專利名稱：一種抗香蕉枯萎病發酵液及其制備方法和應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于微生物發酵技術領域，具體涉及ー種抗香蕉枯萎病發酵液及其制備方法和應用。
背景技術：
香蕉枯萎病是由尖胞錸刀菌古巴專化型(Fusarium oxysporium f. sp.cubense, F0C)病原真菌引起的毀滅性土傳病害，自1874年首次在澳大利亞發現以來，曾于1896年在巴拿馬造成大面積危害，之后逐漸傳至世界各地，是至今無法解決的世界科技難題。目前，在我國廣東、海南、廣西、云南和福建 等香蕉主產區，香蕉枯萎病是由FOC的4號生理小種引起的，發病蕉園發病率一般在30-50%，重病區可達90%以上，導致香蕉減產、甚至絕收，是香蕉生產上的ー個主要限制因子。迄今對該香蕉枯萎病尚無理想的抗病品種和化學藥劑，因此，結合栽培措施，施用對該病具有拮抗效果的微生物發酵液，從而抑制土壌香蕉枯萎病數量，改變土壌的微生物生態結構，促進香蕉生長，提高香蕉廣譜抗病性，成為ー種理想的生物防治措施。目前，關于單ー菌株在植物生物防治上的應用報道很多，而含有多種香蕉枯萎病拮抗菌的復合發酵液及發酵エ藝鮮有報道。單ー菌株在室內及盆栽時效果較好，但在大田應用中往往效果不顯著。人們普遍的研究方法是先獲得拮抗菌株然后再對拮抗菌株進行固態或者液態發酵，這種單ー的菌株發酵，受到有益微生物數量少，繁殖系數低，發酵條件復雜等因素的制約，最終導致其在大田應用的效果不顯著。
發明內容
本發明的第一個目的在于提供一種抗香蕉枯萎病發酵液，該發酵液中含大量拮抗微生物，對香蕉枯萎病具有顯著的控制作用，并且該發酵液的培養基質來源方便，成本低廉。本發明的第二個目的在于提供上述抗香蕉枯萎病發酵液的制備方法，該制備方法エ藝簡單。本發明的最后ー個目的在于提供上述抗香蕉枯萎病發酵液在制備具有抗香蕉枯萎病作用的藥物中的應用。本發明的第一個目的是通過如下技術方案來實現的一種抗香蕉枯萎病發酵液，含以下重量份的培養基質餅肥、紅糖和水，其中餅肥和紅糖的總重量與水的總重量比為1:4，培養基質的(/^比為15 25 :1。本發明所述餅肥優選為豆柏、花生餅和菜籽餅中的ー種或幾種。本發明的第二個發明目的是通過如下技術方案來實現的上述抗香蕉枯萎病發酵液的制備方法，含以下步驟(I)將紅糖溶于水中得紅糖水，將餅肥置于可透氣性包裝體內并將置于可透氣性包裝體內的餅肥置于紅糖水中或直接將餅肥溶于紅糖水中，調節PH值為6 8，置于陰涼通風處，密封保存，得含餅肥的紅糖水溶液；(2)將含餅肥的紅糖水溶液在25 30°C條件下發酵7 15天，每天早晚各攪拌含餅肥的紅糖水溶液5 10分鐘，直至完成發酵過程，得紅褐色溶液，過濾即得含多種微生物的抗香蕉枯萎病發酵液。在上述步驟中本發明步驟(I)中所述餅肥優選為豆柏、花生餅和菜籽餅中的ー種或幾種。本發明步驟(I)中所述的可透氣性包裝體為紗布袋或編織袋。根據需要使用的發酵液的用量來確定是直接 將餅肥溶于紅糖水中還是先將餅肥置于可透氣性包裝體中，再將可透氣性包裝體置于紅糖水中，如發酵液用量較少時，可以直接將餅肥溶于紅糖水中，若用于大面積蕉園吋，則先將餅肥置于可透氣性包裝體中，再將包裝體置于紅糖水中。