專利名稱：一種梨種質抗黑斑病鑒定的方法
技術領域：
本發明屬于果樹技術領域，更具體涉及ー種梨種質抗黒斑病鑒定的方法，經該方法處理可以有效解決梨科研、育種及生產中梨品種抗黒斑病快速鑒定的問題。該方法適用于從事梨科研、育種及生產的科研単位、公司和個人。
背景技術：
梨屬于薔薇科(Rosaceae)蘋果亞科(Maloideae)梨屬(Pyrus)植物，為喬本落葉果樹，是我國三大栽培果樹之一，在世界上亦占有舉足輕重的地位。據中國年鑒統計，2010年我國梨種植面積1063. I千公頃，產量1505. 71萬噸，居世界首位。梨果生產一直是我國農民增收致富的重要支柱產業，也是我國出口創匯的主要農產品之一。但隨著砂梨栽培面積的擴大，梨黒斑病(Alternaria alternata(Fr. )Keissler)逐漸發展成為我國梨園中主要的病害，特別是在南方砂梨產區發病更為嚴重。梨黒斑病主要危害葉、果實和新梢，導致樹體衰弱，縮短結果年限，造成嚴重的經濟損失，而且還造成貯藏期病果，并在梨的進出口貿易中受到進ロ國的嚴密關注。梨黒斑病防治不當會造成梨樹葉片提前脫落，容易使梨樹形成二次花，嚴重影響次年梨果產量，一般梨黒斑病造成果農的損失可達20% -30%，嚴重時達到50% -60%。在我國南方梨產區，防治病害成功的關鍵主要是看梨園中梨黒斑病防治的效果，梨農一年中梨樹一半以上的農藥防治成本用于防治梨黒斑病。目前防治梨黒斑病的方法是使用甲基托布津、代森錳鋅和苯醚甲環唑等化學藥劑，長期使用這些化學藥劑，如果使用不當必然會引起病原菌對化學藥劑產生抗藥性、污染環境和對人體健康產生危害等問題。為了克服化學藥劑防腐的毒性缺點，制定合理有效梨黑斑病的綜合防治措施，選育抗病性生產品種勢在必行，但如何快速準確的鑒定梨品種在大面積推廣過程中具有抗黑斑病的特性，已是擺在科研人員面前必須解決的重大課題。多年來，我們依托國家果樹種質資源圃，圍繞著梨種質抗黒斑病鑒定評價開展了大量科學研究與試驗，總結發明出ー套梨種質抗黒斑病鑒定的方法。本方法是利用梨黒斑病病原菌孢子懸浮液對一年生梨品種嫁接苗葉片進行噴霧接種，接種后24小時內保持空氣濕度在95%以上，接種后20天進行調查，根據病情級數計算病情指數，對梨種質進行抗黒斑病鑒定評價，采用本方法能夠快速準確的對梨品種進行抗黒斑病鑒定。
發明內容
本發明的目的是在于提供了ー種梨種質抗黒斑病鑒定的方法，方法易行，操作簡便，使用該方法能夠本方法能夠快速準確的對梨品種進行抗黒斑病鑒定。為了實現上述的目的，本發明采用以下技術措施本發明是利用梨黒斑病病原菌孢子懸浮液對一年生梨品種嫁接苗葉片進行噴霧接種，接種后24小時內保持空氣濕度在95%以上，接種后20天進行調查，根據病情級數計算病情指數，對梨種質進行抗黒斑病鑒定評價。
ー種梨種質抗黒斑病鑒定的方法，其步驟是I.黑斑病原菌的準備(I)培養基的制備馬鈴薯培養基(PSA):馬鈴薯(去皮)200g，瓊脂粉20g，蔗糖20g，水1000mL。配制方法如下將馬鈴薯去皮，切成約2cm2的小塊，煮沸0. 5h，注意用玻璃棒攪拌以防糊。然后用雙層紗布過濾，取其慮液加入瓊脂粉，溶解后加入蔗糖，再補足水至1000mL，PH 7.0。(2)梨黒斑病分離鑒定采集的帶有梨黒斑病病癥的葉片或果實，參照2005年杜連祥，路福平主編的《微生物學實驗技木》進行組織分離、單孢純化、培養、保存。將分離獲得的菌株接種到幼嫩的梨葉片上，觀察能否產生典型的黒斑病病斑，然后再對病斑進行分離純化。將分離純化的 病原菌株在PSA培養基上劃線培養6-8d，觀察菌落形態；繼續培養19-21天后在顯微鏡下觀察病原菌的菌絲和孢子形態特征，參照1979年魏景超主編的《真菌形態學鑒定手冊》，鑒定分離所得病原菌的種類。