專利名稱：一種生物人工肝用肝細胞的保存液及其制備方法
技術領域：
本發明涉及人體或動物的器官、組織或細胞的體外保存液生物技術領域，尤其是 涉及一種生物人工肝用肝細胞的保存液及其制備方法。
背景技術：
我國是肝病的高發區，每年發生急性病毒性肝炎約120萬例，重型肝炎約占其中 的0. 2% 0. 4%，病死率可高達70%。乙肝患者中約有1 %可發展為急性或亞急性肝衰竭。 約有20%急性乙肝患者可轉化為慢性，約3%患者可發展為肝炎后肝硬化。丙肝患者中約 60% 80%轉化為慢性，20%可發展為肝硬化，12%發展為終末期肝病。每年死于肝病者約 30萬例，其中50%為原發性肝細胞癌，大多與乙、丙型肝炎有關。因此重型肝炎、肝衰竭以 及肝炎終末期肝病肝硬化和肝癌等是我國肝病患者死亡的主要原因。肝移植是治療此類疾 病的最徹底與有效的方法。我國的肝移植數每年在700例以上，1年生存率超過50%，最長 存活時間超過6年。但是我國重型肝炎患者多供器官缺乏，許多患者得不到及時的肝移植 手術而喪失存活機會，同時有效的供體資源也未能充分利用。因此生物人工肝與肝細胞移 植等細胞水平的新治療方法得到了研究與發展。肝細胞移植和生物人工肝支持在大量動物 實驗和一些臨床實驗中獲得良好效果，成為有前途的肝病治療途徑。實際上，如果肝細胞移 植及生物人工肝在臨床的大量運用，肝細胞的需求量必將增加，同器官移植一樣面對的供 者不足的情況也將要出現。若有一實用可靠的低溫儲存技術，建立一個肝細胞庫，危重患者 隨時都能得到大量高活率、有功能的肝細胞；肝細胞移植和生物人工肝技術就能普遍推廣。生物人工肝支持系統中最重要的部件就是生物反應器。然而生物反應器的合成需 要一個有豐富經驗的團隊在無菌條件下用特殊設備進行細胞的擴增及功能的標準化檢測， 這就需要一個中心一 “細胞工廠”去提供生物反應器裝載細胞的擴增及運送到有需要的醫 院。豬肝細胞作為生物反應器裝載細胞經深低溫凍存_復蘇后細胞存活率及肝細胞特有功 能均明顯下降，大大限制了人工肝的治療效果。因此，肝細胞擴增完成后，在短時間保存及 長距離運輸過程中需要有一種方便、有效、實用的保護裝載細胞活力及功能的方法。4°C是 器官及大規模細胞群的標準保存溫度，在此溫度下運輸無須特殊設備即可達到要求。在4°C 保存過程中肝細胞損傷主要是低溫損傷及復溫再損傷，類似于器官移植過程中的缺血再灌 注損傷。Belzer等根據低溫下器官的各種病理生理特點，提出了一種有效的器官低溫保護 液的成分，必須具備以下五個方面的特點①減少因低溫導致的細胞水腫②防止細胞的酸 化作用③防止灌洗過程中的細胞間隙的腫脹④防止氧自由基的損傷，尤其在再灌注過程中 ⑤提供再生高能磷酸化合物的底物⑥保持細胞內環境穩定。目前市場上主要的器官保護液主要有美國設計的UW液和歐洲設計的HTK液。UW 液是目前世界范圍內應用最為廣泛的一種多器官灌注保存液，能夠有效地保存腎臟72h、胰 腺72h、肝臟30h、心臟24h，但是它仍然有許多不足，它的高滲性引起細胞皺縮、高粘滯性影 響原位灌注、高鉀不符合生理、缺乏保護肝臟低溫保存的藥物、價格昂貴。HTK液與UW液一 樣是較理想的的器官保存液，HTK液最大的優點在于它的低粘滯性，可改善保存器官的微循環，提高組織氧化等，它仍有明顯的不足主要體現在器官保存時間的限制上，隨著時間的延 長移植物無功能的發生率會大幅度提升。
發明內容
本發明要解決的技術問題是克服上述缺陷，提供了一種生物人工肝用肝細胞的保 存液及其制備方法，此保存液可以在低溫狀態下很好保護生物人工肝用肝細胞的細胞活力 及肝細胞特有功能，以滿足生物人工肝用大規模肝細胞庫的短期低溫保存及或遠距離運輸 過程中肝細胞的保護。本發明提供了一種生物人工肝用肝細胞的保存液，為超純水配制的溶液，該溶液 中包含如下濃度范圍的組分
