專利名稱：絞股藍皂甙用于減少動物瘤胃內甲烷產生的方法
技術領域：
本發明涉及絞股藍皂甙用于減少動物瘤胃內甲烷產生的方法，屬于添加劑的使用 方法，用于反芻動物的飼養，諸如奶牛，肉牛，山羊和綿羊等，減少瘤胃甲烷生成，提高飼料 能量利用，緩解反芻動物養殖中反芻動物瘤胃發酵產甲烷對環境的污染。
背景技術：
近幾個世紀，僅次于二氧化碳的甲烷有明顯的提高，是人類活動產生的第二種重 要溫室氣體。自18世紀工業革命以來，人類活動及人口的迅速增長，特別是農業、化石燃料 的使用及廢物的處理，使甲烷釋放量呈倍數增加。目前大氣層中甲烷濃度已達1774ppb，每 年有5 5. 5億噸甲烷進入大氣，遠遠超過了大氣反應和土壤微生物利用所能消耗的總和， 導致甲烷氣體每年以0.9%的速度遞增，高于二氧化碳的0.5% (IPCC，1992)。預測今后50 年內甲烷可引起15 17%的溫室效應(IPCC，1992)。大氣甲烷濃度的逐漸升高引起研究 人員對其來源和沉積的研究，近年來生物學家也開始對甲烷釋放產生興趣。減少甲烷氣體的排放量，需從各個方面采取緩解措施，如從工業，農業，能量和家 庭起居生活入手。農業所產甲烷占人類活動甲烷總產量的三分之二(IPCC，1995)，其中，反 芻動物瘤胃發酵所產甲烷約占人類活動總產量的22%，是全球甲烷總排放量的15%。農業 甲烷排放最為重要的來源是反芻動物瘤胃及其排泄物釋放的甲烷。瘤胃內棲息著多種多樣的微生物，形成一個十分復雜的微生態系統，特別是細菌， 原蟲及一些真菌共同降解植物聚合物成為揮發性脂肪酸(瘤胃主要的能源)，H2和二氧化 碳。其中H2被產甲烷古菌用作能量來還原二氧化碳，形成甲烷。據估計，每頭牛每天產生 250 500升的甲烷(Johnson和Johnson，1995)，全球13億頭牛所產甲烷占家畜甲烷總 產量的73% 80% (Johnson, 1994)。對于反芻動物來說，甲烷作為飼料能量損失被釋放 到大氣中。由于反芻家畜甲烷產量大，且動物群體數量多，因此，反芻動物甲烷產量是一個 不可忽視的因素。反芻動物甲烷的排放不僅引起飼料能量的損失(甲烷可占總能的2% 12% )，且造成環境污染。調控反芻動物瘤胃活動來減少甲烷釋放成為減少甲烷排放的一種 途徑。瘤胃中大約有9 25%瘤胃產甲烷菌與原蟲共生，并產生相應部分的甲烷。植物 皂甙作為抗生素促生長劑的替代品在飼料中得到廣泛應用，用于調控瘤胃微生物發酵和減 少甲烷釋放，提高瘤胃的飼料利用效率。原蟲對皂甙的敏感性被認為是植物皂甙能夠與細 胞膜中的膽固醇結合，導致細胞膜完整性喪失，最終導致細胞死亡。原蟲數量下降，引起與 其共生的產甲烷菌及瘤胃甲烷產量的下降，這種調控反芻動物甲烷釋放的機制引起人們的 興趣。目前，國內外已對絞股藍皂甙在中醫藥領域的應用有了廣泛的研究，且作為飼料 添加劑在單胃動物養殖中已開始應用，如豬、雞等。作為飼料添加劑用于調控反芻動物瘤胃 微生物發酵，減少反芻動物瘤胃微生物甲烷產生的作用效果尚未報道。
發明內容
技術問題本發明的目的是提供一種簡單、可靠的方法減少反芻動物瘤胃內甲烷的產生，提 高飼料能量利用效率，緩解來自反芻動物瘤胃甲烷氣體對環境的污染。該天然植物提取物 可以在反芻動物正常飼養過程中使用，符合綠色飼料添加劑要求。技術方案本發明是采用體外試驗和動物試驗，結合PCR/DGGE和Real time PCR技術，分析 絞股藍皂甙對反芻動物瘤胃甲烷產量和微生物區系的影響，最終確定絞股藍皂甙可以用作 反芻動物瘤胃微生物發酵的調控劑，以減少甲烷產生，提高飼料能量利用率，緩解甲烷對大 氣環境的污染。本發明所提供絞股藍皂甙用于減少動物瘤胃內甲烷產生的方法為，其特征在 于，使用絞股藍皂甙，按0. 