專利名稱：一種火把梨β-1,3-葡聚糖酶基因<i>PpGlu</i>及應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及分子生物學以及基因工程技術領域，特別是一種火把梨的具有抗真菌活性的β -1，3-葡聚糖酶(β -1，3-glucanase)基因PpGlu及應用。
背景技術：
真菌病害是造成農作物減產的主要因素之一，由植物病原真菌引起的病害約占植物病害的70 80%，一種作物上可發現幾種甚至幾十種真菌病害。目前，控制真菌病害主要有三種方法一是選育并采用抗性品種，二是使用化學殺菌劑，三是采取合理的耕作制度，如輪作、避免已感染土壤和帶病原植物材料的傳播等。隨著重組DNA技術的創立和發展，能將動物、植物、微生物的基因相互轉移，突破了物種之間難以雜交的天然屏障，開辟了植物育種的新途徑。近年來，一些科學家致力于利用基因工程方法，采用基因轉移技術培育抗真菌病害的作物品種。當植物受到病原菌攻擊或處于其他逆境脅迫時，會在體內產生大量的病程相關蛋白(pathogenesis-related protein，PR)，它們與植物的防衛反應關系密切。植物的β _1，3 葡聚糖酶屬于PR-2家族，是植物防衛反應中合成的一種重要水解酶類，能降解β -1，3葡聚糖，而葡聚糖正是真菌細胞壁的主要成分之一，因此β -1，3葡聚糖酶具有一定的抗菌作用。β -1，3-葡聚糖酶參與植物對病原真菌的防衛反應，并調節植物的生長發育，它們被認為是一類重要的抗真菌蛋白(Mauch F, Hadwiger LA, Boiler Τ. Ethylene: symptom, not signal for the induction of chitinase and beta-1, 3-glucanase in pea pods by pathogens and elicitors. Plant Physiol. 1984，76:607-611)。已知的 β_1，3_ 葡聚糖酶均屬于糖基水解酶第十七家族，分為外切酶和內切酶，目前主要研究的是內切酶。它的分子量為32-37kD，等電點從酸性到堿性。它的作用底物為以β_1，3-苷鍵連接起來的多聚糖，以隨機作用方式將多聚糖分解成為糊精或寡聚糖。β -1，3-葡聚糖酶主要通過2 個途徑增強植物對真菌的抗性1) β-1，3-葡聚糖是大多數植物病原真菌細胞壁的主要成分之一，β-1，3-葡聚糖酶以隨機作用方式將以β-1，3-糖苷鍵連接起來的多聚糖分解成為糊精或寡聚糖，因此可以破壞很多植物病原真菌的細胞壁，使真菌細胞失去支撐，破裂死亡；2)水解真菌細胞壁所產生的多糖或寡聚糖能作為激發子激活或者上調植物防御系統， 如促使植物分泌植物抗毒素，從而間接提高植物的抗病能力(Jach G, Gornhardt B, Mundy Jj Logemann Jj Pinsdorf Ej Leah Rj Schell Jj Maas C. Enhanced quantitative resistance against fungal disease by combinatorial expression of different barley antifungal proteins in transgenic tobacco. Plant J. 1995, 8:97—109)。