專利名稱：利用idp分子標記輔助選育玉米自交系的方法
技術領域：
本發明屬于作物育種技術領域，涉及一種玉米自交系的選育方法，特別是涉及一種利用分子標記手段輔助選育玉米自交系的方法。
背景技術：
玉米(Zm是現代食品、飼料、醫藥及化工的重要原料作物。近年來玉米生產發展較快，成為世界第三大作物，播種面積和總產量僅次于水稻和小麥。隨著人口增加、 畜牧業以及農產品加工業不斷發展，對玉米的需求還將持續增長。我國是世界玉米第二大生產國，玉米在我國農業生產、國民經濟中占有十分重要的地位。現有玉米自交系選育方法通常是由玉米品種群體或者各類雜交種被連續多代自交和選擇而分離出有利基因位點純合或基本純合、性狀整齊一致的自交后代。上述群體可以是F2代群體、回交群體，也可以是包含兩個或兩個以上后代的群體。常規玉米自交系選育主要存在兩個問題第一，玉米自交系選育主要是依據選育者工作經驗，在育種材料表型性狀觀察的基礎上進行選擇，這種選擇對單基因控制性狀有利，對多基因控制的數量性狀不利，而大部分性狀是由多基因控制的，基因之間存在互作而且極易受環境影響。第二，傳統方法對基礎材料的選擇至少需要6 8個自交世代，因而育種周期比較冗長，需要耗費較多的人力、財力等資源。在作物育種中，最有效的選擇方法是直接依據植株的基因型進行選擇。分子標記輔助選擇(MAS)可在早代對目標基因進行準確、穩定的選擇，從而加速育種進程，提高育種效率。近年來，MAS報道不斷增多，而且已在水稻、小麥、玉米等主要作物的育種實踐中應用并取得了較大的研究進展，主要包括基因轉移、基因聚合和數量性狀MAS。Tanksley等通過計算機模擬分析得出結論采用MAS只需3代即可使雜交種恢復到接近輪回親本的基因型。 Moreau等、Berloo等、Hospital等和吳為人等分別發表多篇研究論文，闡述了 MAS的方法和影響因素，這為MAS的實施提供了理論依據。各國學者已經構建水稻、小麥、玉米、棉花、 大豆等作物群體并且開發了數量巨大的分子標記，其中不乏與農藝性狀相關的分子標記， 這為MAS的應用奠定了基礎。國際水稻研究所利用4個含有不同水稻白葉枯病抗性基因 (xa4、xa5、xa3、xa21)近等基因系進行抗逆基因的聚合，所產生的抗性基因累積的品系比含有單個抗性基因的品系具有更高的抗性水平和對病原菌更廣的抗譜。陳升等以IRBB21為供體材料，利用4個與xa21緊密連鎖的分子標記對‘明恢63’進行分子標記輔助改良，獲得了抗白葉枯病材料‘明恢63’。美國學者將玉米與產量相關的一些數量性狀基因座位轉移到了 B73和Mol7等自交系中，由這些自交系組配的雜交種產量比對照產量提高15%以上。 張世煌等利用與opaque-2基因緊密連鎖的分子標記進行了優質蛋白玉米的分子標記輔助選擇，建立了一套經濟實用的優質蛋白玉米分子標記輔助育種體系。大量的理論研究和實踐證明，MAS是實現作物快速高效育種的手段。一般來說，MAS對由多基因控制性狀的選擇效果比對單基因控制性狀選擇效果明顯，它具有以下優點不受季節、環境因素變化影響， 不受基因表達與否限制；多態性高，存在豐富的等位變異；數量豐富，多態性遍及整個基因組，表現為“中性”，不影響目標性狀的表達，與不良性狀無必然連鎖；許多分子標記表現共顯性，能鑒別純合雜合基因型，提供完整的信息，結果可靠。IDP (insertion-deletion length polymorphism)分子標記所建立的遺傳標記數量大，可以在植物不同發育階段、不同環境條件、不同組織中進行檢測。IDP分子標記技術具有共顯性，可以從DNA分子水平上觀察選擇材料的位點純合度，可以在自交系選育早代發現基因位點純度較高的材料。IDP分子標記不涉及雜交、酶切，在檢測上使用瓊脂糖凝膠檢測，與目前常用的SSR聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測相比更加方便快捷，而且瓊脂糖膠可以重復使用，比聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測更加經濟節省。現有技術表明，目前玉米自交系選育尚沒有利用IDP標記技術進行分離后代位點純合體篩選輔助玉米自交系選育的技術文獻報道。
發明內容
針對上述問題，本發明的目的是提供一種利用IDP分子標記輔助選育玉米自交系的方法。本發明所提供的利用IDP分子標記輔助選育玉米自交系的方法包括以下步驟
1)篩選對玉米自交系選育基礎材料&代群體具有多態性的IDP引物20對；所述IDP 弓丨物序列來自網站www.maizegdb. org.；
