專利名稱：基于微觀動態離子流技術檢測水稻真菌性立枯病的方法
技術領域：
本發明屬于農業技術領域，具體地說，涉及一種基于微觀動態離子流技術檢測水稻真菌性立枯病的方法。
背景技術：
水稻是我國第一大糧食作物，但是目前在全國各稻區生產中普遍存在苗期病秧、 弱秧多，尤其是近年來旱育秧技術的普遍使用，真菌性立枯病也常有發生，發病率很高。另外在水稻育種過程中如果發生真菌性立枯病會造成嚴重損失，重者導致前期育種工作白費，輕者浪費時間，錯過農時。真菌性立枯病是由半知菌亞門的鐮刀菌感染而發生的真菌性病害，鄭雯等Q001) 分離得到了可以感染水稻的5個鐮刀菌和1個立枯絲核菌(鄭雯，臺蓮梅，王桂海，辛惠普黑龍江東部稻區水稻立枯病病原真菌的分離鑒定黑龍江八一農墾大學學報[J]2001， 4:21-23)。蘇寶華等Q010)認為真菌性立枯病多發生在離乳期，葉片展不開，種子和莖部根基部位交界處發生霉變，同時莖的基部發生腐爛，根變成黃褐色，真菌性立枯病嚴重危害水稻生產(蘇寶華寒地水稻立枯病的發病原因及防治措施中國農村小康科技[J]2010，7 60-61)。迄今為止，對水稻真菌性立枯病的研究都是在防治角度，在病害評價角度還未見有報道。微觀動態離子流檢測技術，是一項基于Nernst方程和Fick' s第一擴散定律計算離子和分子的濃度和流速的技術，所檢測的離子或分子的靈敏度可達10-12mol/Cm2. s，這種技術的特點是對材料無損的條件下對細胞、組織、器官、整株材料的外周進行離子和分子檢測，最終獲得離子或分子的運動速率、方向及濃度信息等。該技術應用廣泛，在生命科學、 環境科學、材料科學等領域被廣泛采用。已有報道中對水稻真菌性立枯病的防治方法很多，如韓潤亭(申請號 200810051023) 一種防治水稻惡苗病和立枯病的農藥；王國強(申請號00103926)稀土生物農藥水稻種衣劑。上述發明主要是針對真菌性立枯病的防治類農藥，但是對真菌性立枯病的早期評價方法未見報道。利用微觀動態離子流檢測技術可測得真菌性立枯病發病時的離子流信息，通過與正常生長的水稻比較，獲得真菌性立枯病發病時的離子流吸收或釋放規律，利用此規律評價真菌性立枯病的發生。以往檢測離子流的方法為原子吸收分光光度法，如高葉等O008) 研究NaCl對甘薯試管苗影響時通過原子吸收分光光度法檢測離子含量判斷收脅迫的程度(高葉，趙術珍，陳敏，宋曉征，王寶山=NaCl脅迫對甘薯試管苗生長及離子含量影響， 安徽農業科學[J]，2008，36 (35) :15333-15335)；郭小俊等(2008)研究ABA對NaCl脅迫下的黃瓜幼苗影響時，也利用原子吸收分光光度法檢測離子含量研究黃瓜幼苗耐鹽機理 (郭小俊，謝成俊外源ABA對NaCl脅迫下黃瓜幼苗不同離子含量的影響，中國蔬菜[J]， 2008(9)27-30)。然而，該方法不能實現活體生物材料的無損、動態檢測，破壞了植物的生活狀態。因此，開發新的檢測水稻真菌性立枯病的方法具有非常重要的意義。
發明內容
本發明旨在為水稻育苗和水稻育種提供一種快速、無損的檢測水稻真菌性立枯病的新方法。為了實現本發明目的，本發明的一種基于微觀動態離子流檢測水稻真菌性立枯病的方法，其是利用微觀動態離子流檢測技術分別檢測水稻根系K+、NH4+和Ca2+的吸收能力， 檢測出感染真菌性立枯病的水稻，所述離子流流向處于外流或者是內流幅度較對照變小即為感染真菌性立枯病。其中，檢測使用的水稻處于幼苗期。前述的方法，微觀動態離子流檢測技術中測試緩沖液中的測試離子濃度為 0. 05 0. 15mM。前述的方法，檢測使用的水稻處于2葉1心期，測量位置為距所述水稻苗根尖 300 500 μ m的根尖分生區的外表面20 50 μ m處。具體地，前述方法包括以下步驟(1)向微電極中灌入離子灌充液至充滿所述電極尖端1cm，再將電極前端吸入相應的測試離子交換劑；( 將經過步驟(1)處理后的電極套入已氯化的Ag/AgCl電極線基座，并放入校正液中校正；(3)取待測水稻苗，將其根部先放在測試緩沖液中平衡30min左右，再用校正后的電極對待測水稻苗進行檢測10 15min ； (4)對檢測結果進行處理和分析。