十二水磷酸氫二鈉(Na2HPO4 · 12H20) 二水磷酸二氫鈉(NaH2PO4 · 2H20) 一7jC枸櫞酸鉀(C6H5K3O7 · H2O) 氯化鈉(NaCl) 六水氯化鎂(MgCl2 · 6H20) 三磷酸腺苷二鈉(CltlH14N5Na2O13P3) 還原性谷胱甘肽(CltlH18O6N3S) α -硫辛酸(C8H14O2S2) 海藻糖(C6H12O5) 羥乙基淀粉200/0. 5 苦參堿
該溶液的PH為7. 2-7. 4，滲透壓為305士 10mmol/L。 優選地，所述溶液中包含如下濃度的組分 十二水磷酸氫二鈉(Na2HPO4 · 12H20) 二水磷酸二氫鈉(NaH2PO4 · 2H20) 一7jC枸櫞酸鉀(C6H5K3O7 · H2O) 氯化鈉(NaCl) 六水氯化鎂(MgCl2 · 6H20) 三磷酸腺苷二鈉(CltlH14N5Na2O13P3) 還原性谷胱甘肽(CltlH18O6N3S) α -硫辛酸(C8H14O2S2)
15-25mmol/L
1-10mmol/L 4-6mmol/L
10-30mmol/L 5-1Ommo1/L 3-1Ommo1/L l-5mmol/L 0. l-o. 5mmol/L 100-150mmol/L 10-50g/L
2-10mg/L
7163mg/L 780mg/L 1622mg/L 1168mg/L 1827mg/L 2755mg/L 922mg/L 41mg/L
47287. 5mg/L 30g/L 6mg/L
海藻糖(C6H12O5) 羥乙基淀粉200/0. 5 苦參堿
本發明的生物人工肝用肝細胞的保存液配制方法為按照上述配方將藥物用電子 天平精確稱量，用適量超純水完全溶解除α-硫辛酸外的其他成分，避光精確稱量α-硫辛 酸后，在避光狀態下充分溶解，加超純水至足量，4°C條件下測定PH值、滲透壓，真空過濾器 (0. 22 μ m)過濾，抽取樣本做細菌培養，將液體裝入棕色PVP袋，置4°C冰箱保存備用，所得 液體呈無色透明、無混濁、無沉淀及絮狀物。上述操作過程均在無菌配制室完成，所用器具均經過無菌處理。本發明生物人工肝用肝細胞的保存液含有的基本組分是能夠維持低溫狀態下肝 細胞的活力和電解質生理濃度，其所含的組分主要是能夠減輕細胞內酸化，減輕氧自由基 損傷、穩定細胞膜結構、補充細胞能量丟失、減少低溫導致的細胞水腫。在配方設計上，吸收 了 UW液、HTK液的優點同時具備了自己明顯的特點1.具有強大的緩沖能力。選取兩種緩沖對，ΗΡ04/Η2Ρ04及檸檬酸鹽(枸櫞酸鹽) 兩種緩沖對，防止細胞在低溫狀態的酸化作用。2.選用非滲透性保護劑海藻糖(trehalose)，起到穩定細胞膜和蛋白質結構的作 用，減輕低溫狀態下細胞水腫。3.添加了外源性三磷酸腺苷、氯化鎂作為再生高能磷酸化合物的底物，通過 ATP-Mg2+為細胞提供能量。4.采用還原型谷胱甘肽及有萬能抗氧化劑之稱的α-硫辛酸作為抗氧化系統及 抗凋亡系統，防止或減輕細胞再灌注損傷，自由基對細胞的損傷。5.引入中藥的活性成分苦參堿，利用其抗氧化性，增強保護作用。6.用羥乙基淀粉，提高膠體滲透壓的方法，減輕細胞水腫。
圖1為本發明的保存液、UW液、乳酸林格液分別4°C低溫保存細胞后細胞存活率比 較示意圖；圖2a、2b、2c為本發明的保存液、Uff液、乳酸林格液分別4°C低溫保存細胞24h后 細胞Α0/ΡΙ雙染X400顯微觀察圖；圖3a、3b、3c為本發明的保存液、Uff液、乳酸林格液分別4°C低溫保存細胞48h后 細胞Α0/ΡΙ雙染X400顯微觀察圖；圖4a、4b、4c為本發明的保存液、Uff液、乳酸林格液分別4°C低溫保存細胞72h后 細胞Α0/ΡΙ雙染X400顯微觀察圖；圖5為本發明的保存液、UW液、乳酸林格液分別4°C低溫保存細胞后細胞白蛋白含 量比較示意圖。