本發明中的營養基質通過發酵，獲得含大量拮抗微生物的發酵液，這種發酵方法得到微生物的原理主要為有機質與紅糖發酵過程本身產生，經常規分離篩選鑒定發現，其產生的微生物均為植株促生微生物或拮抗微生物(尖孢錸刀菌)，主要種類有蘇云金芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、臘樣芽孢桿菌、梭形芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌以及施氏假單孢菌屬、耐寒短桿菌屬等，易于繁殖定植，克服了單ー菌株發酵有益微生物數量少，繁殖系數低，發酵條件復雜等因素制約的缺陷。本發明抗香蕉枯萎病發酵液的使用方法可以參考如下將發酵液以每株香蕉l(Tl5ml，稀釋5(T100倍液對香蕉進行噴施或灌根，可有效防控香蕉枯萎病。并且，在發酵完成后，過濾后的濾渣還可以使用，包裝體內剰余的發酵過的餅肥中含有豐富的有機質，也可以再次使用，具體使用過程參考如下將過濾后的濾渣以及袋中剩余的有機質按每株0. 2^0. 5kg施入香蕉根圍，可以為植株提供有機質營養，促進植株生長，增強植株抗性。本發明的最后ー個目的是通過如下技術方案來實現的上述抗香蕉枯萎病發酵液在制備具有抗香蕉枯萎病的藥物中的應用。本發明具有如下優點(I)本發明抗香蕉枯萎病發酵液采用的營養基質原料來源方便，價格低廉；(2)本發明制備獲得的抗香蕉枯萎病發酵液可隨噴灌或滴灌設施施入，省時、省ェ；(3)本發明制備獲得的抗香蕉枯萎病發酵液濃度適中，是復合20余株香蕉枯萎病拮抗菌發酵液，實施例9中的實驗結果表明，在已經嚴重發病(當季發病率30%以上)的地塊，香蕉枯萎病發病率可控制在10%以下，如果連年施用，可以起到改良土壌，控制香蕉枯萎病的發生的作用；(4)本發明以發酵液發酵后的抑菌活性高低為標準，綜合降低成本、節約能源、簡化工藝、提高效率等因素，篩選出優化的基質紅糖中C/N、發酵條件和發酵方法；(5)本發明中的抗香蕉枯萎病發酵液中含豐富有機質和氨基酸，能夠促進香蕉生長，健壯植株，結合所含拮抗微生物的多種生防作用，從而達到防治香蕉枯萎病的效果；(6)本發明中的抗香蕉枯萎病發酵液還可以起到改良土壌、改善土壤理化性質、增強土壤肥力的作用，特別是多年連續施用效果更佳。
圖I是實施例I中制備獲得的發酵液中分離到的多株拮抗菌；圖2是實施例8中的盆栽防控效果；圖3是實施例9中的大田試驗效果圖，其中左側為對照處理，右側為發酵液處理。具體實施實例實施例I 本實施例提供的抗香蕉枯萎病發酵液，根據豆柏本身的C/N比以及紅糖的含碳量，豆柏的含氮量，調節培養基質的C/N為15:1，餅肥和紅糖的總重量與水的重量比為I :4，計算后得出豆柏105g，紅糖145g，水1000mL。上述抗香蕉枯萎病發酵液的制備方法如下(I)將紅糖溶于IOOOmL水中，將豆柏溶于紅糖水中，調節紅糖水的pH值為7. 0，置于陰涼通風處，密封保存，得含餅肥的紅糖水溶液；(2)將含餅肥的紅糖水溶液每天早晩各攪拌5 10分鐘，其余時間調節溫度許為29±1°C密封發酵15天，過濾得紅褐色溶液劑為發酵完成的發酵液。發酵液中微生物的分離與計數采用平板稀釋涂布法，采用平板稀釋涂布法，稀釋度(KT1 1(T3)，采用PDA培養基對真菌的進行分離；LB培養基對細菌的進行分離；高氏一號培養基對放線菌的進行分離，分離前加入質量百分含量為3%重鉻酸鉀抑制細菌、真菌的生長。用移液器分別吸取上述不同稀釋度的溶液100 y L，滴加于培養基平板上，用L型玻棒涂布均勻，稍晾干，倒置培養皿，于25 28°C溫箱中培養3天，根據平板上長出的菌落的顔色、形態、大小等，將不同的真菌、細菌和放線菌的單菌落挑出到培養基(真菌為PDA培養基，細菌為LB培養基、放線菌為高氏一號培養基)上純化培養，采用平板對峙培養法初篩拮抗菌株，初篩共獲得23株，(見圖I)采用稀釋涂布法檢測計數發酵液中活菌數為4. 