專利名稱：一種寬葉香蒲根尖誘導愈傷組織并分化成苗的方法
技術領域：
本發明涉及一種高效的寬葉香蒲根尖誘導愈傷組織并分化成苗的方法。
背景技術：
寬葉香蒲是一種天然存在于池塘，湖泊和沼澤的大型植物。它廣泛分布于熱帶和亞熱帶地區。它具有發達的根系和高效的光合作用系統，一次能夠高效利用非結構態碳水化合物。因此，香蒲廣泛用于自然或人工濕地污水處理系統中，用于處理城市生活污水、工業廢水、農田污水、開礦污水等。更重要的是寬葉香蒲對重金屬如鎘，砷，鋅以及鉛等有較高的耐受性。這些重金屬能夠在寬葉香蒲的根部進行富集，卻不會造成明顯的傷害。有研究者通過快速培養寬葉香蒲的根去除重金屬的污染。由于重金屬蓄積在根部而難以從根部轉移到香蒲莖、葉。所以，培養根這個過程顯然是高能耗、高成本的過程，要利用寬葉香蒲來治理重金屬污染，只能通過轉基因的方式才能夠解決。所以構建高效的寬葉香蒲轉化體系十分重要。Rogers 等(Rogers et al.，1998)開發了一種寬葉香蒲愈傷組織分化成苗的方法。其用于誘導愈傷組織的外植體材料是成熟種子生成的幼苗。原因在于寬葉香蒲的種子過小，難以去殼和分離出胚。不能像其他單子葉植物一樣從胚進行誘導愈傷組織(Valk et al. ,1992； Schaik et al. ,1996 ；Rogers et al. , 1998 ；Thomas and Yoichiro,2011 ；Perez~N/ unez et al.，2009)。所以，根和芽是較好用于誘導愈傷組織的外植體材料。然而對于通常的單子葉植物來說，從根尖誘導愈傷組織比從芽誘導要難(Kerbauy，1984)。近年有報道從 Orchidaceae (Park et al. ,2003)和 Doritaenopsis(Flachsland et al. ,2011 ；Kerbauy, 1984)的根尖成功誘導出愈傷組織。寬葉香蒲的根部十分發達，當種子在培養基中萌發10 天后，根的數量遠多于苗的數量。這為從根尖誘導愈傷組織提供了便利。
發明內容
本發明所要解決的技術問題是提供一種寬葉香蒲根尖誘導愈傷組織并分化成苗的方法，以提供更為高效的愈傷組織誘導、分化系統。即從根尖誘導愈傷組織的形成，并通過添加植物激素，提高愈傷組織形成效率，生長速度以及出苗效率和加快苗的生長速度。為解決上述技術問題，本發明采用的技術方案如下一種寬葉香蒲根尖誘導愈傷組織并分化成苗的方法，該方法包括如下步驟(I)將寬葉香蒲的種子干燥、消毒、發芽生根；(2)對步驟(I)生根后的根尖誘導愈傷組織并分化成苗(2a)從步驟⑴中生根后的苗根上獲取2_3mm的根尖，轉接到愈傷組織誘導培養基上無光條件下培養9周；所述的愈傷組織誘導培養基是外加2g L-1植物凝膠、30g L-1 蔗糖和2. 5 20 ii M毒莠定的MS培養基；(2b)將步驟(2a)得到的愈傷組織轉接到愈傷組織分化培養基上，在25°C、連續光照、光照強度是30 u mol .m-2 -S-1的條件下分化培養4周；所述的愈傷組織分化培養基為添加了 2. 5 5mg L-1 細胞分裂素(BA)、0 2. 5mg L-1 激動素(kinetin)、0 0. 05mg L-1 萘乙酸(NAA)和0 0. 05mg L—1吲哚乙酸(IAA)的MS培養基；所述的愈傷組織分化培養基優選表I中的三種配方之一；表I愈傷組織分化培養基為MS培養基基礎上添加的植物激素(mg L—1)
權利要求
