專利名稱：一種鳥槍打靶式珊瑚人工感染法的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種鳥槍打靶式珊瑚人工感染法。
背景技術：
扁枝濱珊瑚(/Writes andrewsi Vaughan)等枝狀珊瑚為熱帶海域造礁石珊瑚的主要優勢種，這些珊瑚常存在白化等多種疾病。近年來，頻繁發生的珊瑚疾病導致了珊瑚礁生態系統嚴重退化，影響了全球珊瑚礁生態系統的平衡，受到了人們的高度重視，國際上諸多重要學者建議盡快建立能有效確定珊瑚病原的方法。不過，由于珊瑚是一類生活在海洋環境中的開放式低等真核動物，由水螅體與單細胞蟲黃藻共生，除了光合作用外，水螅體 和蟲黃藻都與外界水體進行較直接的物質交換，致使水體中的病原細菌等存在侵染水螅體或蟲黃藻的可能。又由于水螅體和蟲黃藻都是相對較小的個體，無法實現從其體內直接分離病原，因此，無論是以健康珊瑚組織還是發病珊瑚組織為樣品，都是同時分離獲得多種不同菌落形態的細菌，難以通過基于庫克氏原則的人工感染方法來確定珊瑚疾病的細菌性病原。為此，本發明建立一種相對快速地確定珊瑚病原的鳥槍打靶式人工感染方法，與傳統單一菌株人工感染方法相比，該方法具有操作簡單、快速準確等優點，可作為國內外珊瑚疾病細菌病原篩選的首選方法。
發明內容
本發明的目的是提供一種鳥槍打靶式珊瑚人工感染法。本發明是為了尋找一種簡單、方便、有效的方法來快速準確地確定枝狀珊瑚的細菌病原。首先，將從患病珊瑚分離獲得的菌株隨機分成若干個試驗組，利用這些混合菌液平行組同時對健康珊瑚進行“二步法”海區人工感染；然后，再將誘發健康珊瑚患病的試驗組菌株分別對健康珊瑚進行“一步法”室內人工感染；最終，確定誘發健康珊瑚患病的細菌病原，從而實現快速、準確的珊瑚細菌病原分離和鑒定過程。本發明所采用的技術方案是
運用鳥槍打靶法確定枝狀珊瑚細菌病原所要使用的材料，包括
(I)實驗對象枝狀樣品珊瑚。(2)實驗材料1m長直徑為I. Ocm的304不銹鋼鋼釬、直徑0. 3cm的聚酯綁繩、塑料綁帶、研缽、24X20X36cm的無色塑料桶、超凈工作臺、移液器、tip頭、I. 5ml Eppendorf管、2ml凍存管、2216E海水液體培養基、TCBS固體培養基。使用上述鳥槍打靶法確定枝狀珊瑚細菌病原包括下列步驟
I、樣品采集、處理及病原分離、純化和擴大培養
在超凈工作臺中采集發病部位珊瑚組織0. 5^1. 0g，用研缽將其磨成粉末狀，將粉末轉入帶有Iml滅菌海水的離心管中，用移液器吹打5min，室溫靜置5 min，吸取100 上清液涂布于固體2216E海水培養基或TCBS培養基平板。室溫培養24 48h，依據菌落形態的不同，挑取平板上多個不同形態的單菌落，分別接種于含Iml的液體2216E海水培養基的凍存管中擴大培養，使菌液濃度達109CFU/ml。2、菌液分組混合及珊瑚人工感染
(I)隨機將所有菌株的菌液分成多組，并按組混合后用于人工感染。 (2)在24X 20X 36cm的無色中裝8 IOL過濾和消毒過的海水，同時放入3 5枝細菌來源相同的健康珊瑚，暫養3飛d，健康生長的珊瑚用于后續試驗。將每組混合菌液分別加入含有健康珊瑚的塑料桶中，每桶對應I組混合菌液，形成若干人工感染試驗組；在上述含有健康珊瑚的塑料桶中，加入與菌液等體積的2216E液體培養基，形成對照組；浸泡感染12h。(3)珊瑚固定裝置的構建與海區試驗選取與樣品珊瑚生長生境相似的平坦海區，垂直于海流方向固定鋼釬，間距為8 12m ;以保持珊瑚健康生長環境為原則，在兩根鋼釬間平行拉上兩條聚酯綁繩，確保綁繩的合適離地距離、合適間距，構成珊瑚固定裝置。將試驗組和對照組珊瑚轉移到試驗海區，用塑料綁帶將所有珊瑚按組別固定于聚酯綁繩上。3、海區感染珊瑚的觀察