88X 108CFU/mL菌液。本實施例發酵方法得到微生物的原理主要為有機質與紅糖發酵過程本身產生，微生物來源簡單，經分離篩選鑒定實驗，其產生的微生物均為植株促生微生物或拮抗微生物(尖孢錸刀菌)主要種類有蘇云金芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、臘樣芽孢桿菌、梭形芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌以及施氏假單孢菌屬、耐寒短桿菌屬等，易于繁殖定植，克服了單ー菌株發酵有益微生物數量少，繁殖系數低，發酵條件復雜等因素制約的缺陷。可以將抗香蕉枯萎病發酵液以姆株香蕉10 15mL,稀釋50 100倍液對香蕉進行噴施或灌根，可有效防控香蕉枯萎病。并且，將過濾后的濾渣以及袋中剰余的有機質按每株0. 2^0. 5kg施入香蕉根圍，可以為植株提供有機質營養，促進植株生長，增強植株抗性。實施例2本實施例提供的抗香蕉枯萎病發酵液，根據花生餅本身的C/N比，以及紅糖的含碳量，花生餅的含氮量，調節培養基質的C/N為20:1，并使餅肥與紅糖的總重量與水的重量比為I :4，計算后得出花生餅88g，紅糖162g，水IOOOmL0上述抗香蕉枯萎病發酵液的制備方法如下(I)將紅糖溶于IOOOmL水中，將花生餅裝入紗布袋后，將裝有花生餅的紗布袋溶于紅糖水中或者直接將餅肥溶于紅糖水中(視發酵的總液量多少而定，一般發酵溶液較少時可以直接將餅肥溶于紅糖，若用于大面積蕉園的發酵液可以采用前ー種方法)，調節紅糖水的PH值為7. O，置于陰涼透風處，密封保存，得含餅肥的紅糖水溶液；(2)將含餅肥的紅糖水溶液每天早晩各攪拌5 10分鐘，其余在常溫條件下(28 30°C)密封發酵15天，過濾得紅褐色溶液劑為發酵完成的發酵液。發酵液中微生物的分離與計數方法同實施例I，采用稀釋涂布法檢測計數發現，發酵液中菌量為4. 61 X 107CFU/mL以上。 可以將抗香蕉枯萎病發酵液以姆株香蕉10 15mL,稀釋50 100倍液對香蕉進行噴施或灌根，可有效防控香蕉枯萎病。并且，將過濾后的濾渣以及袋中剰余的有機質按每株0. 2^0. 5kg施入香蕉根圍，可以為植株提供有機質營養，促進植株生長，增強植株抗性。實施例3本實施例提供的抗香蕉枯萎病發酵液，根據菜籽餅本身的C/N比，以及紅糖的含碳量，菜籽餅的含氮量，采用常規方法調節培養基質的C/N為25:1，并使餅肥與紅糖的總重量與水的重量比為I :4，計算得出菜籽餅95g，紅糖155g，水1000mL。上述抗香蕉枯萎病發酵液的制備方法如下(I)將紅糖溶于IOOOmL水中，將菜籽餅溶于紅糖水中，調節紅糖水的pH值為6. 0，置于陰涼透風處，密封保存，得含餅肥的紅糖水溶液；(2)將含餅肥的紅糖水溶液每天早晩各攪拌5 10分鐘，其余時間常溫條件下(28 30°C)密封發酵15天，過濾得紅褐色溶液劑為發酵完成的發酵液。發酵液中微生物的分離與計數方法同實施例I，采用稀釋涂布法檢測計數發現，發酵液中菌量為I. 28X 108CFU/mL。可以將抗香蕉枯萎病發酵液以姆株香蕉10 15mL,稀釋50 100倍液對香蕉進行噴施或灌根，可有效防控香蕉枯萎病。并且，將過濾后的濾渣以及袋中剰余的有機質按每株0. 2^0. 5kg施入香蕉根圍，可以為植株提供有機質營養，促進植株生長，增強植株抗性。