專利名稱：尾葉桉遺傳轉化與再生的方法
技術領域：
本發明屬于桉樹遺傳轉化與再生方法，特別是關于尾葉桉的遺傳轉化與再生。
背景技術：
桉樹(Eucalyptus)屬桃金娘科(Mytacea)，桉屬(Eucalyptus)，原產于澳大利， 現有1000多個種及亞種。桉樹具有許多顯著的特點①材質堅硬，材、皮、葉、花的經濟價值都很高，既是用材林、經濟林、防護林、風景林，又是很好的能源樹種；②繁殖容易，速生豐產，特別是幼林期生長快，大大縮短了生產周期，能獲得更高的經濟效益；③種類多，抗逆性強，既有耐熱樹種，也有耐寒樹種，病蟲害少，較耐瘦瘠，可在不同氣候帶栽植。桉樹的木材是造紙、造船的良材，葉子可提油料，樹皮可提樹脂，殘渣培養食用菌后還可當肥料，花是良好的蜜源。正因桉樹有上述用途，加之生態適應性廣、速生、抗逆性強、用途廣泛等優點，已被世界熱帶、亞熱帶地區廣泛引種栽培。目前全世界有100多個國家種植桉樹，種植面積超過2000萬公頃，桉樹已經成為短周期原料林的主要樹種。我國最早引種是1890年，零星引種在城市公園，鐵路邊等四旁綠化場地。真正大規模系統地開展引種和推廣栽培始于20世紀50年代的雷州半島。80年代初，澳大利亞援助中國在廣西東門林場開展桉樹系統引種和育種實驗，引進了 174個桉樹品系和種源，建立了樹木園和桉樹良種基因庫。現在，桉樹已經成為我國南方地區發展速生豐產林的戰略樹種。目前桉樹廣泛栽種于我國從東海之濱到云貴高原的廣大地區。據不完全統計，我國現有桉樹人工林總面積達到200萬公頃，并正以每年10萬公頃的速度增長。桉樹生長周期長，而且遺傳性高度雜合，應用常規的育種方法育種周期長，利用基因工程手段可打破種間雜交不親和的界限。利用基因工程進得桉樹轉基因育種的前提是建立桉樹組織培養再生系統與遺傳轉化的受體系統。從20世紀60年代以來，植物細胞的全能性，在理論上和實踐上都得到了充分的論證，植物組織培養進入了迅速發展時期，桉樹某些品種的組織培養也于20世紀60年代逐漸開始。迄今為止，已有60多種桉樹的組織培養獲得成功，絕大部分是國外首先取得成功。Hatney用簡單的培養基在普通家用冰箱中保存鈍蓋赤桉(E. camaldulensis)和巨桉(E. grandis)裸芽培養物達8個月之久；Bachelard和 Stowe用一種含14%椰子汁的液體培養基保存實生苗的根系，根冠部分可以接種在同種培養基上，但沒有芽的再生；Sussex由赤桉(E. camaldulenses)實生苗外植體獲得了愈傷組織；Aneja等由檸檬桉(E. citriodora)木質塊莖的愈傷組織誘導出小植株；Kitahara等人從白桉(E.alba)的下胚軸培養產生愈傷組織并分化形成了小植株；De R)SSard等人從榕葉桉(E.ficifolia)的莖節離體培養，能繁育大量苗木；LakshmiSita發現，從檸檬桉子葉愈傷組織誘導再生芽的條件為0. 2mg/L IAA和lmg/L ZT以及光周期12小時的熒光燈光照，這些芽能在只含有生長素的培養基上形成根；P. K. Gupta等人用組織培養法無性繁殖檸檬桉，并于1981年用成年檸檬桉樹嫩枝莖段誘導出了完整植株；S. Kondas將一棵20年生的桉樹成功培養出芽；Adam將岡尼桉(E. gunnii)的離體根培養在不含激素的MS固體培養基上，但沒有分化成芽；Qin和Kirby用葡萄桉(E. botryoides)、鄧恩桉(E. dunnii)、巨桉(E. grandis)和野桉(E. rudis)幼苗的子葉、下胚軸以及成年巨桉(E. grandis)優良無性系的幼葉為材料誘導出類似胚狀體的結構。此后更有不少相關報道，E. tereticornis, E. grandis、E. Urophylla.E. Globulus,Ε. grandisXΕ. uropHylla 等樹種已能經器官發生途徑再生。