平皿抑菌實驗表明，0-1，3_葡聚糖酶對大豆疫霉(/%7場功0^^ sojae)、炭疽菌iiblletotrichim lagenarium)的菌絲生長以及孢子的萌發有明顯的抑制作用(Ji C， Kuc J. Purification and characterization of an acidic β -1,3-glucanase from cucumber and its relationship to systemic disease resistance induced by Colletotrichum lagenarium and tobacco necrosis virus. Mol Plant Microbe In.1995，8: 899-905;婁樹寶，彭東君，王輝.大豆β _1，3-葡聚糖酶的抑菌活性.黑龍江八一龍墾大學學報.2008，20:27- )，對小麥紋枯病菌longipes) 和煙草赤星病菌(Alterrmria cerealis)的菌絲生長也有抑制作用，同時對大麗輪枝菌 iyerticillium dahliae)、黃瓜才古妻病病原菌{Fusarium oxysporum f. sp. cucumerinum) 的孢子萌發或芽管伸長也有一定程度的抑制作用(孫斌，李多川，慈曉燕，郭潤芳，王穎.小麥葉片β-1，3-葡聚糖酶的誘導、純化與抗菌活性.植物生理與分子生物學學報. 2004, 30:399-404)。大豆在接種大豆疫霉后，β _1，3-葡聚糖酶和幾丁質的活性增強， β -1，3-葡聚糖酶和幾丁質酶混合液對大豆疫霉菌的菌絲生長、孢子囊形成和孢子萌發的抑制作用明顯，表明β -1，3-葡聚糖酶和幾丁質酶可受大豆疫霉的誘導，且大豆對大豆疫霉根腐病的抗性與β-1，3-葡聚糖酶和幾丁質酶的活性呈正相關(左豫虎，康振生，楊傳平，芮海英，婁樹寶，劉惕若.β-1，3-葡聚糖酶和幾丁質酶活性與大豆對疫霉根腐病抗性的關系.植物病理學報.2009，39:600-607)。葡萄霜霉病菌能誘導葡萄葉片幾丁質酶和β-1，3-葡聚糖酶活性增高，而且兩種酶活性增高的速度和幅度與品種的抗病性呈正相關(史娟，胡景江，王紅玲，滿麗梅，張永麗.霜霉病菌對葡萄細胞壁水解酶的誘導作用與寄主抗病性的關系.西北林學院學報.2002，17:42-44)。通過基因工程的方法，轉入β-1，3-葡聚糖酶基因可提高植物對真菌病害的抵抗力。轉入馬鈴薯β-1,3-葡聚糖酶基因的亞麻(Zi/w usitatissimum L.)，對兩種鐮刀菌/^ oxysporum、F.腫的抗性相對于野生型增強了 3 倍(ffrobel-Kwiatkowska Μ, Lorenc-Kukula K, Starzycki M, Oszmianski J, Kepczynska E, Szopa J. Expression of β -1, 3-glucanase in flax causes increased resistance to fungi. Physiol Mol Plant Pathol. 2004, 65:245-256)。含有大豆β-1，3-葡聚糖酶基因的轉基因煙草能有效地抵御赤星病菌和黑脛病菌(Phytophthora parasitica var. nicotianae) 的侵染(Yoshikawa Μ, Tsuda Μ, Takeuchi Y. Resistance to fungal diseases in transgenic tobacco plants expressin the phytodexin elicitor-releasing factor, β -1, 3-endogulcanase, from soybean. Naturwiss. 1993,
80:417-420)。
發明內容
