專利名稱：小桐子快速繁殖的方法
技術領域：
本發明涉及小桐子快速繁殖的方法，尤其是一種涉及以組培苗的葉片為誘導材料 的植物苗木的繁育技術。
背景技術：
小桐子(/airoMa curcas L.)又叫麻瘋樹，是大戟科麻瘋樹屬植物。多年生，小 喬木或灌木。主要分布在熱帶和亞熱帶地區，我國在廣東、廣西、云南、貴州、福建、海南等省 廣為種植，或野生成群系。其種子含油量高，可達40飛0%，是世界公認為有發展前景的生物 能源植物。其油脂經提取和變性后即能成為柴油。這種生物柴油可生物分解，對環境無害， 較礦物柴油更清潔和高效。在目前能源日趨緊缺的形勢下，麻瘋樹作為一種可再生的生物 能源，倍受人們的關注。許多國家已經開展這方面的研究，我國政府較早就將麻瘋樹的發展 利用和研究列入國家的重大科研開發項目。此外，麻瘋樹還是一種藥用植物，有多種藥用成 分，也是有良好殺蟲效果的農藥原料。麻瘋樹耐干旱、土壤貧瘠，繁殖方便，可種子直播，可 扦插繁殖，種植簡便，可在非耕地帶大量種植，是改善生態環境、開發貧瘠地區，農民增收的 極好樹種。目前，利用組織培養技術進行小桐子的快速繁殖方面的報道較多(秦虹，宋松泉， 龍春林等。小桐子的組織培養和植株再生[J].云南植物研究，2006，28 (6) =649-652.； 麻瘋樹莖段離體培養及快速繁殖研究[J].廣西農業科學，2006，37 (3):221-223.;陸偉 達，魏琴，唐琳等。麻瘋樹愈傷組織的誘導及快速繁殖[J].應用與環境生物學報，2003， 9(2): 127-130.；林娟，唐琳，陳放。麻瘋樹的組織培養及植株再生[J].植物生理學通訊， 2002,38 (3) 252.等)，但存在如下問題
1、均采用細胞分裂素6-芐基腺嘌呤(6-BA)和生長素吲哚丁酸(IBA)或萘乙酸(NAA)不 同濃度的組合誘導愈傷和不定芽的分化。從誘導愈傷到不定芽的形成所需時間長，約6 12 周；
2、以上報道中，均采用不同的外植體(子葉、下胚軸、胚芽、幼齡樹的嫩葉片和葉柄、莖 段等)，均能誘導愈傷組織，但愈傷組織分化成不定芽的頻率差別極大，為(Γ80% ；
3、芽增殖速度慢，不能滿足工廠化生產的需求。采用以上方法，進行愈傷組織誘導分化成苗，個體繁殖速度不夠理想，為解決這 一問題，有研究者進行了促進麻瘋樹腋芽分枝的辦法進行快速繁殖獲得成功(李化，曾妮， 賈勇炯等。麻瘋樹的促腋芽分枝快繁及生根誘導[J].四川大學學報，2006，43(5): 1116-1120)。這一途徑，雖然使芽增殖的速度大大加快，但仍無法避免因多次繼代使植物體 內細胞分裂素累積，導致組培苗生長勢變弱的情況發生，還會使獲得的組培苗存在生根困 難的問題，無根或根系發育不良的組培苗很難移栽成活。
發明內容
本發明所要解決的技術問題在于提供一種小桐子快速繁殖的方法，具有理想的高
3分化頻率。本發明解決上述技術問題所采取的技術方案是一種小桐子快速繁殖的方法，依 序按下述步驟進行組織培養
第一步將小桐子的種子消毒后，在無菌條件下剝取種胚，接種于1/2MS+蔗糖25 35g/ L+0. 6 0. 8%瓊脂的培養基中，pH5. 8 6. 2，進行光照培養28 35天，獲得無菌實生苗；
第二步將無菌實生苗的子葉或真葉切割成0. Γ0. 6cm2的小塊，接種于誘導培養基中， 所述的誘導培養基為 MS+TDZ0. Γ0. 5mg/L+IBA0. θΓθ. lmg/L+ 蔗糖 25 35g/L+0. 6 0. 8% 瓊 脂，pH5. 8飛.2，培養12 16天產生愈傷組織，繼續培養12 16天分化出不定芽；