05-0. 30g/kg. B. W劑量即基于每公斤反芻動物體重，每天添加 0. 05-0. 30g絞股藍皂甙，每天分早晚兩次拌料飼喂。有益效果絞股藍皂甙作為反芻動物特種飼料添加劑，屬于新的生物技術。絞股藍皂甙作為 抑菌、殺菌和消炎等作用。根據研究發現，絞股藍皂甙對瘤胃原蟲產生毒性作用，減少原蟲 數量，進而減少與其共生產甲烷菌數量，達到減少甲烷的合成，降低甲烷釋放造成的能量損 失，提高飼料能量利用效率，緩解甲烷對大氣環境的污染。結果表明，添加低劑量絞股藍皂 甙(10mg/60mL培養液)能夠提高瘤胃微生物揮發性脂肪酸產量，對甲烷產量有顯著的抑制 作用。耐受性試驗中，利用產甲烷菌特異性引物擴增的PCR產物進行DGGE分析顯示，絞股 藍皂甙改變了產甲烷菌的區系，一些優勢產甲烷菌消失。與對照組比較，絞股藍皂甙組產甲 烷菌數量降低50%以上，瘤胃原蟲降低27%。添加絞股藍皂甙降低了與原蟲共生產甲烷菌 數量，且對瘤胃液中游離產甲烷菌產生抑制作用。同時絞股藍皂甙組的真菌數量提高50% 以上，黃化瘤胃球菌近3倍，產琥珀酸絲狀桿菌32%，說明絞股藍皂甙對幾種纖維降解菌有 促進作用。血液生化指標結果顯示，如血糖，膽固醇，甘油三酯，血液尿素氮和血清總蛋白都 沒有發生顯著變化，表明該皂甙可作為反芻動物添加劑使用，符合綠色飼料添加劑要求，對 動物無毒副作用。本發明中技術使用方便，使用效果好。本發明具有降低反芻動物瘤胃微生物甲烷 生成，提高飼料能量利用率，降低甲烷對環境的污染，保護地球生態環境的重要意義。
四
圖1添加絞股藍皂甙后山羊瘤胃產甲烷菌區系的DGGE圖譜圖中箭頭所示為皂甙處理后產甲烷菌消失條帶。圖中A，B，C和D代表4只山羊；M，marker ；1，2，3和4，代表對照及三個處理組。圖2添加皂甙后六次傳代培養液中產甲烷菌區系的DGGE圖譜圖中箭頭所示為皂甙處理后產甲烷菌消失條帶。G0-G6，傳代次數；C和T，對照組和處理組。五具體實施例方式絞股藍皂甙來自陜西康威生物工程有限公司產品，含量彡98%。下面結合實施例對本發明作進一步描述。實施例1 絞股藍皂甙對山羊瘤胃微生物數量的影響4只一歲、體重約為30士2kg的具有瘤胃瘺管的波爾公山羊，采用4X4拉丁方試驗 設計。整個試驗期為64天，分4期。每期16天，11天預試期，5天采樣期。處理組絞股藍 皂甙的添加量每天為0. 067,0. 133和0. 267g/kg. B. W，對照組不添加絞股藍皂甙，分早晚兩 次飼喂。早晨飼喂前采集瘤胃液，提取總DNA，利用黃化瘤胃球菌、產琥珀酸絲狀桿菌和真 菌的特異性引物(Denman SE，et al. ,2006. Development of a real-time PCR assay for monitoring anaerobic fungal and cellulolytic bacterial populations within the rumen. FEMS Microbiol Ecol，58，572-582)及產甲燒菌的特異性引物(Denman SE，et al.， 2007.Quantitation and diversity analysis of ruminal methanogenic populations in response to the antimethanogenic compound bromochloromethane. FEMS Microbiol Ecol,62, 313-322)對微生物進行定量分析，4對引物擴增的片段長度分別為132，121，120 和140bp。利用血細胞計數板對原蟲進行計數。