本發明的目的是從云南火把梨iPyrus pyrifolia Nakai)中克隆獲得編碼 β-1,3-葡聚糖酶的全長基因以及它的應用。本發明的β-1，3_葡聚糖酶基因來自云南火把梨。火把梨是云南本地的沙梨品種，具有穩定遺傳的紅色果皮表型。火把梨對土壤適應性強，抗黑星病、腐爛病，對梨木虱有較強的抗性，并且抗晚霜，耐低溫能力也很強。本發明分離克隆云南火把梨的一個抗真菌相關基因的完整cDNA片段，利用根癌農桿菌介導法將目的基因轉入受體植物中并過量表達，通過進一步試驗驗證該基因是否具有抗真菌的活性，為后期利用該基因改良煙草以及其他植物抵御真菌病害的能力奠定基礎。發明人將這個基因命名為作6^。β -1，3-葡聚糖酶通過水解真菌細胞壁重要成分β -1，3-葡聚糖，使細胞失去支撐，破裂死亡，從而使植物具有抵抗真菌侵染的能力。β-1，3-葡聚糖酶作為一種病程相關蛋白還在小孢子形成、養料供給、開花、花粉形成、種子萌發、果實成熟、芽休眠和傷口愈合等方面起作用。本發明涉及分離包含的DNA片段并鑒定其功能，具有該基因片段的植物在一定程度上具有抵抗特定真菌侵染的表型。其中所述DNA片段如序列表SEQ ID所示， 或者基本相當于SEQ ID所示的DNA序列，或者其功能相當于SEQ ID所示序列的部分片段。對該基因進行序列分析，表明全長cDNA為1217bp，具有1047bp的開放閱讀框 (Open reading frame, 0RF)、29bp 的 5，非翻譯區(untranslated region, UTR)禾口 141bp 的3’UTR，編碼含有348個氨基酸的蛋白質。PpGlu編碼蛋白具有β _1，3-葡聚糖酶的保守
，與: 自胃 (fragaria χ ananassa)、^: ! 胃{Sesbania rostrata)(Malus
X domestica)以及其它物種的β _1，3_葡聚糖酶蛋白高度相似，表明其屬于火把梨中的 β-1，3-葡聚糖酶。超量表達序列表SEQ ID所示序列可以增強煙草對莖點霉屬真菌、交鏈孢、鐮刀菌的抗性。PpGlu基因可以應用于提高植物的真菌抗性，具體操作如下
(1)將基因與適宜的植物超表達載體如pCAMBIA1301、pK2GW7、pCAMBIA2300s等連接， 構建植物超表達載體。(2)將構建的重組載體通過根癌農桿菌介導轉入目標植物中。(3)以重組載體T-DNA上具有的抗性標記篩選轉化子，并通過聚合酶鏈式反應 (Polymerase Chain Reaction, PCR)獲得真正的轉基因植株，接種特定真菌或分析轉基因植物蛋白對真菌生長的抑制活性，最后篩選出對真菌抗性明顯增強的轉基因植株。本發明為提高植物對真菌病害的抗性提供了一種新的方法，通過基因工程手段培育抗病植物能克服傳統育種的不足，不僅育種周期短，而且操作簡單，容易獲得高抗材料。 本發明來自火把梨的作67 基因能增強植物對真菌的抗性，將該基因導入煙草、康乃馨、洋桔梗等植物中，可以產生具有真菌抗性的種質和品種。利用基因工程技術防治真菌病害具有明顯的優勢和不可取代的重要性。它可以為作物、花卉等大規模生產提供方便，大量減少化學農藥的使用，為農業生產節約成本、減小環境污染且提高管理水平，因此本發明具有廣闊的市場應用前景。
圖1是部分轉基因煙草基因組DNA的PCR檢測結果。Marker :DL2000 DNA Marker (大連寶生物)，由 2，000bp、l，000bp、750bp、500bp、250bp 以及 IOObp 六條 DNA 片段組成。 正對照質粒pMD-18T-/^67^/為模板的PCR反應；WT 非轉基因煙草總DNA為模板進行的 PCR ；負對照PCR體系中不包含DNA的反應。圖2是部分陽性轉基因煙草中作轉錄水平表達分析的凝膠電泳圖譜。Marker :DL2000 DNA Marker (大連寶生物)；1_18分別為不同的陽性轉基因煙草單株；WT 非轉基因煙草總RNA逆轉cDNA為模板的PCR產物；負對照PCR體系中不包含模板DNA的反應產物；正對照質粒pMD-18T-/^67^/為模板的PCR產物。圖3 IPpGlu轉基因煙草體外抗真菌活性分析抑菌效果圖。A、B、C圖示中的真菌分別是擬莖點霉屬真菌、交鏈孢和鐮刀菌；WT為野生型煙草的總蛋白；CK為空白對照，即無蛋白對照(用于提取蛋白的緩沖液)。