在珊瑚轉入海區后，每f 2天觀察并記錄試驗結果，觀察周期為15 20天；當對照組珊瑚正常生長而某一試驗組珊瑚出現與細菌分離樣品珊瑚相同病癥時，確定引發該流行病的病原菌存在于該試驗組菌株中。4、珊瑚的室內人工感染
將海區試驗確定的含有病原菌的試驗組中所有菌株分別培養成濃度為109CFU/ml的菌液，取Iml分別加入裝有8 10L海水和3枝健康珊瑚的無色塑料桶中進行浸泡感染；在另一個裝有8 10L海水和3枝健康珊瑚的無色塑料桶中，加入Iml 2216E液體培養基，形成對照組；整個試驗過程中只補充因蒸發損失的水份。觀察并記錄試驗組和對照組的珊瑚的生長狀況，觀察周期15 20d。依據“對照組正常生長而試驗組能產生與菌株分離樣品相同的病癥”的原則，最終確定引發該流行病的病原菌菌株。本發明的優點
I、針對珊瑚細菌疾病，本發明首次利用鳥槍打靶式人工感染法實現了病原菌的快速分離與確定。2、降低了珊瑚細菌性疾病的流行病學調查工作強度。由于珊瑚無法實現從體內直接分離細菌病原，樣品中除了病原菌外，還存在大量環境菌株。傳統流行病學調查方法是將樣品中分離的每株細菌分別進行人工感染試驗，費時、費力。而本發明則是以一定基數為單位，將從樣本中分離的菌株隨機分成若干個組按“二步法”先進行第一次感染，確定某組含有病原菌后，再用“一步法”確定病原菌株，與傳統方法相比，大大降低了珊瑚細菌性疾病流行病學調查的工作強度。
具體實施例方式實施例I :
一種鳥槍打靶式珊瑚人工感染法，其特征在于確定枝狀珊瑚細菌病原包括下列步驟
A.樣品采集、處理及病原分離、純化和擴大培養
在超凈工作臺中采集發病部位珊瑚組織O. 5g，用研缽將其磨成粉末狀，將粉末轉入帶有Iml滅菌海水的離心管中，用移液器吹打5min，室溫靜置5分鐘，吸取100 μ I上清液涂布于固體2216Ε海水培養基或TCBS培養基平板；室溫培養24h，依據菌落形態的不同，挑取平板上多個不同形態的單菌落，分別接種于含Iml的液體2216E海水培養基的凍存管中擴大培養，使菌液濃度達109CFU/ml ；
B.菌液分組混合及珊瑚人工感染
(O隨機將所有菌株的菌液分成多組，并按組混合后用于人工感染；
(2)在24X 20 X 36cm的無色中裝8L過濾和消毒的海水，同時放入3枝與細菌來源相同的枝狀健康珊瑚，暫養3d，健康生長的珊瑚用于后續試驗；將每組混合菌液分別加入含有健康珊瑚的塑料桶中，每桶對應I組混合菌液，形成若干試驗組；在另一個含有健康珊瑚的塑料桶中，加入與菌液等體積的2216E液體培養基，形成對照組；浸泡感染12h ；
(3)珊瑚固定裝置的構建與海區試驗選取與樣品珊瑚生長生境相似的平坦海區，垂直于海流方向固定鋼釬，間距為8m ;以保持珊瑚健康生長環境為原則，在兩根鋼釬間平行拉上兩條聚酯綁繩，確保綁繩的合適離地距離、合適間距，構成珊瑚固定裝置；將試驗組和對照組珊瑚轉移到試驗海區，用塑料綁帶將所有珊瑚按組別固定于聚酯綁繩上；
C.海區感染珊瑚的觀察
在珊瑚轉入海區后，每I天觀察并記錄試驗結果，觀察周期為15天；當對照組珊瑚正常生長而某一試驗組珊瑚出現與細菌分離樣品珊瑚相同病癥時，確定引發該流行病的病原菌存在于該試驗組菌株中；
D.珊瑚的室內人工感染
將海區試驗確定的含有病原菌的試驗組中所有菌株分別培養成濃度為109CFU/ml的菌液，取Iml分別加入裝有8L海水和3枝健康珊瑚的無色塑料桶中進行浸泡感染；在另一個裝有8L海水和3枝健康珊瑚的無色塑料桶中，加入Iml 2216E液體培養基，形成對照組；整個試驗過程中只補充因蒸發損失的水份；觀察并記錄試驗組和對照組的珊瑚的生長狀況，觀察周期15d ;依據“對照組正常生長而試驗組產生與菌株分離樣品相同病癥”的原則，最終確定引發該流行病的病原菌菌株。 實施例2:
一種鳥槍打靶式珊瑚人工感染法，其特征在于
確定枝狀珊瑚細菌病原包括下列步驟
A.樣品采集、處理及病原分離、純化和擴大培養