實施例4本實施例提供的抗香蕉枯萎病發酵液，根據菜籽餅的C/N，以及紅糖的含碳量，菜籽餅的含氮量，采用常規方法調節培養基質的C/N為22:1，并使餅肥與紅糖的總重量與水的重量比為I :4，計算后得出，菜籽餅108g，紅糖142g，水1000mL。上述抗香蕉枯萎病發酵液的制備方法如下(I)將紅糖溶于IOOOmL水中，將菜籽餅裝入紗布袋后，將裝有菜籽餅的紗布袋溶于紅糖水中，或者直接將餅肥溶于紅糖水中(視發酵的總液量多少而定，一般發酵溶液較少時可以直接將餅肥溶于紅糖，若用于大面積蕉園的發酵液可以采用前ー種方法)調節紅糖水的PH值為7，置于陰涼透風處，密封保存，得含餅肥的紅糖水溶液；(2)將含餅肥的紅糖水溶液每天早晩各攪拌5 10分鐘，其余時間在常溫下(28 30°C)密封發酵15天，過濾得紅褐色溶液劑為發酵完成的發酵液。發酵液中微生物的分離與計數方法同實施例I，采用稀釋涂布法檢測計數發現，發酵液中菌量為3. 53X 107CFU/mL以上。
可以將抗香蕉枯萎病發酵液以姆株香蕉10 15mL,稀釋50 100倍液對香蕉進行噴施或灌根，可有效防控香蕉枯萎病。并且，將過濾后的濾渣以及袋中剰余的有機質按每株0. 2^0. 5kg施入香蕉根圍，可以為植株提供有機質營養，促進植株生長，增強植株抗性。實施例5本實施例提供的抗香蕉枯萎病發酵液，根據花生餅的C/N,以及紅糖的含碳量，花生餅的含氮量，采用常規方法調節培養基質的C/N為22:1，并使餅肥與紅糖的總重量與水的重量比為I :4，計算后得出花生餅79g，紅糖171 g，水IOOOmL0上述抗香蕉枯萎病發酵液的制備方法如下(I)將紅糖溶于IOOOml水中，將花生餅裝入紗布袋后，將裝有花生餅的紗布袋溶于紅糖水中，調節紅糖水的PH值為7. 0，置于陰涼透風處，密封保存，得含餅肥的紅糖水溶液；(2)將含餅肥的紅糖水溶液每天早晩各攪拌5-10分鐘，其余時間在常溫下(28 30°C)密封發酵15天，過濾得紅褐色溶液劑為發酵完成的發酵液。發酵液中微生物的分離與計數方法同實施例I，采用稀釋涂布法檢測計數發現，發酵液中菌量為3. 66X 107CFU/mL以上。可以將抗香蕉枯萎病發酵液以姆株香蕉10 15mL,稀釋50 100倍液對香蕉進行噴施或灌根，可有效防控香蕉枯萎病。并且，將過濾后的濾渣以及袋中剰余的有機質按每株0. 2^0. 5kg施入香蕉根圍，可以為植株提供有機質營養，促進植株生長，增強植株抗性。實施例6本實施例提供的抗香蕉枯萎病發酵液，根據豆柏的C/N，以及紅糖的含碳量，花生餅的含氮量，采用常規方法調節培養基質的C/N為22:1，并使餅肥與紅糖的總重量與水的重量比為1/4，計算后得出豆柏70kg，紅糖180kg，水1000L。發酵使用大型發酵罐，將按比例配制好的含餅肥的紅糖水溶液置于發酵罐中，調節pH為7.0，調節溫度為28°C，攪拌速度為180rpm，通氣量彡50 %，發酵7天，即得抗香蕉枯萎病發酵液。上述抗香蕉枯萎病發酵液的制備方法以及抗香蕉枯萎病發酵液的使用方法參考實施例I。實施例7發酵液CN比配方的篩選本實例以花生餅為發酵有機質原料，根據花生餅的C/N，以及紅糖的含碳量，花生餅的含氮量，采用常規方法調節培養基質的C/N分別為10、15、20、25、30，并使餅肥與紅糖的總重量與水的重量比為I :4，按照實例I飛的發酵方法，分別得到了 5種不同CN比的發酵液，采用平板稀釋涂布法檢測含菌量。將上述5種不同的發酵液進行盆栽防效試驗，試驗地點中國熱帶農業科學院熱帶生物技術研究所溫室大棚。試驗品種巴西焦，購自中國熱帶農業科學院種苗組培中心，苗聞20cm左右，生長健壯、五葉一心,無病蟲害。