具體實施方式
實施例全長基因克隆以及序列分析
用液氮將火把梨的紅色果皮研磨成粉末以后，轉入離心管中，采用異硫氰酸胍法提取總RNA。采用逆轉錄酶M-MLV (天根)以總RNA為模板合成cDNA第一鏈，反應體系和操作過程為取5 yg Total RNA，依次加入 50 ng oligo(dT) 15、2 μ L dNTP (2. 5mM each)、 ddH20 (RNase-free)至反應體積為13. 5 μ L ；混勻后，70°C加熱變性5min后迅速在冰上冷卻 5min，然后依次加入 4 μ L 5XFirst-stand buffer,0. 5 μ L RNasin (200U) U μ L M-MLV (200U)、1 yL DTT (0. 1Μ)，混勻并短時離心，42°C溫浴 1. 5h，取出后 95°C加熱 5min， 終止反應。cDNA第一鏈合成后置于-20°C保存備用。以合成的第一鏈cDNA為模板，擴增目的基因作67 所用上下游引物序列分別為 5，GGATCCTTCTCCAATAGCTTCATGCATTT3，和 5，GAATTCTGATTCTGTGACTCC TTCTATCCA3，。采用大連寶生物的高保真DNA聚合酶Ex Taq擴增出目的基因。PCR反應條件94°C 3min ;94°C 30s，58°C 30s, 72°C 1. 5min，32 個循環；72°C lOmin。反應體系 QO μ L)為 1 μ L cDNA、2 μ L IOXEx Taq Buffer,0. 4 μ L dNTP (IOmM each) ,0. 1 μ L上游引物 QO μ Μ)、0· 1 μ L 下游引物(20μΜ)、0. 2 μ L Ex Taq DNA polymerase (5U/μ L)、16. 2 μ L ddH20。PCR 結束后，取5 μ L用于瓊脂糖凝膠電泳，檢測擴增產物的特異性以及大小。由于PCR產物只有一條DNA帶，故直接對PCR產物進行TA克隆，使用的試劑盒為 PMD18-T vector kit (大連寶生物)，反應體系和操作過程為取1. 5 μ L PCR產物，依次加入 1 μ L pMD18-T vector (50ng/ μ L)和 2.5 μ L 2XLigation solution I,混勻后置于16°C過夜反應。采用熱激轉化法將連接產物轉入大腸桿菌DH5 α中。使用含有X_Gal、 IPTG、氨芐青霉素(ampicillin，Amp)的LB固體培養基篩選陽性克隆。挑選若干個白色菌落，搖菌后用擴增作的特異引物鑒定出多克隆位點插入的克隆。將鑒定的克隆進行測序，最終獲得的作以 全長cDNA為1217bp，通過NCBI ORF finder (http://www.ncbi. nlm. nih. gov/gorf/gorf. html)分析發現其包含一個1047bp的開放讀碼框(見序列表)。
編碼一個含348個氨基酸的蛋白質PpGlu，其分子量約為37. 5仙 等電點5.07。就整個蛋白質的氨基酸組成而言，三種疏水氨基酸丙氨酸(A)、亮氨酸(L)、纈氨酸(V)的含量最高，分別為11. 5%、9. 2%,8%0所有中性氨基酸含量為83. 4%，酸性氨基酸含量為8. 9%,堿性氨基酸含量為7. 7%。還含有1個半胱氨酸殘基(C)，位于第39位。借助生物信息學軟件 SignalP 3.0分析作編碼的蛋白序列，檢測其是否具有N端信號肽。結果表明該蛋白的氨基酸殘基1-33為信號肽，可能的剪切位點為33-34，說明PpGlu是一種分泌蛋白。2)植物表達載體構建
