用改良培養基BG-Il培養，M. aeruginosa 562和905則用B-12培養基培養。微藻在加有 IOOml培養基的250ml細口瓶中培養，培養條件20°C密閉培養、連續光照2周。LBU-30白日光燈提供40 μ Hi0InT2s-1PAR的光照。實施例3抑藻劑的制備按照實施例1培養后的側孢芽孢桿菌發酵液與膨脹珍珠巖顆粒(質量比為25% ) 混合后在40°C干燥16h。所得粉末在室溫儲存于密閉容器中，以防吸濕。實施例4實驗室條件下測定Algaelat的殺藻活力Algaelat 力口入至Ij Nostoc、Anabaena 或 Microcystis 的培養物中，室溫 96h 內測定其殺藻活力。Algaelat與培養物比例為1 5。殺藻活力由殘留培養混合物在590nm下吸光度值計算得到(ODR) = (0DT/0D0) X 100ODO 起始時刻的吸光度值；ODT 培養T小時后的吸光度值由于微藻會產生一些色素(葉綠素、類胡蘿卜素、青色素)，殺藻活力也可根據培養混合物顏色的變化來評價。培養混合物褪色表明微藻溶解。微藻溶解也可通過顯微鏡確認。表1實驗室條件下Algaelat對不同藻類的殺藻活力
權利要求
1.一種可抑制水中游離或成膜微藻的微生物抑藻劑，由側孢芽孢桿菌發酵液與載體膨脹珍珠巖顆粒混合吸附后組成。
2.如權利要求1所述的微生物抑藻劑，其特征在于側孢芽孢桿菌發酵液與載體膨脹珍珠巖顆粒按照質量比4 1的比例混合，干燥后質量比為3 2。
3.如權利要求1所述的微生物抑藻劑的制備方法，其步驟如下1)將50-100mlNBY培養基(pH7. 0)在120°C、0. 8個大氣壓下滅菌30min后，置于 750ml無菌細口瓶，冷卻至20°C;側孢芽孢桿菌接種于培養基后30°C、250rpm/min培養16h， 獲培養物5-10ml ；鏡檢確保無污染，培養產物濃度通過瓊脂培養基檢查，細胞數目應達到 109cfu/ml ；2)前述培養后的側孢芽孢桿菌發酵液與膨脹珍珠巖顆粒(質量比為25%)混合后在 40°C干燥16h，所得粉末在室溫儲存于密閉容器中，以防吸濕。
4.如權利要求1所述的微生物抑藻劑，其用于抑制浮游狀的藍綠藻(藍細菌)中的念珠藻、魚腥藻和微囊藻的用途。
全文摘要
本發明公開了一種可抑制水中游離或成膜微藻的微生物抑藻劑Algaelat，它可抑制水中浮游微藻的生長及微藻生物膜的形成；本發明還公開了該微生物抑藻劑Algaelat由側孢芽孢桿菌VKPM B-10531與膨脹珍珠巖顆粒載體混合組成，其初始質量比為4∶1，干燥制備完成后質量比為3∶2；該微生物抑藻劑Algaelat可抑制浮游微藻生長及微藻生物膜形成，導致水體顏色褪變，直至褪色；顯微鏡觀察發現微藻細胞出現溶解；Algaelat的殺藻活力通過殘余光密度值檢測發現對Algaelat最為敏感的是浮游狀的念珠藻、魚腥藻和微囊藻，它們屬于藍綠藻(藍細菌)；Algaelat對生物膜的完全裂解需要更長時間。
文檔編號A01P13/00GK102308852SQ20101021453
公開日2012年1月11日 申請日期2010年7月1日 優先權日2010年7月1日
發明者馮甦, 孫群, 安拉托尼·庫澤, 張 杰, 納塔利亞·庫澤那塔索娃, 魯道夫·阿澤貝卡亞 申請人:俄羅斯國家工業微生物遺傳和育種科學研究所, 四川大學