專利名稱：大豆圣豆9號NAC轉錄因子基因GmST2及其應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于生物基因工程技術領域，尤其涉及大豆圣豆9號NAC轉錄因子基因——GmST2及其應用。
背景技術：
大豆是重要的經濟作物，因此提高和優化大豆品質成為人們關注的熱點。我國是世界上最缺水的國家之一，干旱是我國農業生產主要自然災害，且鹽堿地和次生鹽堿化耕 地的面積逐年増加，這些不利的環境條件嚴重制約了我國的農作物產量。為了適應這些不利的環境，植物內部發展一系列的防衛措施，也需要非生物脅迫應答基因參與。目前已經鑒定了許多鹽和干旱應答基因并驗證了他們在非生物脅迫中的功能，但關于很多非生物脅迫相關的基因的生物學功能仍然是未知的。植物轉錄因子研究是功能基因組研究的ー個重要方面。雖然轉錄因子在基因組中所占比例很少，但在調控植物的生長發育、響應外界環境脅迫中發揮重要作用。NAC轉錄因子是近十年來新發現的植物特有的轉錄調控因子。1997年Aida等首先報道了 NAC結構域，發現在矮牽牛NAM基因、擬南芥A TA F1/2和CUC2基因編碼蛋白的N端包含一段保守的氨基酸序列，取三基因首字母命名為NAC。第一個NAC轉錄因子是由Souer等于1996年從矮牽牛中克隆得到的，隨后在擬南芥、水稻、小麥、大豆等物種中相繼發現，目前在擬南芥中共發現了 105個NAC成員，而大豆中則發現了 226個。研究表明，NAC轉錄因子在植物的生長發育、器官建成、激素調節和防御抵抗多種生物和非生物脅迫等方面發揮著重要作用。植物的生存環境復雜多變，經常遭受干旱、高鹽、低溫和病蟲害等逆境脅迫，影響植物的生長發育，甚至會造成植物死亡，嚴重影響農業生產和生態環境。NAC轉錄因子受多種生物脅迫和非生物脅迫的誘導表達，參與植物的脅迫應答。然而，還未見大豆NAC膜結合轉錄因子功能的報道。
發明內容
本發明的目的是提供ー種大豆圣豆9號NAC轉錄因子基因_GmST2及其應用。本發明的技術方案是從圣豆9號中分離得到NAC轉錄因子基因-GmST2，將該基因轉到模式植物擬南芥中證明其功能，然后將該基因轉到原植株大豆中得到抗鹽/耐旱性提聞的轉基因植株。本發明所述的大豆圣豆9號NAC轉錄因子基因GmST2，其特征在于所述基因cDNA的核苷酸序列如SEQ ID No. I所示。本發明還提供了ー種含上述的大豆圣豆9號NAC轉錄因子基因GmST2的植物表達載體PK2GW7: :GmST2，其特征在于所述載體克隆區域核苷酸序列如SEQ ID No. 5所示。本發明還提供了ー種含上述的大豆圣豆9號NAC轉錄因子基因GmST2的植物表達載體PB2GW7: :GmST2，其特征在于所述載體克隆區域核苷酸序列如SEQ ID No. 6所示。本發明所述圣豆9號NAC轉錄因子基因GmST2在植株中表達GmST2基因和提高抗鹽/耐旱性的應用。。其中所述植株是大豆或擬南芥；進ー步的，所述擬南芥是Col-O野生型，大豆品種是魯豆11。具體的，本發明所述圣豆9號NAC轉錄因子基因GmST2在擬南芥或大豆植株中表達GmST2的應用。本發明首先在圣豆9號植株中克隆到了 NAC轉錄因子基因GmST2 ;利過gateway系統將GmST2基因進行BP反應連接到pD0NR221 (見圖I)，然后通過轉化的方法在大腸桿菌DH5 α中得到大量克隆，接著進行LR反應把此基因GmST2連接到表達載體pK2GW7 (見圖2)和pB2GW7(見圖3)上，并在大腸桿菌DH5a中表達；接著篩選轉基因大腸桿菌，并提取轉化質粒，最后將轉化質粒轉入農桿菌菌株GV3101中。將轉化農桿菌菌株轉入擬南芥和大 中，從而驗證表達的GmST2的功能。
本發明的有益效果利用現有的植物基因工程技術，本發明首次克隆得到了圣豆9號NAC轉錄因子基因GmST2并在擬南芥中進行表達，使轉基因擬南芥獲得了非轉基因擬南芥所不具備的提高抗鹽/耐旱性的能力。通過大豆萌動胚真空滲透輔助的外源基因轉化方法將該基因轉入大豆中，經過比較分析證明，轉基因植株比非轉基因植株的抗鹽/耐旱性提聞。本發明所述的基因可廣泛用于培育抗鹽/耐旱的植物品種。