采用堿裂解法提取插入的大腸桿菌質粒pMD-18T-/^67^/以及植物表達載體pCAMBIA2300S的質粒，取1 μ L用于瓊脂糖凝膠電泳以檢測所提取質粒的完整性和濃度高低。用(Fermentas)和 Bamm (Fermentas)分別對質粒 pMD-18T_/^67i/
和PCAMBIA2300S進行雙酶切(100 μ L體系)，反應體系和操作過程為取10 μ L pMD-18T-/^67"或 pCAMBIA2300S 質粒、依次加入 10 μ L IOXTango buffer,2 μ L BcoRI,2 uL BamEI,76 μ L ddH20，混勻后短時離心，置于37°C過夜反應。將所有酶切產物點于瓊脂糖凝膠中進行電泳，然后對片段和pCAMBIA2300S大片段分別進行膠回收，整個過程使用UNIQ-10柱式DNA膠回收試劑盒(上海生工)。具體操作流程為切下含有目的 DNA條帶的瓊脂糖凝膠塊置于1.5 mL離心管中，按400 μ L/100 mg瓊脂糖凝膠的比例加入Binding Buffer II，置于60°C水浴lOmin，使膠徹底融化；將融化的凝膠溶液轉移至2 mL收集管內的UNIQ-IO柱中，室溫放置anin后離心Imin (6，OOOg/min)；取下UNIQ-IO柱， 倒掉收集管中的廢液，再將UNIQ-IO柱放入收集管中，加入500 μ L Wash Solution，室溫離心Imin (8，OOOg/min)，再重復此步驟一次；取下UNIQ-10柱，倒掉收集管中的廢液，再將 UNIQ-10柱放入收集管中，室溫離心anin (12，000g/min)；取下UNIQ-10柱放入新的1. 5 mL離心管中，在膜中央加入預熱的20 μ L Elution Buffer，室溫放置anin，室溫離心Imin (12，OOOg/min)，離心管中收集液體即為回收的DNA片段。取1 μ L回收產物通過瓊脂糖凝膠電泳檢測回收片段的大小以及濃度，置于-20°C保存備用。利用T4 DNA Ligase (大連寶生物)，將回收的/DNA片段和pCAMBIA2300S 載體片段連接起來，反應體系OO μ L)和操作過程為取10 μ L PpGlu DNA片段依次加入 2 yL pCAMBIA2300S 載體 DNA、2 μ L 10ΧΤ4 DNA Ligase BufferU μ L Τ4 DNA Ligase、 5 μ L ddH20，混勻后短時離心，置于16°C金屬浴過夜反應。接著采用熱激轉化法將連接產物轉入大腸桿菌DH5a中，用含有50mg/L卡那霉素(kanamycin，Km)的固體培養基篩選陽性克隆。挑選單菌落搖菌，以菌液為模板用擴增的特異引物進行PCR，挑選出PpGlu 與PCAMBIA2300S成功連接的克隆，所檢測的菌株若為陽性，加入甘油并置于-80°C保存備用。用堿裂解法提取并純化上述大腸桿菌中的pCAMBIA2300S-/^67 質粒。并制備根癌農桿菌LBA4404菌株的感受態細胞，操作過程為將實驗室保存的LBA4404菌株在LB 固體培養基(含利福平20mg/L)上劃線培養至長出單菌落后，挑取一個單克隆于含 20mg/L利福平的2 mL LB液體培養基，28°C振蕩培養至混濁；取5 mL菌液轉接于含20mg/L 利福平的100 mL LB液體培養基中，28°C振蕩培養至OD600為0. 