其中，上述步驟(1)所述離子灌充液為80 140mM KC1、80 140mM NH4Cl和 80 140mM CaCl2 ；步驟(1)所述電極的前端吸入的測試離子交換劑的長度為K+100 200 μ m ；NH4+20 50 μ m 禾口 Ca2+15 30 μ m ；上述步驟(2)所述的校正液為Κ+0· 05 0. 15mM KCl和0. 5 1. 5mM KCl ；NH4+ 0. 05 0. 15mM NH4Cl 和 0. 5 1. 5mM NH4Cl ；Ca2+ :0. 05 0. 15mM CaCl2 和 0. 5 1. 5mM CaCl2 ；上述步驟(3)所述的測試緩沖液為:K+或Ca2+ :0. 05 0. 15mM KC1、0. 05 0. 15mM CaCl2,0. 05 0. 15mM MgCl2、0. 3 0. 6mM NaCl、0· 1 0· 3mM Na2SO4 和 0· 2 0. 5mM MES ； NH4+ :0. 8 1. 2mM KCl、0· 05 0. 15mM CaCl2 和 0· 05 0. 15mM NH4C1。前述方法中校正后電極的能斯特方程計算理想值為K+ 56 60mV ；NH4+ 56 60mV ；Ca2+ 25 29mV。前述方法中所述K+離子流的流速為10 500pmol. cm_2. s—1，NH4+離子流的流速為 10 500pmol. cnT2. s-1，Ca2+ 離子流的流速為 10 500pmol. cnT2. s-1。本發明利用微觀動態離子流檢測技術可測得真菌性立枯病發病時的離子流信息， 通過與正常生長的水稻比較，獲得真菌性立枯病發病時的離子流吸收或釋放規律，利用此規律評價真菌性立枯病的發生，從而實現對水稻真菌性立枯病的快速、無損檢測，檢測后的植株材料還能夠正常生長，避免了珍貴水稻苗的損失，檢測結果對比明顯，方法可靠，為水稻育苗和水稻育種提供了一種快速、無損的檢測水稻真菌性立枯病的新方法。
圖1是本發明基于微觀動態離子流檢測技術檢測水稻真菌性立枯病的實驗過程圖。
圖2是水稻真菌性立枯病與正常水稻苗的K+離子流分析圖(實時流速)。圖3是水稻真菌性立枯病與正常水稻苗的K+離子流分析圖(平均流速)。圖4是水稻真菌性立枯病與正常水稻苗的NH4+離子流分析圖(實時流速)。圖5是水稻真菌性立枯病與正常水稻苗的NH4+離子流分析圖(平均流速)。圖6是水稻真菌性立枯病與正常水稻苗的Ca2+離子流分析圖(實時流速)。圖7是水稻真菌性立枯病與正常水稻苗的Ca2+離子流分析圖(平均流速)。圖8所示為利用微電極檢測時，電極距離根尖的位置。其中，圖2、圖4和圖6中縱坐標為離子流速，單位為pmol. cm_2. 橫坐標為時間， 單位為s ；圖3、圖5和圖7中縱坐標為離子流速，單位為pmol. cm_2. S—1。
具體實施例方式以下實施例用于說明本發明，但不用來限制本發明的范圍。若未特別指明，實施例中所用的技術手段為本領域技術人員所熟知的常規手段，所用原料均為市售商品。其中，水稻品種龍粳26購自黑龍江省農科院佳木斯水稻研究所。實施例1.實驗方法實驗材料及培養條件材料為水稻品種龍粳沈，種子經過曬種，鹽水6/25 (m/v) 篩選后，浸種，25°C催芽，播種在育苗秧盤中，土壤營養土 = 3 1，施底肥硫酸銨(1斤 /1000斤土壤)和磷酸二銨O斤/1000斤土壤)，自然光照，培養地點在北京農業信息技術研究中心溫室，秧苗在2葉1心時水稻真菌性立枯病開始發生，此時開始離子流檢測。2.實驗儀器及耗材離子流檢測用非損傷微測系統(BIO-OOlBJoungerUSA Sci. &Tech. Corp.，USA)， 軟件imFlux，采用尖端直徑為2-4 μ m的玻璃微電極。3.