為了進一步確認梨黒斑病病原菌菌株的種名，采用rDNA-ITS分子鑒定法對分離的菌株進行分析。以病原真菌的DNA作為模板，用通用引物ITSl TCCGTAGGTGAACCTGCGG(序列 5_3’ )和 ITS4 :TCCTCCGCTTAITGATATGC(序列 5_3’)引物序列來源文獻“ITS序列分析在真菌分類鑒定中的應用進行擴增”(2007年陳劍山，鄭服叢)，將所測得的rDNA-ITS序列在GenBank中用Clustalx 2. 0. 10對分離梨黑斑病菌和已登錄發表的梨黒斑病病原菌rDNA-ITS序列進行多重序列比對分析。綜合病原菌形態學特征及rDNA-ITS序列測定比對結果，鑒定梨黒斑病菌。(3)梨黒斑病原菌轉接將分離、純化并鑒定的黒斑病原菌在新鮮的斜面PSA培養基上劃線，光照培養箱28°C培養19-21天，長出孢子后放于冰箱4°C保存。(4)梨黒斑病原菌活化及擴大培養將保存的黒斑病原菌從冰箱中取出，用接種環在培養皿中劃線，并在光照培養箱28で培養。等菌絲鋪滿培養皿后，在無菌條件下用菌絲塊接種的方法在培養皿中擴大培養黒斑病原菌孢子。如此反復培養2-3次，培養出2 X IO5個孢子/mL的孢子懸浮液接種梨葉片。2、梨抗病性材料準備(I)梨品種嫁接10-11月間，當梨處于休眠期時，采集已選梨品種的枝條，采用芽接方法參照2010年胡紅菊，王友平主編的《砂梨優良品種及標準化栽培技木》中苗木培育，在豆梨砧木上嫁接，每個品種嫁接50株。 (2)梨嫁接品種移栽1-2月間，在雨雪天氣來臨之前，將梨嫁接品種苗木移栽到簡易的溫室大棚中防止品種芽凍傷，溫度控制在10-15度。3.人工接種鑒定(I)病原孢子液配制將培養皿擴大培養19-21天后，每個培養皿中加入20mL無菌水，用2cm型號牌刷將梨黒斑病孢子刷下，集中到IL的燒杯中，使用血球計數板在顯微鏡下計數，并用蒸餾水將梨黒斑病孢子稀釋成濃度為2 X IO5個孢子/mL的孢子懸浮液，放入28°C培養中恒溫下培養6h，發芽率在80%以上，待用。(2)人工接種待接種的梨品種整個生育期中不噴施殺菌劑，在6月-7月間將待接種梨品種頂芽去掉，使用2X105個孢子/mL的梨黒斑病孢子懸浮液噴霧接種到待鑒定嫁接梨品種上，噴霧至葉片正反面全部淋濕。接種后24小時內保持空氣濕度在95%以上，接種后20天進行調查，根據病情級數計算病情指數，對梨種質進行抗黒斑病鑒定評價。4.病情調查與分級標準接種20天，調查接種梨品種全部葉片受害級別。同時調查鑒定品種的自然發病的病情指數，按每株東、西、南、北四個方向調查，每個方向隨即調查50片葉。病情調查與分級標準0級無病斑；I級病斑占葉面積的10%以下；3級病斑占葉面積的10% 25% ;5級病斑占葉面積的26 % 40 % ;7級病斑占葉面積的41% 65% ;9級病斑占葉面積的65%以上。根據受害級別，計算黒斑病病情指數。
權利要求
1.ー種梨種質抗黒斑病鑒定的方法，其步驟是 A、黒斑病原菌的準備 首先是培養基的選擇，選擇馬鈴薯培養基，制備方法為馬鈴薯200g，瓊脂粉20g，蔗糖20g，水1000M1，配制方法如下將馬鈴薯去皮，切成2cm2的小塊，煮沸0. 