篩選出的對玉米自交系選育基礎材料&代群體具有多態性的IDP引物滿足以下條件 每對同源染色體上至少2對IDP引物，位于一對同源染色體上的兩對IDP引物位點之間的遺傳距離不小于50cM ；
2)利用步驟1)篩選到的20對IDP引物中的10對引物篩選S1世代群體，得到上述10 對IDP引物中隨機η對IDP引物位點純合單株并獲得其自交果穗，所述10對IDP引物位于 10對同源染色體上；
3)利用步驟1)篩選到的對玉米自交系選育基礎材料&代群體具有多態性的IDP引物中除去步驟2)中所用的IDP位點純合之外的20-η對IDP引物，篩選&世代群體，得到在所述20-η對IDP引物位點純合的&世代群體單株，即為候選玉米自交系；
針對本發明&群體大小與不同位點的純合概率，η的取值范圍在6 < η < 8區域內比較適宜。其中，&表示玉米自交系選育基礎材料的種子及長成的植株^表示由&植株自交產生的種子及長成的植株A2表示由S1自交產生的種子及長成的植株。所述玉米自交系選育基礎材料可為單交種、品種間雜交種、品種與自交系間雜交種或綜合雜交種。當所述玉米自交系選育基礎材料為單交種，所述單交種的父本和母本已知時，可按如下方法篩選對玉米自交系選育基礎材料&代群體具有多態性的IDP引物以單交種、 母本和父本的基因組DNA為模板，利用候選IDP引物進行PCR擴增，檢測PCR產物的多態性。 在父本和母本之間有多態性并且在單交種PCR產物中包含父母本PCR產物所對應的IDP引物即為對玉米自交系選育基礎材料&代群體具有多態性的IDP引物。在這種情況下，所述 IDP引物位點純合的單株為S1世代群體或&世代群體中與單交種父本或母本該IDP引物 PCR擴增產物帶型一致的單株。
當所述玉米自交系選育基礎材料為單交種，所述單交種的父本和母本未知時，可按照如下方法篩選對玉米自交系選育基礎材料&代群體具有多態性的IDP引物以S1世代群體單株的基因組DNA為模板，利用候選IDP引物進行PCR擴增，檢測PCR產物的多態性。在S1世代群體中PCR產物會產生三種帶型，其中兩個PCR產物帶型為一條帶，記作帶型 I >111 ；第三種帶型產物包括帶型I、III產物，記作帶型II。產生帶型Ι、ΙΙ、ΙΙΙ的單株數目基本符合1 2 1的比例(理論上三種帶型比例為1 2 1，但當位點具有偏分離現象時不符合1 2 1比例，本實驗中偏分離現象不影響IDP位點純合篩選)的IDP弓丨物即為對玉米自交系選育基礎材料&代群體具有多態性的IDP引物。在這種情況下，所述IDP引物位點純合的單株為S1世代群體或&世代群體中與所述S1世代群體中該IDP引物的帶型I 或III 一致的單株。本發明提供了利用IDP分子標記輔助選育玉米品種鄭單958自交系的方法，該方法包括以下步驟
1)以鄭單958為玉米自交系選育基礎材料，從網站www.maizegdb.org.提供的IDP引物中篩選出以下20對對鄭單958玉米自交系選育基礎材料S0代群體具有多態性的IDP引物IDP182、IDP126、IDP2485、IDP456、IDP125、IDP484、IDP483、IDP281、IDP4030、IDP89、 IDP3887、IDP177、IDP4082、IDP705、IDP535、IDP119、IDP709、IDP549、IDP582 和 IDP1471 ；
2)利用引物IDP182、IDP2485、IDP125、IDP483、IDP4030、IDP3887、IDP4082、IDP535、 IDP709和IDP582篩選S1世代群體，得到其中隨機η對(6彡η彡8)IDP引物位點純合單株并獲得其自交果穗；
3)利用引物IDPU6、IDP456、IDP484、IDP281、IDP89、IDP177、IDP705、IDPl 19、IIDP549、 IDP1471以及步驟2)所用IDP引物中未純合的10_n對IDP引物共20_n對IDP引物篩選 S2世代群體，得到在所述20-n個IDP引物位點純合的&世代群體單株，即為候選玉米自交系。其中，所述步驟2)中未純合的的10-n對IDP引物對于不同S1代中選單株有不同的組合。為了兼顧工作量和篩選效率，本發明所述&代群體由20個單株組成，S1代群體由 2000個單株組成，S2代群體由340個單株組成。進而，本發明將上述方法獲得的候選玉米自交系結合Sp &世代群體的農藝性狀和&世代配合力/血緣測定結果，來選育玉米自交系。