具體實施例方式以下對本發明的優選實施例進行說明。實施例一配制本發明生物人工肝用肝細胞的保存液I (1000ml)1、向IOOOml容器內加入800ml超純水；2、加入7163mg十二水磷酸氫二鈉，攪拌使其充分溶解；3、加入780mg 二水磷酸二氫鈉，攪拌使其充分溶解；4、加入1622mg —水枸櫞酸鉀，攪拌使其充分溶解；5、加入1168mg氯化鈉，攪拌使其充分溶解；6、加入1827mg六水氯化鎂，攪拌使其充分溶解；7、加入2755mg三磷酸腺苷二鈉，攪拌使其充分溶解；
6
8、加入922mg還原性谷胱甘肽，攪拌使其充分溶解；9、加入47287. 5mg海藻糖，攪拌使其充分溶解；10、加入30g羥乙基淀粉200/0. 5，攪拌使其充分溶解；11、加入6mg苦參堿，攪拌使其充分溶解；12、在避光狀態下加入41mg α -硫辛酸，并攪拌使其充分溶解；13、容量調整加入超純水直至溶液總體積為1000ml，攪拌使溶液呈均勻、無色、 澄清的液體；14、活性碳過濾后，4°C條件下測定PH值為7. 3、滲透壓為305mmol/L，真空過濾器 (0. 22 μ m)過濾除菌，抽取樣本做細菌培養。實施例二配制本發明生物人工肝用肝細胞的保存液II (1000ml)，配制方法與實施例一相 同，組分的用量為5372mg十二水磷酸氫二鈉，1560mg 二水磷酸二氫鈉，1298mg 一水枸櫞 酸鉀，585mg氯化鈉，2030mg六水氯化鎂，5510mg三磷酸腺苷二鈉，307mg還原性谷胱甘肽， 56745mg海藻糖，50g羥乙基淀粉200/0. 5，2mg苦參堿，103mg α -硫辛酸；活性碳過濾后， 4°C條件下測定PH值為7. 2、滲透壓為315mmo 1/L，真空過濾器(0. 22 μ m)過濾除菌，抽取 樣本做細菌培養。實施例三配制本發明生物人工肝用肝細胞的保存液III (1000ml)，配制方法與實施例一相 同，組分的用量為8950mg十二水磷酸氫二鈉，156mg 二水磷酸二氫鈉，1946mg 一水枸櫞酸 鉀，1755mg氯化鈉，1015mg六水氯化鎂，1653mg三磷酸腺苷二鈉，1535mg還原性谷胱甘肽， 37830mg海藻糖，IOg羥乙基淀粉200/0. 5，IOmg苦參堿，20. 6mga -硫辛酸；活性碳過濾后， 4°C條件下測定PH值為7. 4、滲透壓為295mmol/L，真空過濾器(0. 22 μ m)過濾除菌，抽取樣 本做細菌培養。為研究本發明保存液在生物人工肝用肝細胞的保存效果，以上述實施例配制的保 存液Ι、Π、ΙΙΙ進行實驗，生物人工肝用肝細胞C3A為實驗細胞。以乳酸林格氏液，UW液為 對照，進行在4°C低溫條件下保存24h、48h、72h后復溫到37°C細胞存活率、細胞凋亡及其特 有功能的實驗。一、低溫保存后細胞存活率檢測實驗方法1、細胞培養消化收集人肝細胞(C3A)，調整細胞密度為3X 105/ml，接種在六孔培 養板中，每孔加液量達2ml，37°C，5% CO2，二氧化碳孵箱貼壁培養24小時后行4°C低溫保存。2、低溫凍存吸除原先各孔培養液，PBS 2ml沖洗。分別加入2ml如下各組保護劑， 分別為；保存液I、UW保護液及乳酸林格液，置于4°C冰箱中保存24、48、72小時。3、將細胞從4°C冰箱取出后快速置入37°C水浴鍋中水浴復蘇2mim后，小心吸盡各 組保存液后用0. 4%胎盤藍拒染試驗測定。在光學顯微鏡下隨機五個視野計數200個肝細 胞中活細胞百分比測定其存活率。