在超凈工作臺中采集發病部位珊瑚組織O. 7g，用研缽將其磨成粉末狀，將粉末轉入帶有Iml滅菌海水的離心管中，用移液器吹打5min，室溫靜置5分鐘，吸取100 μ I上清液涂布于固體2216Ε海水培養基或TCBS培養基平板；室溫培養35h，依據菌落形態的不同，挑取平板上多個不同形態的單菌落，分別接種于含Iml的液體2216E海水培養基的凍存管中擴大培養，使菌液濃度達109CFU/m l ；
B.菌液分組混合及珊瑚人工感染
(O隨機將所有菌株的菌液分成多組，并按組混合后用于人工感染；(2 )在24 X 20 X 36cm的無色中裝9L過濾和消毒的海水，同時放入4枝與細菌來源相同的枝狀健康珊瑚，暫養4d，健康生長的珊瑚用于后續試驗；將每組混合菌液分別加入含有健康珊瑚的塑料桶中，每桶對應I組混合菌液，形成若干試驗組；在另一個含有健康珊瑚的塑料桶中，加入與菌液等體積的2216E液體培養基，形成對照組；浸泡感染12h ；
(3)珊瑚固定裝置的構建與海區試 驗選取與樣品珊瑚生長生境相似的平坦海區，垂直于海流方向固定鋼釬，間距為IOm ;以保持珊瑚健康生長環境為原則，在兩根鋼釬間平行拉上兩條聚酯綁繩，確保綁繩的合適離地距離、合適間距，構成珊瑚固定裝置；將試驗組和對照組珊瑚轉移到試驗海區，用塑料綁帶將所有珊瑚按組別固定于聚酯綁繩上；
C.海區感染珊瑚的觀察
在珊瑚轉入海區后，每I. 5天觀察并記錄試驗結果，觀察周期為18天；當對照組珊瑚正常生長而某一試驗組珊瑚出現與細菌分離樣品珊瑚相同病癥時，確定引發該流行病的病原菌存在于該試驗組菌株中；
D.珊瑚的室內人工感染
將海區試驗確定的含有病原菌的試驗組中所有菌株分別培養成濃度為109CFU/ml的菌液，取Iml分別加入裝有9L海水和3枝健康珊瑚的無色塑料桶中進行浸泡感染；在另一個裝有9L海水和3枝健康珊瑚的無色塑料桶中，加入Iml 2216E液體培養基，形成對照組；整個試驗過程中只補充因蒸發損失的水份；觀察并記錄試驗組和對照組的珊瑚的生長狀況，觀察周期18d ;依據“對照組正常生長而試驗組產生與菌株分離樣品相同病癥”的原則，最終確定引發該流行病的病原菌菌株。 實施例3:
一種鳥槍打靶式珊瑚人工感染法，其特征在于
確定枝狀珊瑚細菌病原包括下列步驟
A.樣品采集、處理及病原分離、純化和擴大培養
在超凈工作臺中采集發病部位珊瑚組織I. 0g，用研缽將其磨成粉末狀，將粉末轉入帶有Iml滅菌海水的離心管中，用移液器吹打5min，室溫靜置5分鐘，吸取100 μ I上清液涂布于固體2216Ε海水培養基或TCBS培養基平板；室溫培養48h，依據菌落形態的不同，挑取平板上多個不同形態的單菌落，分別接種于含Iml的液體2216E海水培養基的凍存管中擴大培養，使菌液濃度達109CFU/ml ；
B.菌液分組混合及珊瑚人工感染
(O隨機將所有菌株的菌液分成多組，并按組混合后用于人工感染；
(2)在24X20X36cm的無色中裝IOL過濾和消毒的海水，同時放入5枝與細菌來源相同的枝狀健康珊瑚，暫養5d，健康生長的珊瑚用于后續試驗；將每組混合菌液分別加入含有健康珊瑚的塑料桶中，每桶對應I組混合菌液，形成若干試驗組；在另一個含有健康珊瑚的塑料桶中，加入與菌液等體積的2216E液體培養基，形成對照組；浸泡感染12h ；
(3)珊瑚固定裝置的構建與海區試驗選取與樣品珊瑚生長生境相似的平坦海區，垂直于海流方向固定鋼釬，間距為8 12m ;以保持珊瑚健康生長環境為原則，在兩根鋼釬間平行拉上兩條聚酯綁繩，確保綁繩的合適離地距離、合適間距，構成珊瑚固定裝置；將試驗組和對照組珊瑚轉移到試驗海區，用塑料綁帶將所有珊瑚按組別固定于聚酯綁繩上；
C.海區感染珊瑚的觀察在珊瑚轉入海區后，每2天觀察并記錄試驗結果，觀察周期為20天；當對照組珊瑚正常生長而某一試驗組珊瑚出現與細菌分離樣品珊瑚相同病癥時，確定引發該流行病的病原菌存在于該試驗組菌株中；