本發明利用IDP分子標記輔助選育玉米自交系的方法利用了 IDP分子標記技術具有共顯性的特點，從DNA分子水平上檢測自交系育種基礎材料分離世代的位點純合度，在自交系選育早代發現基因位點純合的材料。該方法比傳統玉米育種依靠經驗在表型性狀水平上推測育種材料的基因型純合情況更為科學、直觀，同時結合農藝性狀、配合力和血緣鑒定，選擇基因型純合、表現型一致、配合力較高的自交系。若選擇的多態性位點是與農藝性狀相關的位點，則選擇目的性更強。本發明方法克服了常規育種的缺陷，提供了一種比SSR 更加方便快捷、經濟有效的選育自交系方法，實現了基因型和表現型的雙重選擇，大大提高了純合體的選擇效率，有效縮短了自交系的選育周期，加快了育種進展。本發明利用IDP分子標記輔助選育玉米自交系的方法建立了高效、快捷的玉米自交系選育體系。IDP分子標記技術具有操作簡單，重復性好，實驗成本低等特點，并且IDP標記引物豐富，目前已經有5000多對公布在maizegdb. org網站上，并且正在不斷增加、更新中。本發明方法操作簡單，可以顯著縮短自交系選育時間，育種成本較常規方法在人力、財力等方面有明顯降低，有利于在目前的商業育種中推廣和利用。
圖1為篩選在鄭單958、母本鄭58、父本昌7_2間具有多態性的部分IDP引物擴增電泳圖譜。Fl表示單交種鄭單958，早表示母本鄭58，$表示父本昌7-2，M表示DNA Marker。圖2為利用引物IDP1471鑒定鄭單958的S1世代群體中IDP1471位點純合的部分單株擴增電泳圖譜。泳道 2、3、4、5、6、8、9、10、11、14、15、17、18、21、22、23、30、35、38、39、 41、42、44、47純合，其余泳道為IDP1471位點雜合或帶型模糊難以分辨的泳道。圖3為利用引物IDP709鑒定鄭單958的&世代群體中IDP709位點純合的部分單株電泳圖譜。泳道1、3、10、13、25、37、42為IDP709位點雜合或帶型模糊難以分辨的泳道， 其余泳道在此位點表現純合。
具體實施例方式本實施例以單交種鄭單958為基礎材料，選育玉米自交系。本實施例中的實驗方法，如無特別說明，均為常規方法。本實施例中的百分含量， 如無特別說明，均為質量百分含量。本實施例中使用的各種IDP引物均合成于上海生工；Taq DNA聚合酶、dNTP等生物試劑均購自Transgene生物公司。一、篩選對鄭單958 S0代群體具有多態性的IDP引物。一)提取鄭單958單交種、母本鄭58和父本昌7_2基因組DNA。按照CTAB法提取鄭單958單交種、母本鄭58和父本昌7_2基因組DNA，具體方法如下。1、分別取鄭單958、鄭58、昌7_2單株的新鮮葉片lg，放入1. 5ml離心管中，然后放
入液氮中預冷。2、取出液氮中的離心管，用電轉快速研磨離心管中的葉片，直到磨成粉末狀為止。3、將裝有葉片粉末的離心管中加入預熱至65°C的CTAB緩沖液(1. 4M NaCl ；20mM EDTA, pH=8. 0 ； IOOmM Tris · HCl，pH=8. 0 ；3%CTAB ；0. 2% β -巰基乙醇)400μ1，蓋緊管蓋，迅速顛倒混勻。4、將離心管置于65°C水浴鍋，溫浴30min，其間輕搖2_3次。5、取出離心管，每管加入400μ1氯仿異戊醇(24 1)，輕微徹底混勻，室溫下 12000g 離心 IOmin06、取上清，加入800μ1無水乙醇，顛倒混勻，置于_20°C冰箱30min以充分沉淀 DNA。7、室溫下12000g離心lOmin，棄上清后加入70%無水乙醇800μ1洗滌2_;3min，室溫下8000g離心5min。8、棄上清，在超凈臺上風干，加入含lOPg/ml RNaseA滅菌水50μ1充分溶解DNA。溶解后置于-20°C冰箱中備用。
提取的DNA經紫外線分光光度計檢測純度和濃度，稀釋配成50ng/^l的DNA，即可進行PCR擴增，擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳分離獲得擴增指紋圖譜。
二)IDP引物擴增。
本實施例從隨機抽取的分布于玉米染色體上的共68個IDP引物中篩選得到在鄭單958的父本和母本間具有多態性的20對引物IDP182、IDP126、IDP2485、IDP456、IDP125、 IDP484、 IDP483、 IDP281、 IDP4030、 IDP89、 IDP3887、 IDP177、 IDP4082、 IDP705、 IDP535、 IDP119、IDP709、IDP549, IDP582和IDP1471，以上20對引物滿足每對同源染色體分別取 2對IDP引物，2對IDP引物之間遺傳距離至少50cM的條件。所述IDP引物序列來自網站 www. maizegdb. org0