實驗結果實施例一保存液I組與UW液組人肝細胞(C3A)存活率24h、48h均無明顯差異，而72h后實施例一保存液I組人肝細胞C3A)存活率略低于UW液組。陰性對照組乳酸林格氏 液組人肝細胞(C3A)存活率在保存24h后即見明顯下降，參見圖1。以保存液II、III進行同樣實驗，結果相同。二、低溫保存后細胞凋亡實驗實驗方法1、細胞培養消化收集人肝細胞(C3A)，調整細胞密度為3X 105/ml，接種在六孔培 養板中，每孔加液量達2ml，37°C，5% C02，二氧化碳孵箱貼壁培養24小時后行4°C低溫保存。2、低溫凍存吸除原先各孔培養液，PBS 2ml沖洗。分別加入2ml如下各組保護劑， 分別為；保存液I、UW保護液及乳酸林格液，置于4°C冰箱中保存24、48、72小時。3、吖啶橙(AO) /碘化丙錠(PI)雙染熒光顯微鏡檢測細胞凋亡情況。實驗結果由上不同保存液組人肝細胞(C3A)吖啶橙/碘化丙啶雙染結果可見，保存液I與 UW液組相比，在保存24h、48h后雙染未見明顯凋亡細胞，兩組無明顯差異，而72h后見較多 凋亡，胞核固縮狀、呈增強的、明亮的綠色熒光，效果稍差(見圖2a、圖2b，圖3a、圖3b，圖 4a、圖 4b)。而陰性對照組乳酸林格氏液組在保存24h后即明顯見肝細胞在低溫狀態下出現 凋亡，胞核呈固縮狀、團塊狀結構，呈增強的、明亮的綠色熒光，甚至呈現出“黃”色。48h、72h 可見壞死或晚期凋亡，核為較大的圓形結構著橘紅色，或橘紅色并呈固縮狀或圓珠狀(見 圖 2c、圖 3c、圖 4c)。以保存液II、III進行同樣實驗，結果相同。三、低溫保存后肝細胞白蛋白合成功能實驗方法1、細胞培養消化收集人肝細胞(C3A)，調整細胞密度為2X 106/ml，接種在六孔培 養板中，每孔加液量達2ml，37°C，5% C02，二氧化碳孵箱貼壁培養24小時后行4°C低溫保存。2、低溫凍存吸除原先各孔培養液，PBS 2ml沖洗。分別加入2ml如下各組保護劑， 分別為；保存液I、UW保護液及乳酸林格液，置于4°C冰箱中保存24、48、72小時。3、將細胞從4°C冰箱取出后快速置入37°C水浴鍋中水浴復蘇2mim后，小心吸盡各 組保存液后，各組中加入含10%胎牛血清DMEM細胞培養基常規培養24、48、72小時。定期 收集培養液上清，用人白蛋白放免試劑盒(北方原子能研究所提供)檢測培養上清中人白 蛋白含量，采用放射免疫抗原競爭法，與牛血清白蛋白無交叉反應。實驗結果保存液I組與UW液組在低溫保存24h、48h后復蘇再培養中白蛋白合成 功能無顯著性差異，陰性對照組乳酸林格氏液組與其他兩實驗組在細胞復蘇后白蛋白合成 功能有顯著性差異。(見圖5)以保存液II、III進行同樣實驗，結果相同。通過以上實驗的證明，本發明在4°C低溫保存生物人工肝用人肝細胞是明顯有效 地，特別是在低溫保存48小時內，在細胞存活率及其細胞特有功能上同UW液比較無明顯差 異。同時本發明保存液所含組分來源豐富，成本低，不同于既往細胞保存液，本發明各組分
8有確定的成分及濃度，其主要由雙糖、多聚糖、多肽、金屬離子、磷酸根離子等組成，因不需 要添加血清等其他異種抗原及有細胞毒性的二甲基亞砜，避免了被未知病毒污染的危險及 引入異種抗原后的抗原抗體排斥反應。因而細胞在低溫保存后不用經特殊處理即可以用 于生物人工肝生物反應器，很好滿足了臨床生物人工肝要求肝細胞材料的供應快速、應急 (ready-to-use)的要求。 以上所揭露的僅為本發明的優選實施例而已，當然不能以此來限定本發明之權利 范圍，因此依本發明申請專利范圍所作的等同變化，仍屬本發明所涵蓋的范圍。
權利要求