E. Citriodora, E. Grandis和E. dunnii等樹種已能經體細胞胚胎發生途徑再生。20世紀80年代初歐陽權首次對桉樹胚狀體的發生進行了研究，此后，桉樹組織培養的研究工作全面展開，首先在雷林1號桉(E. Ieichow No. 1)、巨尾桉(E. grandis XE. urophylla)等樹種首先取得成功。謝麗萍等用四個產地柳窿桉(E. salignaXexserta)優良無性系的基部萌條嫩莖為外植體進行了組織培養研究，并獲得了再生植株。韓美麗等以雷林一號桉及尾葉桉為材料建立了原生質體分離體系；同年，又報道了以尾葉桉、柳窿桉的胚性愈傷組織為親本材料，采用PEG (聚乙二醇)融合法研究了影響原生質體融合的主要影響因素。2003年，蔡燕靈等用二次回歸旋轉設計對桉樹DH33^和E3兩個無性系進行組培試驗，研究了其繼代培養芽的葉片增大與培養基中細胞分裂素6-BA和生長素NAA濃度的關系。石大興等研究了以巨桉(Eucalyptusgrandis)幼樹帶芽莖段為外植體誘導叢生芽發生以及植株再生的過程，對培養過程中新芽及叢生芽的發生類型進行了探討，通過正交實驗及單因素試驗，確定了巨桉快繁體系的最適培養條件。隨后，卜朝陽通過試驗，獲得了桉樹四種再生系統。關亞麗等以無菌苗葉片為外植體進行了赤桉不定芽的誘導及植株再生。易敏等以鄧恩桉無菌苗的下胚軸和半木質化的帶芽莖段為外植體，誘導芽的分化及叢生芽產生，對培養基中不同生長素和細胞分裂素的濃度和配比進行了討論，確定了鄧恩桉組織培養最適培養條件。邱璐等研究了史密斯桉愈傷組織的誘導及分化，并取得了一定的結果。王以紅等將鄧恩桉種子在無菌環境下萌動，切割其下胚軸進行離體培養，建立不定芽發生和植株再生的微繁殖體系。劉奕清等以尾細桉Ml的單芽莖段為外殖體進行離體培養和快速繁殖研究，建立了尾細桉Ml離體再生體系。邱璐等對史密斯桉愈傷組織的誘導及分化進行了較為深入的研究，優化了史密斯桉愈傷組織誘導及分化系統為其無性繁殖和轉基因研究奠定了基礎。Teulieres等人第一次在R尼桉原生質體上比較了 PEG法和電泳沖法控制下轉化報告基因的差異以來，科研人員先后進行了檸檬桉(E. citriodora)、藍桉 (E. globules)、赤按(E. camaldulensis)、巨按(E. grapdis)、小套按(E. microtheca)、黃皮桉(E. ochropHloia)及邊緣桉(E. marginata)等的遺傳轉化的初步研究。現已獲得轉基因桉樹的有藍桉、赤桉和巨桉。Harcourt用農桿菌介導將抗除草劑和抗蟲基因轉入桉樹，獲得了多重抗性的轉化植株。張景寧報道，柞蠶抗菌肽對桉樹青枯假單胞菌有殺滅作用。邵志芳等用柞蠶抗菌肽D基因轉化桉樹發現轉化苗對青枯病的抗性有較大提高。Virginie研究了與桉樹木質素合成緊密相關的乙醇脫氫酶的啟動子。Bloksberg 等人從輻射松(Pinusradiata)中分離出了木質素合成途徑中的酶0_甲基轉移酶和 cinnamoy-CoAreductase基因，通過農桿菌轉入到桉樹的植物中。2007年賴家業等人在建立的尾巨桉(E. urophyllaXE. grandis) 3226,3228無性系高頻再生體系的基礎上，利用GUS染色組織分析法探討了各因素對尾巨桉莖段遺傳轉化的影響，轉化率最高也只有 2. 6%。綜上所述，目前國內外還未見有用尾葉桉種子無菌苗下胚軸為外植體進行遺傳轉化并獲得成功之路的例子。
發明內容