5h，用玻璃棒攪拌，然后用雙層紗布過濾，取其慮液加入瓊脂粉，溶解后加入蔗糖，再補足水至1000mL，PH 7.0 ；其次是梨黒斑病分離鑒定步驟，鑒定方法為采集的帶有梨黒斑病病癥的葉片或果實，按常規方法進行組織分離、單孢純化、培養、保存，將分離獲得的菌株接種到幼嫩的梨葉片上，觀察黒斑病病斑，對病斑進行分離純化，將分離純化的病原菌株在PSA培養基上劃線培養6-8d，觀察菌落形態；繼續培養19-21天后在顯微鏡下觀察病原菌的菌絲和孢子形態特征，參照真菌形態學鑒定手冊，鑒定分離所得病原菌的種類，為了確認梨黒斑病病原菌菌株的種名，采用rDNA-ITS分子鑒定法對分離菌株進行分析，以病原真菌的DNA作為模板，用通用引物ITSl和ITS4進行擴增，將所測得的rDNA-ITS序列在GenBank中用Clustalx 2. 0. 10對分離梨黒斑病菌和已登錄發表的梨黒斑病病原菌rDNA-ITS序列進行多重序列比對分祈，綜合病原菌形態學特征及rDNA-ITS序列測定比對結果，鑒定梨黒斑病菌；再次是梨黑斑病原菌轉接，轉接步驟為將分離、純化并鑒定的黒斑病原菌在新鮮的斜面PSA培養基上劃線，光照培養箱28°C培養19-21天，長出孢子后放于冰箱4°C保存；最后為梨黑斑病原菌活化及擴大培養，培養方法為將保存的黒斑病原菌從冰箱中取出，用接種環在培養皿中劃線，并在光照培養箱28 V培養，菌絲鋪滿培養皿后，在無菌條件下用菌絲塊接種的方法在培養皿中擴大培養黑斑病原菌孢子，反復培養2-3次，培養出2 X IO5個孢子/mL的孢子懸浮液接種梨葉片； B、梨抗病性材料準備 首先是梨品種嫁接，10-11月間，梨處于休眠期時，采集已選梨品種的枝條，采用芽接方法在豆梨砧木上嫁接，每個品種嫁接；其次為梨嫁接品種移栽，1-2月間,在雨雪天氣來臨之前，將梨嫁接品種苗木移栽到溫室大棚； C、人工接種鑒定 首先為病原孢子液配制，將培養皿擴大培養19-21天后，每個培養皿中加入20mL無菌水，將梨黒斑病孢子刷下，集中到IL的燒杯中，使用血球計數板在顯微鏡下計數，并用蒸餾水將梨黒斑病孢子稀釋成濃度為2 X IO5個孢子/mL的孢子懸浮液，放入28°C培養中恒溫下培養6h，發芽率在80%;其次是人工接種，接種方法為待接種的梨品種整個生育期中不噴施殺菌劑，在6月-7月間將待接種梨品種頂芽去掉，用2 X IO5個孢子/mL的梨黒斑病孢子懸浮液噴霧接種到待鑒定嫁接梨品種上，噴霧至葉片正反面全部淋濕，接種后24小時內保持空氣濕度在95%，接種后20天進行調查，根據病情級數計算病情指數，對梨種質進行抗黑斑病鑒定評價； D、病情調查與分級標準，接種后20天，調查接種梨品種全部葉片受害級別，同時調查鑒定品種的自然發病的病情指數，按每株東、西、南、北四個方向調查，每個方向隨即調查50片葉； 病情調查與分級標準參照如下 0級無病斑； I級病斑占葉面積的10%以下；3級病斑占葉面積的10 % 25 % ;5級病斑占葉面積的26 % 40 % ;7級病斑占葉面積的41% 65% ;9級病斑占葉面積的65%;根據受害級別，計算黒斑病病情指數
全文摘要
本發明公開了一種梨種質抗黑斑病鑒定的方法，它包括以下步驟(1)梨黑斑病病原菌準備，主要為培養基配制、梨黑斑病分離鑒定、梨黑斑病原菌轉接和梨黑斑病原菌活化及擴大培養；(2)梨抗黑斑病材料準備，主要為梨品種嫁接和梨嫁接品種移栽(3)人工接種鑒定，主要利用梨黑斑病病原菌孢子懸浮液對一年生梨品種嫁接苗葉片進行噴霧接種；(4)病情調查與分級標準。方法易行，操作簡便，使用該方法能夠本方法能夠快速準確的對梨品種進行抗黑斑病鑒定。通過本發明處理可以有效解決梨科研、育種及生產中梨品種抗黑斑病快速鑒定的問題。
文檔編號A01G17/00GK102640671SQ20121013218
公開日2012年8月22日 申請日期2012年5月2日 優先權日2012年5月2日
發明者張靖國, 楊曉平, 田瑞, 胡紅菊, 陳啟亮 申請人:湖北省農業科學院果樹茶葉研究所