5 ；4°C離心5min (5，000g/ min)收集菌體，棄上清，加入10 mL預冷的0. IM CaCl2,輕輕充分懸浮菌體，冰浴20min ； 接著4°C離心5min (5，OOOg/min)收集菌體，棄上清，加入4 mL預冷的含15%甘油的0. IM CaCl2溶液，充分懸浮后分裝于1.5 mL離心管中，每管200 μ L，液氮速凍后置于-80°C保存采用液氮凍融法將上述構建的植物表達載體pCAMBIA2300S_/^67i/轉入所制備的農桿菌LBA4404感受態細胞中。操作步驟為取2 μ g pCAMBIA2300S_/^67i/質粒加入含有200 μ L感受態細胞的離心管中，輕輕混勻后冰浴5min，接著轉入液氮中冷凍lmin，然后迅速置于37°C水浴5min，之后立即冰浴2min，加入800 μ L LB液體培養基，振蕩培養 4h。將活化后的農桿菌涂于含有50mg/L Km的LB固體培養基上，28°C靜止培養。挑選單菌落搖菌，用擴增的特異引物進行PCR，檢測pCAMBIA2300S-/^67^/是否轉入農桿菌中。 對于陽性克隆，加入甘油后置于-80°C保存備用。3)農桿菌介導的植物遺傳轉化以及轉基因植物篩選
本實驗的轉基因受體是煙草mcotiana tabacum L.)。將煙草種子用75%的酒精浸泡 30s,用無菌水洗滌后用0. 1%的HgCl2浸泡8min，然后再用無菌水洗滌若干次，播種于1/2
7MS培養基上，暗培養5-8d，發芽后轉至光照培養箱(25°C，16h/d光照)，以后每月用MS
培養基繼代一次。從-80°C冰箱中取出保存的含有pCAMBIA2300S-/^67i/質粒的農桿菌LBA4404菌種，接種于5 mL含有50mg/L Km和20mg/L利福平的LB液體培養基中，28 °C培養至渾濁。吸取1 mL渾濁的菌液至含有50mg/L Km的LB固體培養基上，培養48h。將LB固體培養基上的農桿菌刮下適量接種于MGL液體培養基中，附加一定量的乙酰丁香酮振蕩培養2- 以活化農桿菌。取煙草無菌苗葉子切成Icm2左右的葉盤，完全浸泡于上述含有活化農桿菌的MGL 液體培養基中，浸染時間為15min。用無菌濾紙吸干葉片表面的菌液，將葉盤置于共培養基上進行室溫培養。煙草轉化的共培養基為MS+0. Oang/L 6-BA+2 mg/L NAA+30g/L sucrose, 無光條件下22°C共培養2天。將共培養后的葉盤轉到加有抗生素的MS篩選培養基中分化成苗，同時篩選轉基因植株。煙草篩選培養基為 MS+0. 5mg/L 6-BA+O. lmg/L NAA+30g/L sucrose+50mg/L Km+200mg/L頭孢霉素(cefotaxime sodium salt, Cef)；篩選培養時將培養瓶轉移至光照培養箱培養(25°C，16h/d光照，8h/d黑暗)。出芽后用含有50mg/L Km和200mg/L Cef的 MS培養基繼代培養。因煙草愈傷分化率較高，故需要對再生植株進行進一步篩選。將煙草再生苗移至含有50mg/L Km和200mg/L Cef的MS培養基上使其生根，最后選用生根較好的再生苗做進一步的檢測。采用CTAB法提取轉基因煙草植株葉片的基因組DNA，將提取的基因組DNA取1 μ L通過瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性和濃度。以轉基因植株的基因組DNA為模板用擴增
的特異引物進行PCR。PCR結束后，取8 μ L產物用于瓊脂糖凝膠電泳以檢測陽性轉基因植株。部分煙草轉基因植株的擴增結果如圖1所示。轉基因煙草共篩選到18株陽性轉基因植株，分別編號為1 18。^PpGlu表達分析以及轉基因植株抗真菌活性分析