本發明的目的是為了彌補現有技術存在的不足，提供一種尾葉桉遺傳轉化與再生的方法。為實現上述發明目的，本發明采取的技術方案是該尾葉桉遺傳轉化與再生的方法，是采用尾葉桉無性系種子萌發實生苗的下胚軸為外植體進行遺傳轉化與再生；愈傷組織誘導后與攜帶外源基因的農桿菌共培養，經不定芽誘導培養、芽增殖培養、不定芽伸長培養、選擇性生根培養及移栽，得到擬轉化植株。所述尾葉桉下胚軸是由尾葉桉種子萌發生長的實生苗獲得；選取成熟的尾葉桉種子，經50 55°C溫水浸泡后自然冷卻，經70%乙醇滅菌1分鐘，無菌水沖洗2次，加入體積比為15% NaClO (次氯酸鈉)溶液，相對氯為3. 75%，采用二次消毒法，消毒時間為9+9分鐘，無菌水沖洗5 6次，播種到不加激素的1/2MS (Mnrashige and Skoog)培養基上，25士2°C暗培養7天后，在光照12小時/天、光照強度2000 2500Ix 條件下培養5 7天，得到實生苗。所述1/2MS培養基是大量元素為MS的一半，其它不變；添加0. 7%瓊脂、3%蔗糖， pH 為 5. 8 6. 0。所述尾葉桉遺傳轉化利用下胚軸為外植體，下胚軸是指實生無菌苗苗齡為12 14天的下胚軸。所述農桿菌介導的轉化，農桿菌菌液濃度0D_(在波長為600納米時光密度值) 為0. 4 0. 6，MS液體培養基重懸菌落，再將重懸的菌液用MS液體培養基稀釋20倍，浸染液pH為5.6。所述共培養是指尾葉桉無菌苗下胚軸經農桿菌介導轉化后，轉入共培養基暗培養 6天，培養溫度為25士2°C ；所述共培養基為MS+N-取代苯基N ‘_ (6-苯并噻唑基)脲類化合物(LC) 2mg/L+ 吲哚乙酸(IAA) 0. 05mg/L+ 維生素 C (Vc) 100mg/L+ 蔗糖 30g/L+ 瓊脂 7g/L， pH 5. 8 5. 9。所述不定芽誘導培養是指經共培養基上培養的下胚軸轉入選擇性不定芽誘導培養基上，在25士2°C、光照強度2000 25001x條件下培養2 3周；所述選擇性不定芽誘導培養基為SDM(Schneider ‘s Drosophila培養基)+N6-芐基腺嘌呤陽-BA) lmg/L+萘乙酸(NAA) 0. 05mg/L+ 腐胺 500 μ mol/L+ 亞精胺 50 μ mol/L+ 維生素 C (Vc) 100mg/L+ 卡那霉素 (Kan) 45mg/L+ 頭孢霉素(Cef) 200mg/L+ 蔗糖 30g/L+ 瓊脂 7g/L，pH 5. 8 5. 9。所述下胚軸經2 3周的不定芽誘導培養后，在兩端切口外周膨大成 呤狀的愈傷處長出再生芽點。所述芽增殖培養是指經選擇性不定芽誘導培養基培養的下胚軸轉入芽增殖培養基上，在25士2 °C、光照強度2000 25001x條件下培養2 3周；所述芽增殖培養基為 SDM+N6-芐基腺嘌呤(6-BA)0. 5mg/L+萘乙酸(NAA)O. 05mg/L+卡那霉素(Kan) 45mg/L+蔗糖 30g/L+ 瓊脂 7g/L, pH 5. 8 5. 9。所述不定芽伸長培養是指經芽增殖培養基培養的下胚軸轉入不定芽伸長培養基上，在25士2°C、光照強度2000 25001x條件下培養，促進芽伸長；所述不定芽伸長培養基為1/2MS+萘乙酸(NAA)O. 05mg/L+N-取代苯基N‘-(6-苯并噻唑基)脲類化合物(LC)O. 8mg/L+ 維生素 C(Vc) 100mg/L+ 卡那霉素(Kan) 45mg/L+ 蔗糖 30g/L+ 瓊脂 7g/L，pH 5. 8 5. 9。再生芽在不定芽伸長培養基上再培養，芽可以繼續生長伸長，待芽伸長至約3 4cm并有3 4個節時，伸長芽最適宜生根。所述選擇性生根培養是指不定芽伸長后轉入選擇性生根培養基上培養，以促其生根；所述選擇性生根培養基為1/2MS+吲哚丁酸(IBA)O. 5mg/L+卡那霉素(Kan) 75mg/L+蔗糖 30g/L+ 瓊脂 7g/L，pH 5. 8 5. 