圖I為入門載體pD0NR221圖譜。圖2為植物表達載體pK2GW7圖譜。圖3為植物表達載體pB2GW7圖譜。圖4為圣豆9號NAC轉錄因子基因GmST2的cDNA電泳圖，其中M為Marker，泳道1、2為基因的cDNA。圖5為轉GmST2基因的擬南芥純系篩選。圖6為圣豆9號NAC轉錄因子基因GmST2在轉基因擬南芥中RealTime-PCR表達分析。圖7為轉基因的擬南芥中抗鹽性的分析。圖8為轉基因的擬南芥中耐旱性的分析。圖9轉GmST2基因的大豆再生植株。圖10為轉基因圣豆9號NAC轉錄因子基因GmST2魯豆IlPCR檢測圖，其中泳道M為Marker，泳道陽性對照為陽性質粒對照；泳道陰性對照為陰性植株對照；泳道4、7、8均為轉GmST2基因陽性植株。圖11為轉基因圣豆9號NAC轉錄因子基因GmST2魯豆11 Southern-Blot分析圖，其中泳道M為Marker，泳道+為陽性質粒對照；泳道-為陰性植株對照；泳道1、2、3均為轉GmST2基因陽性植株。圖12為轉基因的大豆中抗鹽性的分析。
具體實施方式
實施例I、GmST2的克隆I. I圣豆9號總RNA的提取(I)將圣豆9號植物材料放入研缽中，利用液氮將其研磨成粉末(直接應用于下面的實驗或者凍于_80°C超低溫冰箱保存備用)；(2)等液氮揮發后，立即將100_200mg植物粉末轉入到I. 5ml離心管中，然后迅速的加入Iml Trizol提取液，渦旋震蕩使樣品充分溶入提取液中，室溫放置5min ；(3) 4°C，12，OOOrpm,離心lOmin，將O. 9ml上清液轉移到新的I. 5ml離心管中，再加入O. 2ml氯仿劇烈振蕩混勻15sec,室溫放置2_5min ；(4) 4°C，12，OOOrpm,離心lOmin，將O. 4ml上清液轉移到新的I. 5ml離心管中，再加入O. 4mI異丙醇,上下翻轉15次混勻溶液,室溫放置15mim ；
(5)4°C, 12，OOOrpm,離心lOmin,棄上清，用Iml 75%的こ醇洗漆沉淀兩次,4°C,
8,OOOrpm,離心 5min ；(6)棄上清，開蓋于超凈工作臺中上干燥RNA約2_5min，加入40 μ I RNase-Free水，在60°C中充分溶解RNA IOmin ；(7)用紫外分光光度計測RNA樣品的OD值和濃度，A26(l/A28(l達到I. 7-2. O為佳；瓊脂糖凝膠電泳檢測的質量。I. 2 RNA的反轉錄(I)向離心管中依次加入下列物質(40 μ I反應體系):
總 RNA3 pg
oligo-dT (0.05μ§/μ1)2μ1
dNTP (0.01μ§/μ1)2μ1
RNase-Free 水至 27μ1(2)輕輕混勻后，65°C變性5min,立即插到冰上,冰浴至少Imin ；(3)向離心管中依次加入下列物質
5 xbufFer 8μ1 20mM DTT 4μ1 _MMLV _ Ιμ (4)輕輕混勻后，42°C恒溫水浴lh，65°C變性lOmin，_20°C保存備用。1.3GmST2 基因克隆GmST20X-F:5’ -AAAAAGCAGGCTCGATGAAGGGAGAATTAGAGTTGCC-3’GmST20X-R:5’ -AGAAAGCTGGGTTTCACATCTTCTGTAGGTACATGAACA-3’(I)高保真酶Primer Star進行Gateway系統的第一步擴增的反應體系如下(50 μ I 體系)
權利要求
1.ー種大豆圣豆9號NAC轉錄因子基因GmST2，其特征在于所述基因cDNA的核苷酸序列如SEQ ID No. I所示。
2.ー種含有權利要求I所述大豆圣豆9號NAC轉錄因子基因GmST2的植物表達載體PK2GW7: :GmST2，其特征在于所述載體克隆區域核苷酸序列如SEQ ID No. 5所示。
3.ー種含有權利要求I所述大豆圣豆9號NAC轉錄因子基因GmST2的植物表達載體PB2GW7: :GmST2，其特征在于所述載體克隆區域核苷酸序列如SEQ ID No. 6所示。
4.權利要求I所述大豆圣豆9號NAC轉錄因子基因GmST2在植株中表達GmST2基因和提高抗鹽/耐旱性的應用。
5.如權利要求4所述的應用，其特征在于所述植株是大豆或擬南芥。
全文摘要
本發明公開了一種大豆圣豆9號NAC轉錄因子基因——GmST2及所述基因GmST2的植物表達載體。本發明還公開了所述基因GmST2在擬南芥和大豆植株中提高其抗鹽/耐旱性的應用。實驗證明，本發明所述轉基因植株比非轉基因植株的抗鹽/耐旱能力得到了很大程度的提高，為通過基因工程手段提高作物抗鹽/耐旱性提供了理論依據和實踐基礎。可廣泛用于培育抗鹽/耐旱的植物品種。
文檔編號A01H5/00GK102676541SQ201210128590
公開日2012年9月19日 申請日期2012年4月27日 優先權日2012年4月27日
發明者向鳳寧, 姬丹丹, 李朔 申請人:山東大學