病原菌尖孢錸刀菌古巴專化型4號生理小種Fusarium oxysopoyum f. sp.cubence race 4 (F0C4)，由華南農業大學資源環境學院植物病理系姜子德教授提供。將F0C4接種在PDA培養基上，25°C下恒溫培養10d，把孢子洗入無菌水中配成濃度為5 X IO6個/mL孢子懸浮液，供接種用。供試土壤磚紅壤，采自海ロ市龍華區。發酵液上述五種不同的發酵液。試驗處理處理ー C/N為10:1的發酵液+病原菌處理；處理ニ C/N為15:1的發酵液+病原菌處理；處理三C/N為20:1的發酵液+病原菌處理；處理四C/N為25:1的發酵液+病原菌處理；處理五C/N為30:1的發酵液+病原菌處理；對照為只接種病原菌的處理，每個處理20株蕉苗。試驗方法選取大小長勢一致的香蕉幼苗，移栽至高10cm、直徑12cm的塑料盆中。移栽5天后，按不同處理施入發酵液(稀釋50倍)，每盆lOOmL，CK施入等量清水，每隔7天再重復施入發酵液，共施3次。第3次施入發酵液后7天，以傷根接種法接入F0C4。試驗期間，各處理盆栽管理措施均一致。病原菌接種后每隔5 d觀察蕉苗發病情況，待対照的發病率達到50%以上時調查各處理的病情指數，并計算相對防效。試驗結果如表I所示，C/N為15、20、25三個處理的發酵液處理其對枯萎病的相對防效均在42%以上，且含菌量的數量級為107，而C/N為10，30時其相對防效分別為21. 04%，16. 90%，且含菌量的數量級在105。由此得出，發酵液配方中C/N應控制在15 25之間。表I不同發酵液處理對香蕉苗期枯萎病的防治效果與發酵液的含菌量
權利要求
1.一種抗香蕉枯萎病發酵液，其特征是含以下培養基質餅肥、紅糖和水，其中餅肥和紅糖的總重量與水的總重量比為1:4，培養基質的C/N比為15 25 :1。
2.根據權利要求I所述的抗香蕉枯萎病的發酵液，其特征是所述餅肥為豆柏、花生餅和菜籽餅中的一種或幾種。
3.權利要求I或2所述的抗香蕉枯萎病發酵液的制備方法，其特征是含以下步驟 (1)將紅糖溶于水中得紅糖水，將餅肥置于可透氣性包裝體內并將置于可透氣性包裝體內的餅肥置于紅糖水中或直接將餅肥溶于紅糖水中，調節PH值為6 8，置于陰涼通風處，密封保存，得含餅肥的紅糖水溶液； (2)將含餅肥的紅糖水溶液在25 30°C條件下發酵7 15天，并不時攪拌保持通氣至完成發酵過程，得紅褐色溶液，過濾即得含多種微生物的抗香蕉枯萎病發酵液。
4.根據權利要求3所述的抗香蕉枯萎病發酵液的制備方法，其特征是步驟(I)中所述餅肥為豆柏、花生餅和菜籽餅中的一種或幾種。
5.根據權利要求3所述的抗香蕉枯萎病發酵液的制備方法，其特征是步驟(I)中所述的可透氣性包裝體為紗布袋或編織袋。
6.權利要求I或2所述的抗香蕉枯萎病發酵液在制備具有抗香蕉枯萎病的藥物中的應用。
全文摘要
本發明一種抗香蕉枯萎病發酵液，含以下培養基質餅肥、紅糖和水，其中餅肥和紅糖的總重量與水的總重量比為1:4，培養基質的C/N比為15~251。該發酵液中含大量拮抗微生物，對香蕉枯萎病具有顯著的控制作用，并且該發酵液的培養基質來源方便，成本低廉。還公開了上述抗香蕉枯萎病發酵液的制備方法，該制備方法工藝簡單。同時公開了上述抗香蕉枯萎病發酵液在制備具有抗香蕉枯萎病的藥物中的應用。
文檔編號A01P3/00GK102763685SQ20121024829
公開日2012年11月7日 申請日期2012年7月17日 優先權日2012年7月17日
發明者井濤, 周登博, 張錫炎, 段雅婕, 甘東泉, 趙炎坤 申請人:中國熱帶農業科學院熱帶生物技術研究所