第三步將不定芽轉入增殖培養基進行繼代增殖培養，所述的增殖培養基為 gl+BAO. 5 1. 0mg/L+KT0. 5 1. 0mg/L+IBA0. θΓθ. lmg/L+AgN03 1 5mg/L+ 蔗糖 25 35g/ L+0. 6 0· 8%瓊脂，ρΗ5· 8 6· 2，生成組培叢芽；
第四步將組培叢芽中2 3cm的芽切下，接入發根培養基進行生根培養，發根培養基為 MS+NAA0. 5 1. 5 mg/L+ 蔗糖 15 25g/L+0. 6 0. 8% 瓊脂，ρΗ5· 8 6. 2，3 7 天后轉入 MS+ 蔗糖 15 25g/L+0. 6 0. 8%瓊脂的培養基中，經10 20天生根，培養28 35天獲得組培生根苗，進行 移栽。在上述方案的基礎上，取生長健壯的組培生根苗的葉片，重復步驟二至步驟四，以 替代經過多次繼代后生長勢頭變弱的組培叢芽。在上述方案的基礎上，所述的種子消毒方法為在7(Γ80%的酒精中浸泡2 3分鐘， 在無菌條件下剝去種皮后再用70、0%的酒精消毒2 3分鐘，然后用0. 05%升汞消毒15 25 分鐘，完畢后用無菌水沖洗至少4遍，最后用無菌紗布吸干多余的水分。在上述方案的基礎上，所述的種子消毒方法為所述光照培養的條件為培養室 溫度25士2°C、光照強度150(T2000LX，光照時間每天1(Γ 4小時。本發明的有益效果是
1、用細胞分裂素賽苯隆(TDZ)O.Γ0. 5mg/L和生長素吲哚丁酸(IBA) 0. 0廣0. lmg/L組 合，直接誘導子葉或組培苗葉片產生愈傷分化出不定芽，愈傷組織分化不定芽的過程，不需 要更換培養基配方。此方法1個月即可分化出不定芽，而且分化頻率達90%，大大縮短了不 定芽的誘導過程；
2、采用以上相同配方，也能使組培生根苗的葉片分化出不定芽，經增殖培養后，可替代 經過多次繼代后生長勢變弱的組培叢芽，如此形成生產循環，源源不斷的生產出高質量的 組培種苗。
具體實施例方式一種小桐子快速繁殖的方法，依序按下述步驟進行組織培養
第一步將小桐子種子在75%的酒精中浸泡2分鐘，在無菌條件下剝去種皮后再用75% 的酒精消毒2分鐘，然后用0. 05%升汞消毒20分鐘，完畢后用無菌水沖洗6遍，最后用無菌 紗布吸干多余的水分；在無菌條件下剝取種胚，然后接種于1/2MS+蔗糖30g/L+0. 6-0. 8%瓊 脂的培養基中，PH5. 8飛.2，進行光照培養，培養室溫度25士2°C、光照強度150(T2000LX，光 照時間每天1(Γ14小時，培養2周，獲得無菌實生苗；
第二步將無菌苗的子葉或真葉切割成0. 5cm2的小塊，接種于誘導培養基中，所述的誘導培養基為 MS+TDZ0. Γ0. 5mg/L+IBA0. θΓθ. lmg/L+ 蔗糖 30g/L+0. 6 0. 8% 瓊脂， PH5. 8飛.2，培養2周產生愈傷組織，出愈率100%，再培養2周，分化出不定芽，分化頻率 90%，平均每塊外植體可產生6. 3個不定芽；
第三步將不定芽轉入增殖培養基進行繼代增殖培養，所述的增殖培養基為 gl+BAO. 5 1. 0mg/L+KT0. 5 1. 0mg/L+IBA0. θΓθ. lmg/L+AgN03 1 5mg/L+ 蔗糖 30g/ L+0. 6 0· 8%瓊脂，ρΗ5· 8 6· 2，生成組培叢芽，繼代1次，增殖比例為1:2;