1.一種寬葉香蒲根尖誘導愈傷組織并分化成苗的方法，其特征在于，該方法包括如下步驟(1)將寬葉香蒲的種子干燥、消毒、發芽生根；(2)對步驟(I)生根后的根尖誘導愈傷組織并分化成苗(2a)從步驟(I)中生根后的苗根上獲取2-3mm的根尖，轉接到愈傷組織誘導培養基上無光條件下培養9周；所述的愈傷組織誘導培養基是外加2g · L-1植物凝膠、30g · L-1蔗糖和2. 5 20 μ M毒莠定的MS培養基；(2b)將步驟(2a)得到的愈傷組織轉接到愈傷組織分化培養基上，在25°C、連續光照、 光照強度是30 μ mol · πΓ2 · s—1的條件下分化培養4周；所述的愈傷組織分化培養基為添加了 2. 5 5mg · L—1細胞分裂素、O 2. 5mg · L—1激動素、O O. 05mg · L—1萘乙酸和O O.05mg · L-1吲哚乙酸的MS培養基；(2c)將步驟(2b)分化培養后得到的苗轉接到生根培養基上培養4周；所述的生根培養基為添加了 2mg · L-1IBAdg · L—1植物凝膠和30g · L—1蔗糖的1/4MS基本培養基；(2d)將步驟(2c)生根培養后的苗轉移到含有花肥的小花盆中，將苗置于25°C的溫室中生長，在第一周的時候苗的上方要覆蓋一層塑料薄膜，防止水分的蒸發，溫室中的光照強度約為230 μ mol ·πΓ2 Μ—1』天澆水一次，培養40天后轉移到更大的花盆中，花盆中含有花肥并保持3 5cm深度的水。
2.根據權利要求I所述的寬葉香蒲根尖誘導愈傷組織并分化成苗的方法，其特征在于，步驟(I)中所述的干燥條件為42°C下干燥24小時。
3.根據權利要求I所述的寬葉香蒲根尖誘導愈傷組織并分化成苗的方法，其特征在于，步驟(I)中所述的消毒，包括如下步驟(Ia)將種子用滅過菌的蒸餾水浸泡兩次，每次浸泡5min，倒干水；(Ib)步驟(Ia)處理后的種子用75% (v/v)的乙醇溶液浸泡90秒，傾去乙醇溶液；(Ic)步驟(Ib)處理后的種子加入2. 5% (w/w)的次氯酸鈉溶液中消毒15分鐘，在消毒時不斷搖晃，重復一次，傾去次氯酸鈉溶液；(Id)步驟(Ic)處理后的種子用無菌水浸泡3次，每次浸泡5分鐘，倒掉無菌水。
4.根據權利要求I所述的寬葉香蒲根尖誘導愈傷組織并分化成苗的方法，其特征在于，步驟(I)中所述的發芽生根，將種子轉移到添加了 30g L-1的蔗糖、pH5.8的液體MS培養液中，置于25°C連續光照下2天發芽，然后將發芽的種子轉接到生根培養基中生根培養 5 7天。
5.根據權利要求4所述的寬葉香蒲根尖誘導愈傷組織并分化成苗的方法，其特征在于，所述的生根培養基為添加了 2mg · L-1IBAdg · L—1植物凝膠和30g · L—1蔗糖的1/4MS基本培養基。
6.根據權利要求4所述的寬葉香蒲根尖誘導愈傷組織并分化成苗的方法，其特征在于，生根后的苗的繼代培養條件為將生根后的苗轉接到固體MS培養基，培養3-5周。
全文摘要
本發明公開了一種寬葉香蒲根尖誘導愈傷組織并分化成苗的方法，將寬葉香蒲的種子干燥、消毒、發芽生根；對生根后的根尖誘導愈傷組織并分化成苗，具體方法為從生根后的苗根上獲取2-3mm的根尖，轉接到愈傷組織誘導培養基上無光條件下培養9周；將愈傷組織轉接到愈傷組織分化培養基上，在25℃、連續光照的條件下分化培養4周；將分化培養后得到的苗轉接到生根培養基上培養4周；將生根培養后的苗轉移到含有花肥的小花盆中，將苗置于25℃的溫室中生長，在第一周的時候苗的上方要覆蓋一層塑料薄膜，防止水分的蒸發，3天澆水一次，培養40天后轉移到更大的花盆中并保持3～5cm的水。
文檔編號A01H4/00GK102577954SQ20121003364
公開日2012年7月18日 申請日期2012年2月15日 優先權日2012年2月15日
發明者劉露, 呂志剛, 張全興, 杜宏偉, 楊柳燕, 武俊, 肖 琳, 許超 申請人:南京大學