取陽性轉基因單株以及非轉基因煙草(野生型，WT)的嫩葉提取總RNA，逆轉錄生成 cDNA第一鏈，并以此為模板用擴增作67 的特異引物進行PCR，根據PCR結果分析各轉基因單株中作轉錄水平的表達。總RNA提取以及RT-PCR的方法與步驟與1)中相同。PCR 結束后，取5 μ L用于瓊脂糖凝膠電泳，部分單株的檢測結果如圖2所示。共檢測到10株轉基因單株中在轉錄水平有表達，這些單株的編號為1、3、4、8、11、13、15、16、17、18。將實驗室保存的幾種真菌接種于PDA固體培養基O00g/L馬鈴薯，15g/L瓊脂， 20g/L葡萄糖)上，倒置培養，待菌落生長至直徑約為3cm時添加蛋白，分析轉基因植株體外抗真菌活性。供試真菌共有6種擬莖點霉屬真菌、交鏈孢、鐮刀菌、黑曲霉、青霉、煙草疫霉。為了防止其它雜菌污染所提取的蛋白，整個植物蛋白提取過程均是無菌操作。首先取1 g轉基因煙草單株(編號分別為1、3、4、8、11)或野生型葉片放入研缽中，加入1 mL 蛋白提取液(1M NaCl, 0. IM乙酸鈉，1% PVP，pH5)，充分研磨。轉入1.5 mL離心管中，混勻后4°C靜置過夜。4°C離心30min (12，OOOg/min)，取上清于新的1. 5 mL離心管中，并取適量用紫外分光光度儀測定總蛋白濃度。將轉基因和野生型植株的總蛋白濃度調整至6mg/ mL，然后分別取20 μ L滴于各真菌培養基的濾紙上。在每個真菌的平板上除了添加不同轉基因煙草植株的總蛋白，同時平行添加野生型煙草的總蛋白和空白對照(提取蛋白所用的溶液)。培養幾天后觀察各處理抑菌真菌生長的情況，并據此評價作轉基因煙草的體外抗真菌活性。結果如圖3所示，PpGlu轉基因煙草蛋白對擬莖點霉屬真菌、交鏈孢、鐮刀菌有不同程度的抑制作用，而對實驗所用其它真菌無抑制作用。
權利要求
1.一種火把梨β-1，3-葡聚糖酶基因作67 其特征在于它具有序列表中SEQ ID所述的堿基序列，作67 的編碼區是序列表SEQ ID中第30-1076位所示的核苷酸序列或是編碼蛋白質與SEQ ID編碼蛋白質相同的其它DNA序列,PpGln全長1217bp，具有1047bp的開放閱讀框(ORF)、29bp的5，非翻譯區和141bp的3，非翻譯區，編碼含有348個氨基酸的蛋白質。
2.權利要求1所述的火把梨β-1，3-葡聚糖酶基因作67 在提高煙草對鐮刀菌、交鏈孢等多種真菌抗性中的應用。
3.根據權利要求2所述的火把梨β-1，3-葡聚糖酶基因作67 的應用，其特征在于提高植物的真菌抗性的具體操作如下(1)將上述基因與適宜的植物超表達載體pCAMBIA1301、pK2GW7、pCAMBIA2300s連接， 構建植物超表達載體；(2)將上述構建的重組載體通過根癌農桿菌介導轉入目標植物中；(3)以重組載體T-DNA上具有的抗性標記篩選轉化子，并通過聚合酶鏈式反應獲得真正的轉基因植株，接種特定真菌或是分析轉基因植物蛋白對真菌生長的抑制活性，最后篩選出對真菌抗性明顯增強的轉基因植株。
全文摘要
本發明涉及具有抗真菌活性的火把梨β-1,3-葡聚糖酶基因PpGlu及應用。PpGlu基因具有SEQID所述的堿基序列，編碼β-1,3-葡聚糖酶。本發明通過功能基因組學相關技術證實PpGlu基因具有提高植物抗真菌的功能。將本發明抗真菌PpGlu基因構建到植物表達載體上并轉入煙草中過量表達，轉基因煙草具有很強的體外抗真菌活性。表達PpGlu的轉基因煙草的蛋白提取液對擬莖點霉屬真菌、交鏈孢、鐮刀菌有不同程度的抑制作用。
文檔編號A01H5/00GK102174547SQ20111000780
公開日2011年9月7日 申請日期2011年1月14日 優先權日2011年1月14日
發明者丁為群, 劉迪秋, 周阿濤, 李文嫻, 王光勇, 葛鋒, 陳朝銀, 饒健 申請人:昆明理工大學