9。所述移栽是指將生根良好的生根苗從恒溫光照培養箱移至室外自然環境中煉苗 10 15天，用滅菌的黃心土與腐殖質土，比例為2 1，進行移栽，得到完整的尾葉桉植株。本發明特點是以尾葉桉TO無性系種子萌發的幼苗下胚軸為外植體經農桿菌介導進行遺傳轉化好再生。本發明所用的農桿菌GV3101，含誘導性植物表達載體pBPR-2(攜帶有真菌誘導性啟動子prpl-l、RS-AFP2基因及抗卡那霉素的NPT II基因)。通過誘導尾葉桉下胚軸愈傷組織與攜帶外源基因的農桿菌共培養轉化、不定芽誘導、不定芽伸長、芽增殖以及生根培養、移栽，可以得到完整的擬轉化植株。PCR和RT-PCR分析表明，RS-AFP2基因最終導入了尾葉桉基因組中，并且在prpl-Ι啟動子的啟動下得到表達；在轉RS-AFP2尾葉桉離體葉片的抗病性檢測中發現，轉化植株對疫霉菌具有較好的抗性；酶活測定結果顯示， 轉化植株在接種后，PAL、POD、PPO活性增強。
圖1本發明不定芽的選擇性誘導；圖2 3轉化后3周左右，在選擇性不定芽誘導培養基上愈傷處長出不定芽；圖4在選擇性芽增殖培養基上長出叢生芽；圖5 7不定芽在選擇性芽伸長培養基中伸長；圖8幼芽在選擇性生根培養基中生根培養；圖9伸長的幼芽在選擇性生根培養中10天左右長出正常白色根，再生成完整植株；圖10再生的完整植株移栽到含滅菌土壤的小盆中；圖11擬轉基因尾葉桉PCR檢測結果M IOObp Marker ；0 陽性質粒對照；1 42 擬轉化植株；圖12接種疫霉菌后，RS-AFP2基因的RT-PCR檢測結果M IOObp DNAMarker ；1 非轉基因尾葉桉；2 4 轉基因尾葉桉；圖13疫霉菌接種6天后，尾葉桉葉片病情調查(左圖為正面，右圖為反面)；圖14轉RS-AFP2尾葉桉接種疫霉菌前后PAL活性比較；圖15轉RS-AFP2尾葉桉接種疫霉菌前后PPO活性比較；圖16轉RS-AFP2尾葉桉接種疫霉菌前后POD活性比較。
具體實施例方式本發明采用尾葉桉無菌苗下胚軸為外植體進行遺傳轉化和再生的具體方法如下選擇成熟較大的尾葉桉種子，50 55°C溫水浸泡后自然冷卻，4 6小時后在超凈工作臺上用無菌水沖洗2次，70%乙醇滅菌lmin，無菌水沖洗2次后，加入15% (體積比) NaClO (相對氯為3. 75% )溶液，采用二次消毒法，消毒時間為9+9min，無菌水沖洗5 6次后接種到不加激素的V2MS培養基(添加0. 7%瓊脂、3%蔗糖，pH 5. 8 6. 0)。培養溫度為25士2°C，光照12h · cf1，光照強度為2000 25001x。當種子萌發成長約3 5cm，僅含1對子葉的幼苗時，去掉頂芽與根部，將下胚軸切成0. 5 1. Ocm長的小段，將此接種于愈傷誘導培養基(MS+LCang/L+IAA 0. 05mg/L+Vc 100mg/L+蔗糖30g/L+瓊脂7g/L，pH 5. 8 5. 9)，暗培養6天。培養溫度25 士 2°C。經預培養6天的外植體是用于遺傳轉化的最好材料。轉化實驗兩天前按常規方法劃平板上培養農桿菌，然后從平板上挑取單菌落接種于LB液體培養基含Km 50mg/L、鏈酶素(Mr) 25mg/L和Rif 25mg/L10mL中，振蕩培養過夜。當菌液濃度至0D_約為1.0時，吸取菌液200 μ L，用不加抗生素的LB液體培養基稀釋20 30倍，28°C、200rpm震蕩培養3 5小時；待菌液濃度至OD6tltl為0. 4 0. 6時， 吸取菌液注入1. 5mL的離心管中，5000rpm離心aiiin ；棄上清液，用MS ImL懸浮培養基重懸菌落，再將重懸的菌液用懸浮培養基稀釋20倍，即為轉化備用的浸染液。