專利名稱：一種通過組織培養獲得大量小佛肚竹再生植株的方法
技術領域：
本發明屬于生物技術領域，具體涉及一種獲得大量小佛肚竹再生苗的方法。
背景技術：
小佛肚竹屬簕竹屬，又名葫蘆竹、佛竹、密節竹，是以特形桿作為觀賞性狀的重要觀賞竹之一。小佛肚竹一般具2種桿形正常桿形的小佛肚竹桿下部略呈之字形曲折；畸形桿形的小佛肚竹節間短縮且腫脹呈花瓶狀。后一桿形常用于制作盆景及庭院栽培作觀賞用，其竹高25-60cm，直徑O. 5-2cm，節間較短，一般只有2-5cm，或短縮腫脹呈花瓶狀，為著名的觀賞竹種，具有廣闊的市場前景(陳雙林，楊希.觀賞竹種佛肚竹栽培及形態控制 [J].福建林業科技，2001，28(1) :79 80)。然而，竹類植物開花間隔期長，開花期無法預測，且種子獲取十分困難，萌發率也低。因此，竹子繁殖主要以埋鞭、埋桿、埋節等傳統方法為主，這些方法具有消耗種竹多、種苗運輸不便、勞動強度大、繁殖系數低等缺點，小佛肚竹也是如此。而且，小佛肚竹畸形桿的變異不穩定，利用生物技術可以高效、快速地對作物品種性狀進行遺傳改良，從而為小佛肚竹再生植株的培養提供一種方便、快捷和有效的方法。竹子組織培養方面的研究，最早見于1968年，Alexander和Rao關于竹子合子胚離體培養的簡報。國外比較系統開展竹子組織培養工作始于20世紀80年代。我國的竹子組織培養工作開展得較晚，20世紀90年代才開始，闕國寧等以黃竹和印度箣竹2種叢生竹的嫩節作為外植體誘導愈傷組織，最終形成完整植株。現階段，國內通過以芽繁芽途徑來實現竹子植株的再生，其技術已趨于成熟，但通過愈傷組織途徑來實現植株的再生，報道并不多。本發明針對背景技術的不足和缺陷，克服小佛肚竹組織培養過程中再生難的問題，通過不同生長調節劑的組合，設計出適合小佛肚竹再生的培養基，完成小佛肚竹植株再生的時間最快僅為15周左右。為小佛肚竹的快速繁殖和定向生物技術育種奠定了堅實的基礎。具有一定的社會效益和經濟效益，可以促進我國竹產業的發展。
發明內容
本發明的目的在于提供一種快速、大量獲得小佛肚竹再生植株的方法。本發明提出的獲得小佛肚竹再生植株的方法，采用愈傷組織培養技術，包括小佛肚胚性愈傷組織的誘導、分化及植株再生等。具體步驟為
(O小佛肚竹胚性愈傷組織的誘導
將無菌的再生芽的芽尖接種到愈傷誘導培養基進行愈傷誘導，愈傷組織形成四周后將其轉接到繼代培養基進行增殖培養，得到胚性愈傷組織；其中，所述愈傷誘導培養基為以 MS為基本培養基，再附加6mg/L2，4-D,O. 001mg/LTDZ、0. 5mg/L萘乙酸(NAA)組成，所述繼代培養基為MS, 5mg/L2, 4-D, O. 5mg/L6-BA, lmg/L 蔡乙酸，lOOmg/L Vc。( 2)胚性愈傷組織的分化將胚性愈傷組織轉接到愈傷組織分化培養基上培養，至有再生芽分化形成，一般約一個月左右時間；其中，所述愈傷組織分化培養基為MS，3mg/L6-BA，0. 5mg/LNAA。(3)小佛肚竹的植株再生
將已經分化出再生芽的愈傷組織轉接到生根培養基中，進行生根培養，其中，所述生根培養基含 MS，3mg/l NAA, (O. 1-0. 5) mg/1 6-BA。待根生長至5cm時，可進行再生苗的移栽。再生苗移栽花盆中后置于植物生長室中(濕度在60%-80%，溫度(25±1°0，光周期為光照14h/黑暗10h)。上述培養基組分中，MS為MS培養基成分(Murashige & Skoog medium, 1962, Physiol. Plant 15:473-497 )，2，4-D 為 2，4-二氯苯氧乙酸，TDZ 為噻二唑苯基脲，6-BA 為6-芐氨基腺嘌呤，Vc為維生素C。本發明方法獲得小佛肚竹的頻率高，適宜于小佛肚竹遺傳改良。
圖I小佛肚竹的枝芽外植體。
圖2小佛肚竹枝芽誘導出的愈傷組織。