實驗試劑及溶液(1)液態離子交換劑包括K+ 貨號 Potassium ionophore I-cocktail A ；Sigma-Aldrich, Louis, MO 63103，USA ；NH4+ 貨號 Ammonium ionophore I-cocktail A ；Sigma-Aldrich, Louis, MO 63103, USA ；Ca2+ 貨號 Calcium ionophore I-cocktail A ；Sigma-Aldrich, Louis, MO 63103，USA ；(2)測試緩沖液離子流測試時，測試不同的離子需要不同的測試液，如下K+離子0. ImM KCl,0. ImM CaCl2、0. ImM MgCl2、0. 5mM NaCl、0. 2mM Na2S04、0. 3mM MESNH4+離子lmM KC1、0. ImM CaCl2,0. ImM NH4ClCa2+離子0. ImM KC1、0. ImM CaCl2,0. ImM MgCl2、0. 5mMNaCl、0. 2mM Na2SO4^O. 3mM MES(3)電極灌充液K+: IOOmM KClNH4+: IOOmM NH4ClCa2+: IOOmM CaCl2(4)校正液K+ 離子0. ImM 和 ImM KCl
NH4+ 離子0. ImM 和 ImM NH4ClCa2+ 離子0. ImM 和 ImM CaCl24.實驗內容及方法實驗過程如圖1所示。從電極末端灌入Icm左右的相應測試離子的灌充液至電極尖端充滿，前端吸入適當長度(K+ 100 200 μ m、NH4+ :20 50 μ m、Ca2+ :15 30 μ m)的離子交換劑(LIX)。將電極套入已氯化的Ag/AgCl電極線基座。參比電極為固體低滲漏性電極(WPI)。電極在相應的校正液中校正，其Nerst方程計算理想值分別是K+、NH4+ :56_60mV，Ca2+ :25_30mV。材料在測試前置于相應的測試液中平衡30min左右。然后在距離水稻根尖分生區 (距離根尖300 μ m左右)表面30 μ m的地方振動檢測(圖8)，每個樣品檢測10min-15min。5.數據處理離子流處理基于Fick擴散定律，并通過在線軟件MageFlux_3DIon Flux Plotting System(http://www. xuyue. net/magef lux/)計算得出。由3次以上獨立實驗數據做統計分析，利用Exce 12003分析作圖。6.實驗結果實驗結果如圖2-圖7所示由圖2和圖3可以看出正常水稻苗的K+離子處于內流狀態，平均流速為-50. 32pmol. cm_2. s—1 ；發生真菌性立枯病的水稻苗K+處于明顯的外流狀態，平均流速為 12. 15pmol. cm 2· s 1O由圖4和圖5可以看出正常水稻苗的NH4+處于內流狀態，平均流速為-118. 6pmol. cm—2, s—1 ；發生真菌性立枯病的水稻苗的NH4+處于外流狀態，平均流速為 85. 07pmol. cm 2· s 1O由圖6和圖7可以看出正常的水稻苗的Ca2+處于內流狀態，平均流速為-105. 68pmol. cm—2· s-1，發生真菌性立枯病的水稻苗Ca2+處于外流狀態，平均流速為 56. 33pmol. cm 2· s 1O上述結果表明，水稻在發生真菌性立枯病的時候K+、NH4+和Ca2+三種無機離子由正常的內流轉為外流，導致無機營養流失，造成生理機能的改變。通過三種無機離子的離子流向和流速可以判斷水稻是否感染了真菌性立枯病以及感染程度。雖然，上文中已經用一般性說明及具體實施方案對本發明作了詳盡的描述，但在本發明基礎上，可以對之作一些修改或改進，這對本領域技術人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發明精神的基礎上所做的這些修改或改進，均屬于本發明要求保護的范圍。
權利要求