將預培養6天后的外植體放入錐形瓶中，加入浸染液30mL，搖動錐形瓶，使菌液充分接觸外植體兩端，3小時后將外植體轉移到鋪干濾紙的培養皿中，當于濾紙吸掉外植體上剩余的菌液后速將外植體轉移到共培養基(MS+LC 2mg/L+IAA 0. 05mg/L+Vc 100mg/L+蔗糖30g/L+瓊脂7g/L，pH 5. 8 5. 9)暗培養6天，培養溫度25士2°C。共培養6天后，將外植體轉移到選擇性不定芽誘導培養基(SDM+6-BAlmg/L+NAA 0. 05mg/L+ 腐胺 500 μ mol/L+ 亞精胺 50 μ mol/L+Vc 100mg/L+Kan 45mg/L+Cef 200mg/L+ 蔗糖30g/L+瓊脂7g/L，pH 5. 8 5. 9)上，在25士2°C、光照強度2000 25001x條件下，培養2 3周。不定芽誘導培養2 3周后，外植體轉移到選擇性芽增殖培養基(SDM+6-BA0. 5mg/ L+NAA 0. 05mg/L+Kan 45mg/L+蔗糖 30g/L+瓊脂 7g/L，pH 5. 8 5. 9)上，在 25士2°C、光照 12小時/天、光照強度2000 25001x條件下，培養2 3周。將選擇性芽增殖培養得到的芽叢切成單株，轉移到選擇性芽伸長培養基 (1/2MS+NAA 0. 05mg/L+LC 0. 8mg/L+Vc 100mg/L+Kan 45mg/L+蔗糖 30g/L+瓊脂 7g/L，pH 5. 8 5. 9)上，在25士2°C、光照12小時/天、光照強度2000 25001x條件下，培養2 3周。將3 5cm高的無菌苗轉入選擇性芽生根培養基(1/2MS+IBA 0. 5mg/L+Kan 75mg/ L+蔗糖30g/L+瓊脂7g/L，pH 5. 8 5. 9)上，在25士2°C、光照12小時/天、光照強度 2000 25001x條件下，培養2 3周。將生根良好的幼苗從恒溫光照培養箱移至室外自然環境中煉苗10 15天，移栽到滅菌黃心土與腐殖質土 O 1)上生長，得到尾葉桉擬轉化植株。實施案例選擇Ig成熟飽滿的尾葉桉種子，50 55°C溫水浸泡后自然冷卻4 6小時，在超凈工作臺上用無菌水沖洗2次，70%乙醇滅菌lmin，無菌水沖洗2次后，加入15% (體積比)NaClO (相對氯為3. 75% )溶液，采用二次消毒法，消毒時間為9+9min，無菌水沖洗5 6次，接種到不加激素的滅菌1/2MS培養基(附加0. 7%瓊脂、3%蔗糖，pH為5. 8 6. 0)。25°C暗培養7天后，轉入溫度為25士2°C、光照12小時/天、光照強度為2000 25001x條件下培養6天，即為13天苗齡的尾葉桉無菌實生苗。取13天苗齡(僅含1對子葉)的幼苗，去掉頂芽與根部，將下胚軸切成0.5 1.0cm長的小段，將此接種于愈傷誘導培養基(MS+LC 2mg/L+IAA0. 05mg/L+Vc 100mg/L+蔗糖30g/L+瓊脂7g/L，pH 5. 8 5. 9)上，在25士2°C下暗培養6天(90mm培養皿中放入30 個外植體，用封口膜封口)。培養6天的外植體是遺傳轉化的較好材料。轉化前2天，按常規方法劃平板，培養農桿菌，然后從平板上挑取單菌落接種于含 Km 50mg/L,Str 25mg/L和Rif 25mg/L的LB液體培養基IOmL中，28°C振蕩培養過夜，當菌液濃度至0D_約為1. 0時，吸取菌液200 μ L，用不加抗生素的LB液體培養基稀釋20 30 倍，28°C,200rpm震蕩培養3 5小時；待菌液濃度至OD6tltl為0. 4 0. 6時，吸取菌液注入 1. 5mL的離心管中，5000rpm離心^iin ；棄上清液，用MS懸浮培養基ImL重懸菌落，再將重懸的菌液用懸浮培養基稀釋20倍，即為轉化備用的浸染液。