第四步將繼代增殖培養過程獲得的組培叢芽中2 3cm的芽切下，接入發根培養基，所 述的發根培養基為MS+NAA0. 5 1. 5 mg/L+蔗糖20g/L+0. 6 0. 8%瓊脂，pH5. 8 6. 2，3 7天后 轉入MS+蔗糖20g/L+0. 6 0. 8%瓊脂的培養基中，經10 20天生根，生根率90%，1個月即可 移栽。 取生長健壯的組培生根苗的葉片，重復第二步至第四步，以替代經過多次繼代后 生長勢頭變弱的組培叢芽。
權利要求
一種小桐子快速繁殖的方法，依序按下述步驟進行組織培養第一步將小桐子的種子消毒后，在無菌條件下剝取種胚，接種于1/2MS+蔗糖25～35g/L+0.6～0.8%瓊脂的培養基中，pH5.8～6.2，進行光照培養28～35天，獲得無菌實生苗；第二步將無菌實生苗的子葉或真葉切割成0.4～0.6cm2的小塊，接種于誘導培養基中，所述的誘導培養基為MS+TDZ0.1～0.5mg/L+IBA0.01～0.1mg/L+蔗糖25～35g/L+0.6～0.8%瓊脂，pH5.8～6.2，培養12～16天產生愈傷組織，繼續培養12～16天分化出不定芽；第三步將不定芽轉入增殖培養基進行繼代增殖培養，所述的增殖培養基為gl+BA0.5～1.0mg/L+KT0.5～1.0mg/L+IBA0.01～0.1mg/L+AgNO3 1～5mg/L+蔗糖25～35g/L+0.6～0.8%瓊脂，pH5.8～6.2，生成組培叢芽；第四步將組培叢芽中2～3cm的芽切下，接入發根培養基進行生根培養，發根培養基為MS+NAA0.5～1.5 mg/L+蔗糖15～25g/L+0.6～0.8%瓊脂，pH5.8～6.2，3～7天后轉入MS+蔗糖15～25g/L+0.6～0.8%瓊脂的培養基中，經10～20天生根，培養28～35天獲得組培生根苗，進行移栽。
2.根據權利要求1所述的小桐子快速繁殖的方法，其特征在于取生長健壯的組培生 根苗的葉片，重復第二步至第四步，以替代經過多次繼代后生長勢頭變弱的組培叢芽。
3.根據權利要求1所述的小桐子快速繁殖的方法，其特征在于所述的種子消毒方法 為在70 80%的酒精中浸泡2 3分鐘，在無菌條件下剝去種皮后再用70 80%的酒精 消毒2 3分鐘，然后用0. 05%升汞消毒15 25分鐘，完畢后用無菌水沖洗至少4遍，最 后用無菌紗布吸干多余的水分。
4.根據權利要求1所述的小桐子快速繁殖的方法，其特征在于所述的種子消毒方法 為所述光照培養的條件為培養室溫度25士2°C、光照強度1500 2000LX，光照時間每天 10 14小時。
全文摘要
本發明涉及小桐子快速繁殖的方法，小桐子種子消毒后在無菌條件下剝取種胚，接種于培養基，光照培養1個月；將子葉或真葉切割成的小塊，接種于誘導培養基MS+TDZ0.1-0.5mg/L+IBA0.01-0.1mg/L+蔗糖30g/L+0.6-0.8%瓊脂中，培養2周產生愈傷組織，繼續培養2周，分化出不定芽；將不定芽轉入增殖培養基gl+BA0.5-1.0mg/L+KT0.5-1.0mg/L+IBA0.01-0.1mg/L+AgNO31-5mg/L+蔗糖25~35g/L+0.6~0.8%瓊脂中，生成組培叢芽；2-3cm的芽切下，接入發根培養基進行生根培養，獲組培生根苗。本發明直接誘導子葉或組培苗葉片產生愈傷分化出不定芽，愈傷組織分化不定芽的過程，不需要更換培養基配方，且分化頻率達90%，大大縮短了不定芽的誘導過程。
文檔編號A01H4/00GK101911912SQ20101026049
公開日2010年12月15日 申請日期2010年8月24日 優先權日2010年8月24日
發明者唐寅, 宋學孟, 張承妹, 殷玥, 蘇敏, 陳權 申請人:上海世華生物工程有限公司