利用產甲烷的特異性引物519/915(Cheng YF,et al. ,2009. Molecular diversity analysis of rumen methanogenic archaea from goat in eastern China by DGGE methods using different primer pairs. Letters in Applied Microbiology, 48 585-592)結合DGGE技術對山羊瘤胃產甲烷菌區系進行分析， 此引物擴增片段長度為400bp左右。飼喂前和飼喂后3h頸靜脈采血并析出血清，分析相關 血液生化指標。試驗結果見表1，與對照組比較，其中0. 067g/kg. B. W組產甲烷菌數量下降50%以 上，瘤胃原蟲下降27%，結果顯示添加絞股藍皂甙降低了與原蟲共生產甲烷菌數量及瘤胃 原蟲數量。0. 067g/kg. B. W組瘤胃真菌數量提高50%以上，黃化瘤胃球菌提高近3倍，產琥 珀酸絲狀桿菌提高32%，結果說明添加低劑量絞股藍皂甙可促進瘤胃主要纖維降解菌的增 殖，從而在一定程度上影響甲烷生成前體氫的供應量。高劑量組(0. 133g/kg.B.W和 0. 267g/kg. B. W)對真菌和纖維降解菌產生顯著的抑制作用，說明高劑量組可抑制甲烷生 成前體一一氫的形成。DGGE圖譜上代表不同種優勢產甲烷菌的條帶發生變化(擴增16S rRNA片段的堿基長度相似，但堿基存在差別，在DGGE膠上處在不同位置，代表不同的產甲 烷菌)，其中5條優勢產甲烷菌消失(如圖1中箭頭所示)。對山羊血液生化指標沒有顯著 影響，見表2。表明低劑量絞股藍皂甙(0. 067g/kg. B. W)可抑制瘤胃原蟲和產甲烷菌數量， 同時促進纖維降解真菌與細菌的生長，對山羊正常的生理代謝無負面影響。實施例2 絞股藍皂甙對瘤胃微生物甲烷生成的影響早晨飼喂前通過瘤胃瘺管采集波爾山羊瘤胃液，四層紗布過濾后作為接種物，瘤 胃液與已預熱的厭氧微生物培養基按1 2的比例混合，成為培養液。(培養基由微量 元素A液，緩沖液B，緩沖液C，D液和還原劑溶液E組成。其中A液為每IOOmL蒸餾水中 加 Λ CaCl2 · 2Η20 13. 2g, MnCl2 · 4H20 10. Og, CoCl2 · 6Η201· Og, FeCl3 · 6H20 8. Og, B 液 為IL蒸餾水中加入NH4HCO3 4. 0g, NaHCO3 35. 0g, C液為IL蒸餾水中加入Na2HPO4 5. 7g， KH2PO4 6. 2g，MgSO4 · 7H20 0. 6g，D液為0. 的刃天青溶液，E液為每IOOmL蒸餾水中加入 鹽酸半胱氨0. 625gNa0H160mg, Na2S · 9H20 0. 625g。培養基配制過程:400mL蒸餾水中加入0. ImL溶液A，200ml溶液C，Iml刃天青溶液，用CO2飽和保存于39°C恒溫水浴箱中5_6 小時，再加入40ml還原劑溶液E，混勻，用CO2飽和，并加熱至39°C )。采用厭氧體外批次 培養技術(Theodorou MK, et al. , 1995. Determination of growth of anaerobic fungi on soluble and cellulosic substrates using a pressure transducer. Microbiology, 141，671-678)進行體外發酵，厭氧條件下將培養液60mL分裝到已加入底物及絞股藍皂甙 的發酵瓶中后，密閉。底物0.6g，由粗料和精料按7 3組成(即0.42g羊草和0. 