將預培養6天后的外植體放入IOOmL錐形瓶中，加入侵染液30mL，搖動錐形瓶，使菌液充分接觸外植體兩端，置暗處3小時后將外植體轉移到鋪有干濾紙的培養皿中，當濾紙吸掉外植體上剩余的菌液后，迅速將外植體轉移到共培養基(MS+LC 2mg/L+IAA 0. 05mg/ L+Vc 100mg/L+蔗糖 30g/L+瓊脂 7g/L，pH 5. 8 5. 9)上，在 25士2°C下暗培養 6 天(90_ 培養皿中放入30個外植體為宜，用封口膜封口)。共培養6天后，將外植體轉移到選擇性不定芽誘導培養基(SDM+6-BAlmg/L+NAA 0. 05mg/L+腐胺 500ymol/L+亞精胺 50ymol/L+Vc 100mg/L+Kan 45mg/L+Cef 200mg/L+蔗糖30g/L+瓊脂7g/L，pH 5. 8 5. 9)上，在25士2°C、光照12小時/天、光照強度2000 25001x條件下培養2 3周，在外植體兩端切口周圍膨大的黃綠色愈傷處長出數個不定芽。將不定芽轉移到選擇性芽增殖培養基(SDM+6-BA 0. 5mg/L+NAA 0. 05mg/L+Kan 45mg/L+蔗糖30g/L+瓊脂7g/L，pH 5. 8 5. 9)中，在25士2°C、光照12小時/天、光照強度2000 25001x條件下培養2 3周(每個150mL錐形瓶中放入1 4個不定芽)。從選擇性芽增殖培養基得到的芽叢切成單株，轉移到選擇性芽伸長培養基 (1/2MS+NAA 0. 05mg/L+LC 0. 8mg/L+Vc 100mg/L+Kan 45mg/L+蔗糖 30g/L+瓊脂 7g/L，pH 5. 8 5. 9)上，在25士2°C、光照12小時/天、光照強度2000 25001x條件下培養2 3 周(每個150mL錐形瓶中放入1 4個單株)。將3 5cm高的無菌苗轉入選擇性芽生根培養基(1/2MS+IBA 0. 5mg/L+Kan 75mg/ L+蔗糖30g/L+瓊脂7g/L，pH 5. 8 5. 9)中，在25士2 °C、光照12小時/天、光照強度 2000 25001x條件下培養(每個150mL錐形瓶中放入1 4個單株)。將生根良好的幼苗從恒溫光照培養箱移至室外，打開瓶蓋，在自然環境中煉苗 10 15天，從瓶中小心取出完整植株，放入裝有無菌水的燒杯中洗凈根部培養基，將生根苗移栽在盛有用滅菌黃心土與腐殖質土 O 1)基質的塑料盆內，立即給花盆套上塑料袋， 邊緣用橡皮筋扎緊，保持濕度。把花盆放在光照適宜的地方，可得到完整轉基因尾葉桉擬轉化植株。
權利要求
1.一種尾葉桉遺傳轉化與再生的方法，其特征在于采用尾葉桉無性系種子萌發實生苗的下胚軸為外植體進行遺傳轉化與再生；愈傷組織誘導后與攜帶外源基因的農桿菌共培養，經不定芽誘導培養、芽增殖培養、不定芽伸長培養、選擇性生根培養及移栽，得到擬轉化植株。
2.根據權利要求1所述尾葉桉遺傳轉化與再生的方法，其特征在于選取成熟的尾葉桉種子，經50 55°C溫水浸泡后自然冷卻，經70%乙醇滅菌1分鐘，無菌水沖洗2次，加入體積比為15% NaClO溶液，相對氯為3. 75%，采用二次消毒法，消毒時間為9+9分鐘，無菌水沖洗5 6次，播種到不加激素的1/2MS培養基上，25士2°C暗培養7天后，在光照12小時/天、光照強度2000 25001x條件下培養5 7天，得到實生苗；所述1/2MS培養基是大量元素為MS的一半，其它不變；添加0. 7%瓊脂、3%蔗糖，pH為 5. 8 6. O0
3.根據權利要求1所述尾葉桉遺傳轉化與再生的方法，其特征在于所述尾葉桉遺傳轉化利用下胚軸為外植體，下胚軸是指實生無菌苗苗齡為12 14天的下胚軸。
4.根據權利要求1所述的尾葉桉遺傳轉化與再生方法，其特征在于所述農桿菌介導的轉化，農桿菌菌液濃度0D_為0. 4 0. 6，MS液體培養基重懸菌落，再將重懸的菌液用MS 液體培養基稀釋20倍，浸染液pH為5. 6。