圖3小佛肚竹愈傷組織在增殖培養基上生長一段時間后的愈傷組織。
圖4小佛肚竹愈傷組織在分化培養基上分化一個月后長出芽體。
圖5小佛肚竹愈傷組織在分化培養基上分化三個月后長出的芽叢。
圖6小佛肚竹再生苗的生根。
圖7移栽成功的小佛肚竹再生植株。
具體實施例方式小佛肚竹組織培養的方法獲得大量再生植株的方法的操作步驟如下
(1)外植體的選擇本發明的實驗中選取材料為小佛肚竹vantricosa)的無菌苗的再生芽。(圖I)
(2)胚性愈傷組織的誘導與保持選取無菌苗上剛萌發的再生芽，切取離芽尖約I.5cm 的莖段(圖 2)。接到愈傷誘導培養基(MS+TDZ0. 00lmg/L+ 2，4_D6mg/L+ NAAO. 5mg/L)，四周后愈傷組織形成，將形成的愈傷組織轉接到愈傷增殖培養基(MS+5mg/L2，4-D+O. 5mg/ L6-BA+lmg/L萘乙酸+100mg/LVc)進行增殖培養。(圖3)
(3)胚性愈傷組織的分化胚性愈傷組織培養30天后，將愈傷組織轉接到分化培養基 (MS+3mg/L6-BA+0. 5mg/LNAA)上，使愈傷組織分化成芽。(圖4、圖5)
(4)再生芽的生根與移栽將分化后的芽轉接至生根培養基中(MS+3mg/l NAA+(0. 1-0. 5)mg/1 6_BA)，2周后，就有不定根產生，待根生長至5cm時，可進行再生苗的移栽。再生苗移栽花盆中后置于植物生長室中(濕度在60%-80%，溫度(25±1°0，光周期為光照14h/黑暗IOh)(圖6、圖7)。本實驗中所有培養基都在滅菌前將pH調到5. 8，滅菌條件為121°C下18min。培養室溫度為(25±1°C)。光周期為14h/黑暗10h。培養物表面的光照強度約為30001x。
權利要求
1.一種通過組織培養獲得大量小佛肚竹再生植株的方法，其特征在于具體步驟為(1)小佛肚竹胚性愈傷組織的誘導將無菌的再生芽的芽尖接種到愈傷誘導培養基進行愈傷誘導，愈傷組織形成四周后將其轉接到繼代培養基進行增殖培養，得到胚性愈傷組織；(2)胚性愈傷組織的分化將胚性愈傷組織轉接到愈傷組織分化培養基上培養，至有再生芽分化形成；(3)小佛肚竹的植株再生將已經分化出再生芽的愈傷組織轉接到生根培養基中，進行生根培養。
2.根據權利要求I所述通過組織培養獲得大量小佛肚竹再生植株的方法，其特征在于步驟(I)中所述愈傷誘導培養基組成為以MS為基本培養基，再附加6mg/L2，4_D、0. OOlmg/ LTDZ、0. 5mg/L萘乙酸，所述繼代培養基組成為MS，5mg/L2，4_D，0. 5mg/L6_BA，lmg/L萘乙酸，100mg/L Vc ο
3.根據權利要求I所述通過組織培養獲得大量小佛肚竹再生植株的方法，其特征在于步驟(2)中所述愈傷組織分化培養基組成為MS，3mg/L6-BA，0. 5mg/L萘乙酸。
4.根據權利要求I所述通過組織培養獲得大量小佛肚竹再生植株的方法，其特征在于步驟(3)中所述生根培養基組成為MS，3mg/L萘乙酸，(O. 1-0. 5)mg/ L 6-BA。
全文摘要
本發明屬于生物技術領域，具體為一種通過組織培養獲得大量小佛肚竹再生植株的方法。該方法包括采用小佛肚竹幼嫩枝芽芽尖為外植體，經消毒處理后在經改良的誘導培養基上形成愈傷組織，進而誘導胚性愈傷組織的發生，然后，將胚性愈傷組織接種到改良的分化培養基上，誘導胚性愈傷組織分化出芽，再在生根培養基上分化出根，形成完整植株，最后移栽到花盆，完成小佛肚竹再生全程。本發明方法獲得小佛肚竹的頻率高，適宜于小佛肚竹遺傳改良。
文檔編號A01H4/00GK102577958SQ20121004377
公開日2012年7月18日 申請日期2012年2月26日 優先權日2012年2月26日
發明者丁雨龍, 林樹燕, 錢維杰, 魏強 申請人:南京林業大學