一種生物人工肝用肝細胞的保存液，為超純水配制的溶液，其特征在于，該溶液中包含如下濃度范圍的組分十二水磷酸氫二鈉15 25mmol/L二水磷酸二氫鈉 1 10mmol/L一水枸櫞酸鉀4 6mmol/L氯化鈉 10 30mmol/L六水氯化鎂 5 10mmol/L三磷酸腺苷二鈉 3 10mmol/L還原性谷胱甘肽 1 5mmol/Lα 硫辛酸 0.1 0.5mmol/L海藻糖 100 150mmol/L羥乙基淀粉200/0.5 10 50g/L苦參堿 2 10mg/L。
2.如權利要求1所述的生物人工肝用肝細胞的保存液，其特征在于，所述溶液的PH為 7. 2-7. 4。
3.如權利要求1所述的生物人工肝用肝細胞的保存液，其特征在于，所述溶液的滲透 壓為 305士 10mmol/L。
4.如權利要求1所述的生物人工肝用肝細胞的保存液，其特征在于，所述溶液中包含 如下濃度的組分十二水磷酸氫二鈉7163mg/L二水磷酸二氫鈉780mg/L一水枸櫞酸鉀1622mg/L氯化鈉1168mg/L六水氯化鎂1827mg/L三磷酸腺苷二鈉2755mg/L還原性谷胱甘肽922mg/Lα-硫辛酸41mg/L海藻糖47287. 5mg/L羥乙基淀粉200/0. 530g/L苦參堿6mg/L。
5.權利要求1所述的生物人工肝用肝細胞的保存液的制備方法，其特征在于，包括如 下步驟按照所述組分的濃度要求將所述各組分準確稱量，其中的α-硫辛酸避光稱量； 用適量超純水完全溶解除α-硫辛酸外的其他組分； 在避光狀態下充分溶解α-硫辛酸； 加超純水至足量。
6.如權利要求5所述的生物人工肝用肝細胞的保存液的制備方法，其特征在于，在所 述加超純水至足量步驟后還包括如下步驟過濾；將過濾后的溶液裝入棕色PVP袋，置冰箱 保存備用。十二水磷酸氫二鈉 15-25mmol/L 二水磷酸二氫鈉 l-10mmol/L一水枸櫞酸鉀 4-6mmol/L 氯化鈉 10-30mmol/L六水氯化鎂 5-1Ommo1/L 三磷酸腺苷二鈉 3-1Ommo1/L 還原性谷胱甘肽 l-5mmol/Lα -硫辛酸 0.1-0.5mmol海藻糖100-150mmol/L羥乙基淀粉200/0. 5 10-50g/L 苦參堿 2-10mg/L。
7.如權利要求6所述的生物人工肝用肝細胞的保存液的制備方法，其特征在于，所述 步驟均在無菌配制室完成，所用器具均經過無菌處理。
全文摘要
本發明提供了一種生物人工肝用肝細胞的保存液及其制備方法，該保存液為超純水配制的溶液，該溶液中包含如下濃度范圍的組分十二水磷酸氫二鈉15-25mmol/L，二水磷酸二氫鈉1-10mmol/L，一水枸櫞酸鉀4-6mmol/L，氯化鈉10-30mmol/L，六水氯化鎂5-10mmol/L，三磷酸腺苷二鈉3-10mmol/L，還原性谷胱甘肽1-5mmol/L，α-硫辛酸0.1-0.5mmol/L，海藻糖(C6H12O5)100-150mmol/L，羥乙基淀粉200/0.510-50g/L，苦參堿2-10mg/L；其制備方法包括如下步驟按照所述組分的濃度要求將所述各組分準確稱量，其中的α-硫辛酸避光稱量；用適量超純水完全溶解除α-硫辛酸外的其他組分；在避光狀態下充分溶解α-硫辛酸；加超純水至足量。本發明的保存液可以在低溫狀態下很好保護生物人工肝用肝細胞的細胞活力及肝細胞特有功能，以滿足生物人工肝用大規模肝細胞庫的短期低溫保存及或遠距離運輸過程中肝細胞的保護。
文檔編號A01N1/02GK101919381SQ20101027340
公開日2010年12月22日 申請日期2010年9月6日 優先權日2010年9月6日
發明者張志 , 徐小平, 潘明新, 秦佳升, 蔣澤生, 高毅 申請人:南方醫科大學珠江醫院