1.一種基于微觀動態離子流檢測技術檢測水稻真菌性立枯病的方法，其特征在于，利用微觀動態離子流檢測技術分別檢測水稻根系K+、NH4+和Ca2+的吸收能力，檢測出感染真菌性立枯病的水稻，所述離子流流向處于外流或者是內流幅度較對照變小即為感染真菌性立枯病。
2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，檢測使用的水稻處于幼苗期。
3.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，微觀動態離子流檢測技術中測試緩沖液中的測試離子濃度為0. 05 0. 15mM。
4.根據權利要求2所述的方法，其特征在于，檢測使用的水稻處于2葉1心期，測量位置為距所述水稻苗根尖300 500 μ m的根尖分生區的外表面20 50 μ m處。
5.根據權利要求1 4任一項所述的方法，其特征在于，包括以下步驟(1)向微電極中灌入離子灌充液至充滿所述電極尖端1cm，再將電極前端吸入相應的測試離子交換劑；(2)將經過步驟(1)處理后的電極套入已氯化的Ag/AgCl電極線基座，并放入校正液中校正；(3)取待測水稻苗，將其根部先放在測試緩沖液中平衡30min，再用校正后的電極對待測水稻苗進行檢測10 15min ；(4)對檢測結果進行處理和分析；其中，步驟(1)所述離子灌充液為80 140mM KC1、80 HOmMNH4Cl和80 140mM CaCl2 ；步驟(1)電極的前端吸入的測試離子交換劑的長度為K+100 200μπι ;ΝΗ4+20 50 μ m 禾口 Ca2+15 30 μ m ；步驟(2)所述的校正液為K+0. 05 0. 15mM KCl 和 0. 5 1. 5mMKCl ；NH4+ :0. 05 0. 15mM NH4Cl 和 0. 5 1. 5mM NH4Cl ；Ca2+ :0. 05 0. 15mM CaCl2 和 0. 5 1. 5mM CaCl2 ；步驟(3)所述的測試緩沖液為=K+或Ca2+ 0. 05 0. 15mM KCl、0· 05 0. 15mM CaCl2, 0. 05 0. 15mM MgCl2、0. 3 0. 6mM NaCl、0· 1 0· 3mM Na2SO4 和 0· 2 0. 5mM MES ；NH4+ 0. 8 1. 2mM KCl、0· 05 0. 15mM CaCl2 和 0. 05 0. 15mM NH4C1。
6.根據權利要求5所述的方法，其特征在于，校正后電極的能斯特方程計算理想值為 K+ 56 60mV ；NH4+ 56 60mV ；Ca2+ 25 29mV。
7.根據權利要求5所述的方法，其特征在于，所述K+離子流的流速為10 500pmol.cnT2. s"1, NH4+離子流的流速為10 500pmol. cnT2. s"1, Ca2+離子流的流速為10 500pmol.-2 -1 cm . s ο
全文摘要
本發明提供了一種基于微觀動態離子流檢測技術的水稻真菌性立枯病的檢測方法，其是利用微觀動態離子流檢測技術分別檢測水稻根系K+、NH4+和Ca2+的吸收能力，檢測出感染真菌性立枯病的水稻。本發明利用微觀動態離子流檢測技術可測得真菌性立枯病發病時的離子流信息，通過與正常生長的水稻比較，獲得真菌性立枯病發病時的離子流吸收或釋放規律，利用此規律評價真菌性立枯病的發生，從而實現對水稻真菌性立枯病的快速、無損檢測，檢測后的植株材料還能夠正常生長，避免了珍貴水稻苗的損失，檢測結果對比明顯，方法可靠，為水稻育苗和水稻育種提供了一種快速、無損的檢測水稻真菌性立枯病的新方法。
文檔編號A01G7/06GK102520046SQ201110364009
公開日2012年6月27日 申請日期2011年11月16日 優先權日2011年11月16日
發明者侯佩臣, 潘大宇, 王成, 王曉冬, 王紀華, 羅斌 申請人:北京農業智能裝備技術研究中心