18g精 料)，精料由玉米和豆粕按7 3組成(即0. 126g玉米和0.054g豆粕)，試驗組絞股藍皂 試添加量分別為5，10，20和40mg，對照組不添加絞股藍皂甙，39°C發酵24小時，利用氣相色 譜儀測定發酵氣體中的甲烷濃度。試驗結果，絞股藍皂甙處理組甲烷濃度分別下降2. 3%，9. 4%，6. 9%和20. 7%。實施例3 絞股藍皂甙對多次傳代后產甲烷菌區系的影響利用體外批次培養技術進行發酵，培養基配制及底物的量和比例同實施例2。在厭 氧條件下向已加入底物和絞股藍皂甙的發酵瓶中分裝50mL培養基，試驗組絞股藍皂甙添 加量分別為5、10和20mg，對照組不添加絞股藍皂甙，密閉121°C滅菌15min。39°C條件下6 次傳代培養，第一代接種物為早晨飼喂前四層紗布過濾的波爾山羊瘤胃液10ml，后5代接 種物依次為上代發酵24h的無污染發酵液IOml (接種物與培養基的比例是1 5)。每代發 酵結束時，采集發酵液提取總DNA，禾Ij用產甲烷菌特異性引物519/915和DGGE技術分析對照 組和20mg組產甲烷菌區系(同實施例1)。試驗結果，經過6次傳代，絞股藍皂甙處理組產甲烷菌的區系產生很大的變化，7 條優勢產甲烷菌條帶從DGGE圖上消失(如圖2中箭頭所示)，表明絞股藍皂甙能夠抑制產 甲烷菌。以上結果表明，絞股藍皂甙能夠降低反芻動物瘤胃甲烷生成，改變瘤胃產甲烷菌區 系，一些優勢產甲烷菌消失。表1絞股藍皂甙對山羊瘤胃微生物數量的影響
黃化瘤胃球菌(X103)0. 3741.0540. 1990. 2500.1450.130. 3330. 269產琥珀酸絲狀桿菌(X10_3)1. 2931.7130. 2580. 1890.216<0.010. 0110. 545真菌(X103)0. 2710. 6330. 2580. 1220.0840.170. 2690. 136產甲烷菌0. 5810. 2030. 2290. 2270.0450.020.0450. 242原蟲總數(105/ml)9. 668. 397.617. 020,.03<0.01<0.010. 57
注τ，顯著性；L，線性效應；Q，二次方效應t 表2絞股藍對山羊血液生化指標的影響指標
時間 皂甙劑量(g/d. kg體重)
顯著性lvalue 注T，顯著性；L，線性效應；Q，二次方效應
權利要求
絞股藍皂甙作為減少反芻動物瘤胃內甲烷產生的飼用添加劑的應用。
2.根據權利要求1所述絞股藍皂甙作為降低瘤胃內甲烷產生的飼料添加劑的應用，其 特征在于來源于各類植物提取的絞股藍皂甙。
3.根據權利要求1或2所述的絞股藍皂甙作為降低瘤胃發酵產甲烷的飼料添加 劑的應用，其特征在于所述的絞股藍皂甙的用量為，按每公斤反芻動物體重每天添加 0. 05-0. 30g絞股藍皂甙，分兩次早晚拌料飼喂。
全文摘要
本發明涉及絞股藍皂甙用于減少動物瘤胃內甲烷產生的方法，屬于添加劑的使用方法，按每公斤體重添加0.05-0.30克絞股藍皂甙，每天分早晚兩次拌料飼喂。添加絞股藍皂甙改變了山羊瘤胃產甲烷菌區系，一些產甲烷優勢菌在皂甙處理后消失，產甲烷菌數量下降50％以上。體外批次發酵試驗證實，添加絞股藍皂甙后甲烷濃度分別下降2.3％，9.4％，6.9％和20.7％。本發明結果說明，在飼料中添加絞股藍皂甙可減少瘤胃甲烷產量，提高飼料能量利用效率，降低反芻動物養殖業中反芻動物瘤胃發酵所產甲烷對大氣環境的污染。
文檔編號A23K1/18GK101904418SQ20101024802
公開日2010年12月8日 申請日期2010年8月6日 優先權日2010年8月6日
發明者朱偉云, 毛勝勇, 王新峰 申請人:南京農業大學