D.珊瑚的室內人工感染
將海區試驗確定的含有病原菌的試驗組中所有菌株分別培養成濃度為109CFU/ml的菌液，取Iml分別加入裝有IOL海水和3枝健康珊瑚的無色塑料桶中進行浸泡感染；在另一個裝有IOL海水和3枝健康珊瑚的無色塑料桶中，加入Iml 2216E液體培養基，形成對照組；整個試驗過程中只補充因蒸發損失的水份；觀察并記錄試驗組和對照組的珊瑚的生長 狀況，觀察周期15 20d ;依據“對照組正常生長而試驗組產生與菌株分離樣品相同病癥”的原則，最終確定引發該流行病的病原菌菌株。
權利要求
1.一種鳥槍打靶式珊瑚人工感染法，其特征在于 確定枝狀珊瑚細菌病原包括下列步驟 A.樣品采集、處理及病原分離、純化和擴大培養 在超凈工作臺中采集發病部位珊瑚組織O. 5^1. Og，用研缽將其磨成粉末狀，將粉末轉入帶有Iml滅菌海水的離心管中，用移液器吹打5min，室溫靜置5分鐘，吸取100 μ I上清液涂布于固體2216Ε海水培養基或TCBS培養基平板；室溫培養24 48h，依據菌落形態的不同，挑取平板上若干個不同形態的單菌落，分別接種于含Iml的液體2216E海水培養基的凍存管中擴大培養，使菌液濃度達109CFU/ml ； B.菌液分組混合及珊瑚人工感染 (O隨機將所有菌株的菌液分成若干組，并按組混合后用于人工感染； (2)在24X20X 36cm的無色中裝8 IOL過濾和消毒的海水，同時放入3飛枝與細菌來源相同的枝狀健康珊瑚，暫養3飛d，健康生長的珊瑚用于后續試驗；將每組混合菌液分別加入含有健康珊瑚的塑料桶中，每桶對應I組混合菌液，形成若干試驗組；在另一個含有健康珊瑚的塑料桶中，加入與菌液等體積的2216E液體培養基，形成對照組；浸泡感染12h ； (3)珊瑚固定裝置的構建與海區試驗選取與樣品珊瑚生長生境相似的平坦海區，垂直于海流方向固定鋼釬，間距為8 12m ;以保持珊瑚健康生長環境為原則，在兩根鋼釬間平行拉上兩條聚酯綁繩，確保綁繩的合適離地距離、合適間距，構成珊瑚固定裝置；將試驗組和對照組珊瑚轉移到試驗海區，用塑料綁帶將所有珊瑚按組別固定于聚酯綁繩上； C.海區感染珊瑚的觀察 在珊瑚轉入海區后，每f 2天觀察并記錄試驗結果，觀察周期為15 20天；當對照組珊瑚正常生長而某一試驗組珊瑚出現與細菌分離樣品珊瑚相同病癥時，確定引發該流行病的病原菌存在于該試驗組菌株中； D.珊瑚的室內人工感染 將海區試驗確定的含有病原菌的試驗組中所有菌株分別培養成濃度為IO9 CFU/ml的菌液，取Iml分別加入裝有8 10L海水和3枝健康珊瑚的無色塑料桶中進行浸泡感染；在另一個裝有8 10L海水和3枝健康珊瑚的無色塑料桶中，加入Iml 2216E液體培養基，形成對照組；整個試驗過程中只補充因蒸發損失的水份；觀察并記錄試驗組和對照組的珊瑚的生長狀況，觀察周期15 20d ;依據“對照組正常生長而試驗組產生與菌株分離樣品相同病癥”的原則，最終確定引發該流行病的病原菌菌株。
全文摘要
本發明涉及一種鳥槍打靶式珊瑚人工感染法。其技術方案是首先，將從患病珊瑚分離獲得的菌株隨機分成多個試驗組，利用這些混合菌液平行組同時對健康珊瑚進行人工感染；然后，再將誘發健康珊瑚患病的試驗組菌株分別對健康珊瑚進行人工感染；最終，確定誘發健康珊瑚患病的細菌病原，從而實現快速、準確的珊瑚細菌病原分離和鑒定過程。本發明的有益效果是針對珊瑚細菌疾病實現了病原菌的快速分離與確定；與傳統方法相比，大大降低了珊瑚細菌性疾病流行病學調查的工作強度。
文檔編號A01K67/033GK102630646SQ20121012165
公開日2012年8月15日 申請日期2012年4月24日 優先權日2012年4月24日
發明者周永燦, 胡超群, 謝珍玉 申請人:海南大學