5.根據權利要求1所述的尾葉桉遺傳轉化與再生方法，其特征在于所述共培養是指尾葉桉無菌苗下胚軸經農桿菌介導轉化后，轉入共培養基暗培養6天，培養溫度為 25士2°C ；所述共培養基為 MS+LC 2mg/L+IAA 0. 05mg/L+Vc 100mg/L+蔗糖 30g/L+瓊脂 7g/L，pH 5· 8 5· 9。
6.根據權利要求1所述尾葉桉遺傳轉化與再生的方法，其特征在于所述不定芽誘導培養是指經共培養基上培養的下胚軸轉入選擇性不定芽誘導培養基上，在25士2°C、光照強度2000 25001x條件下培養2 3周，在兩端切口外周膨大成啞呤狀的愈傷處長出再生所述選擇性不定芽誘導培養基為SDM+6-BA lmg/L+NAA 0. 05mg/L+腐胺500 μ mol/ L+ 亞精胺 50 μ mol/L+Vc 100mg/L+Kan 45mg/L+Cef 200mg/L+ 蔗糖 30g/L+ 瓊脂 7g/L, pH 5. 8 5. 9。
7.根據權利要求1所述尾葉桉遺傳轉化與再生的方法，其特征在于所述芽增殖培養是指經選擇性不定芽誘導培養基培養的下胚軸轉入芽增殖培養基上，在25士2°C、光照強度 2000 25001x條件下培養2 3周；所述芽增殖培養基為 SDM+6-BA 0. 5mg/L+NAA 0. 05mg/L+Kan 45mg/L+ 蔗糖 30g/L+ 瓊月旨 7g/L，pH 5· 8 5· 9。
8.根據權利要求1所述尾葉桉遺傳轉化與再生的方法，其特征在于所述不定芽伸長培養是指經芽增殖培養基培養的下胚軸轉入不定芽伸長培養基上，在25士2°C、光照強度 2000 25001x條件下培養，促進芽伸長；所述不定芽伸長培養基為 1/2MS+NAA 0. 05mg/L+LC 0. 8mg/L+Vcl00mg/L+Kan 45mg/L+ 蔗糖 30g/L+ 瓊脂 7g/L，pH 5. 8 5. 9。
9.根據權利要求8所述尾葉桉遺傳轉化與再生的方法，其特征在于再生芽在不定芽伸長培養基上再培養，芽可以繼續生長伸長，待芽伸長至約3 km并有3 4個節時，伸長芽最適宜生根。
10.根據權利要求1所述尾葉桉遺傳轉化與再生的方法，其特征在于所述選擇性生根培養是指不定芽伸長后轉入選擇性生根培養基上培養，以促其生根；所述選擇性生根培養基為1/2MS+IBA 0. 5mg/L+Kan 75mg/L+蔗糖30g/L+瓊脂7g/L， pH 5· 8 5· 9。
11.根據權利要求1所述尾葉桉遺傳轉化與再生的方法，其特征在于所述移栽是指將生根良好的生根苗從恒溫光照培養箱移至室外自然環境中煉苗10 15天，用滅菌的黃心土與腐殖質土，比例為2 1，進行移栽，得到完整的尾葉桉植株。
全文摘要
本發明屬于一種桉樹遺傳轉化與再生方法，特別是關于利用尾葉桉無菌苗下胚軸為外植體進行遺傳轉化和再生的方法。以尾葉桉幼苗下胚軸為外植體經預培養誘導愈傷組織，與攜帶外源基因的農桿菌共培養轉化，用卡那素進行選擇，經不定芽誘導、芽增殖、不定芽伸長、生根及移栽，得到擬轉化植株。本方法獲得的尾葉桉擬轉化植株，經PCR和RT-PCR檢測表明，外源基因導入了尾葉桉基因組中，并得到表達；在轉蘿卜抗真菌蛋白(RS-AFP2)基因的尾葉桉離體葉片的抗病性檢測中發現，轉化植株對疫霉菌具有較好的抗性；抗性相關酶活測定結果顯示，轉化植株在接種后，苯丙氨酸解氨酶(PAL)、過氧化物酶(POD)、多酚氧化酶(PPO)活性增強。
文檔編號A01H4/00GK102168105SQ201010589838
公開日2011年8月31日 申請日期2010年12月9日 優先權日2010年12月9日
發明者曾富華 申請人:湛江師范學院