具體的實驗方法如下1、預先將PCR擴增儀(GeneAmpPCR System 9700)加熱至94°C (熱啟動可保證得到特異的PCR擴增產物)；2、在PCR管中依次加入以下組分
權利要求
1.利用IDP分子標記輔助選育玉米自交系的方法，包括以下步驟1)篩選對玉米自交系選育基礎材料&代群體具有多態性的IDP引物20對；所述IDP 弓丨物序列來自網站www.maizegdb. org.；篩選出的對玉米自交系選育基礎材料&代群體具有多態性的IDP引物滿足以下條件 每對同源染色體上至少2對IDP引物，位于一對同源染色體上的兩對IDP引物位點之間的遺傳距離不小于50cM ；2)利用步驟1)篩選到的20對IDP引物中的10對引物篩選S1世代群體，得到上述10 對IDP引物中隨機η對IDP引物位點純合單株并獲得其自交果穗，所述10對IDP引物位于 10對同源染色體上；3)利用步驟1)篩選到的對玉米自交系選育基礎材料&代群體具有多態性的IDP引物中除去步驟2)中所用的IDP位點純合之外的20-η對IDP引物，篩選&世代群體，得到在所述20-η對IDP引物位點純合的&世代群體單株，即為候選玉米自交系。
2.根據權利要求1所述的利用IDP分子標記輔助選育玉米自交系的方法，其特征是所述η的取值范圍在6彡η彡8區域內。
3.根據權利要求1所述的利用IDP分子標記輔助選育玉米自交系的方法，其特征是所述玉米自交系選育基礎材料為單交種、品種間雜交種、品種與自交系間雜交種或綜合雜交種。
4.利用IDP分子標記輔助選育玉米品種鄭單958自交系的方法，該方法包括以下步驟1)以鄭單958為玉米自交系選育基礎材料，從網站www.maizegdb. org.提供的IDP引物中篩選出以下20對對鄭單958玉米自交系選育基礎材料S0代群體具有多態性的IDP引物IDP182、IDP126、IDP2485、IDP456、IDP125、IDP484、IDP483、IDP281、IDP4030、IDP89、 IDP3887、IDP177、IDP4082、IDP705、IDP535、IDP119、IDP709、IDP549、IDP582 和 IDP1471 ；2)利用引物IDP182、IDP2485、IDP125、IDP483、IDP4030、IDP3887、IDP4082、IDP535、 IDP709和IDP582篩選S1世代群體，得到其中隨機η對(6彡η彡8)IDP引物位點純合單株并獲得其自交果穗；3)利用引物IDPU6、IDP456、IDP484、IDP281、IDP89、IDP177、IDP705、IDPl 19、IIDP549、 IDP1471以及步驟2)所用IDP引物中未純合的10_n對IDP引物共20_n對IDP引物篩選 S2世代群體，得到在所述20-η個IDP引物位點純合的&世代群體單株，即為候選玉米自交系。
5.根據權利要求4所述的利用IDP分子標記輔助選育玉米品種鄭單958自交系的方法，其特征是所述η的取值范圍在6 < η < 8區域內。
6.利用權利要求1的IDP分子標記輔助選育玉米自交系的方法獲得的候選玉米自交系結合Si、S2世代群體的農藝性狀和&世代配合力/血緣測定結果選育玉米自交系。
全文摘要
利用IDP分子標記輔助選育玉米自交系的方法，包括以下步驟1)篩選對玉米自交系選育基礎材料S0代群體具有多態性的IDP引物20對；2)利用20對IDP引物中的10對引物篩選S1世代群體，得到上述10對IDP引物中隨機n對IDP引物位點純合單株并獲得其自交果穗；3)利用步驟1)篩選到的對玉米自交系選育基礎材料S0代群體具有多態性的IDP引物中除去步驟2)中所用的IDP位點純合之外的20-n對IDP引物篩選S2世代群體，得到在所述20-n對IDP引物位點純合的S2世代群體單株，即為候選玉米自交系。本發明建立了高效、快捷的玉米自交系選育體系，可以顯著縮短自交系選育時間。
文檔編號A01H1/02GK102511372SQ20111030703
公開日2012年6月27日 申請日期2011年10月12日 優先權日2011年10月12日
發明者余愛麗, 劉永忠, 常海霞, 杜艷偉, 王國英, 王高鴻, 趙晉鋒, 郭二虎 申請人:山西省農業科學院谷子研究所