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一種卡特蘭組織培養的方法

文檔序號:206925閱讀:452來源:國知局
專利名稱:一種卡特蘭組織培養的方法
技術領域
本發明涉及一種卡特蘭的組織培養快速繁殖方法,屬于植物細胞工程技術領域。ニ背景技術
卡特蘭是世界上栽培最多,最受人們喜愛的洋蘭之一。它花型優美,色彩艷麗,并且有特殊的芳香。一年四季都有不同的品種開花。花期較長,一般可開放2 3周,不僅是珍貴的盆花,還是重要的高檔切花。組織培養技術的應用大大促進了卡特蘭的規模生產,不僅能加快新品種推廣,而且能夠獲得可觀的經濟效益。但是卡特蘭外植體在初始培養中易褐化死亡,是原球莖誘導成功的一大障礙。目前認為植物組織培養中的褐變主要是由酶促褐變引起,即培養材料變褐主要是由傷ロ處分泌的酚類化合物引起。選擇適當的外植體是克服褐變的最主要的手段,取材時應注意選擇分生能力較強的外植體。成年植株比幼苗褐變程·度嚴重,夏季材料比冬季、早春及秋季材料的褐變嚴重,冬季培養物的存活率明顯高于夏秋季節。因此,采芽時機應盡可能避開生長旺盛期。對外植體要充分漂洗,促進酚類物質滲出。培養基的成分與褐變程度有關,要考慮所選培養基的狀態和類型,篩選適宜的培養基配方。在組織培養過程中,經常進行細胞篩選,可以剔除易褐變的細胞。在外植體接種廣2天后立即轉移到新鮮培養基中,能減輕酚類物質對培養物的毒害作用,使外植體盡快分生,連續轉移5飛次,可基本解決外植體的褐變問題。現有技術方案切取優良母株的新梢進行莖尖誘導繁育。通過研究,篩選出適合卡特蘭莖尖培養及分生苗生長的培養基配方和組培快繁技木。新梢經消毒后,于無菌條件下將外包嫩葉剝至廣2片,小心切除芽基部,保留生長點內長約2 3cm的莖尖頂端分生組織塊,接入莖尖培養基內培養,每瓶放I塊。將接種后的培養基置于室溫(25 ±2)で、相對濕度70°/Γ90%、光照強度20001χ條件下誘導培養,經繼代培養和生根培養,長成合格分生苗。莖尖誘導培養以配方Α. 1/2 MS + BA 2 mg/L + NAA O. 2 mg/L + 椰乳200 ml/L + 3 %蔗糖和配方B. 1/2 MS + BA 2mg/L + NAA 0.2 mg/L + 3%蔗糖效果較好,表現為莖尖組織塊分生率較高,誘導培養40天后外植體基部分生出較多的愈傷組織和不定芽點,經繼代培養,不定芽點逐漸發育長成不定芽,切取的不定芽塊轉入生根培養,60天后長成根莖葉齊全、生長正常的分生瓶苗,可出瓶移栽。現有技術從莖尖誘導不定芽到分生苗的培養周期較長,可能與卡特蘭內源激素的作用和植物體生長發育周期較長有夫。莖尖培養極易發生褐變,導致外植體切ロ組織壞死。需通過以下幾個方面的工作減輕外植體的褐變發生首先,要避免在高溫季節采芽,因為高溫有利植物體內酚類物質的產生,培養時褐變嚴重,新芽成活率較低,春秋季是較適宜的采芽季節;其次,需在培養基內単獨或混合加入活性炭lg/L、聚こ烯吡咯烷酮(PVP)5g/L、檸檬酸2g/L等藥劑抑制褐變;再次,培養溫度要保持在20 25で,此時培養材料分泌產生的酚類物質較少,室溫超過30°C時,褐變物質顯著增加,成活率大大降低;此外,暗培養和勤轉瓶(15 20天轉I次)也能減輕褐化物質對外植體的危害。三
發明內容
技術問題本發明通過切取卡特蘭新梢的頂芽和不同部位的側芽生長點進行液體培養,詳細描述了莖尖外植體的切割方法,一個新梢可以切取5個外植體,提高了増殖系數。其次通過適宜的激素配比和液體培養技術,有效解決卡特蘭莖尖常規培養方法的外植體褐變現象,提高培養質量。因為酶促褐變如同一般的酶促反應,其發生必須具備三個條件,即酶、底物和氧。液體培養阻斷了外植體與氧氣的接觸,可有效抑制褐變現象,從而簡化卡特蘭的莖尖培養流程。技術方案
利用卡特蘭新梢頂芽和側芽分生組織為外植體,通過添加適宜的激素配比和液體培養條件,進行愈傷組織誘導和分化,促進愈傷組織增殖并分化出原球莖,切割原球莖進行繼代培養,培養出幼苗,經生根培養長成合格的瓶苗。具體步驟如下 Cl)外植體的選擇與滅菌
選61厘米長的新梢作外植體,用升汞消毒法進行消毒,分別取新梢上頂芽和側芽作外植體進行培養,切割頂芽和側芽生長點中心部位的分生組織大小為直徑2 4mm。(2)愈傷組織誘導培養
將外植體分生組織塊放置在誘導培養基中,卡特蘭莖尖増殖的誘導培養基為改良的MS + 6-BA3 10mg/L + NAA0. 5 5mg/L + 糖 20000 30000mg/L,培養條件為液體震蕩暗培養,溫度20 25°C,液體培養皿放置在回旋器上,回旋頻率120rpm,培養40 60天;
其中,改良的MS基本培養基為,單位mg/L NH4N03 :850 1850、KN03 :1000 1900、CaCl2 · 2H20 :250 650、MgS04 · 7H20 :200 400、KH2P04 50 200、KI :0. 4 O. 9、H3B03 :3. O 7. 0、MnS04 · 4H20 :12. O 25. 0、ZnS04 · 7H20 :2. 5 9. 5、Na2Mo04 · 2H20
O.16 O. 35、CuS04 · 5H20 :0. 016 O. 025、CoC12 · 6H20 :0. 016 O. 025、FeS04 · 7H20 20. O 30. O、Na2 · EDTA · 2H20 :18. O 40. O、肌醇:50 100、氨基こ酸2. 0 3· O、谷氨酸10 18、天冬酰胺酸10 18 ;
(3)繼代培養
把增殖的愈傷組織轉接到繼代培養基,培養基配方為改良的KC +瓊脂6000 8000mg/L + 糖 20000 30000mg/L,培養條件為 溫度 20 28°C,光強 1500 3000Lx,每天光照12 16小時,每30天轉接I次,愈傷組織上逐漸分化出原球莖,原球莖進ー步切割轉接培養,發育成幼苗;
其中,改良的 KC 基本培養基為,單位mg/L Ca (N03) 2 · 4H20 :50(Tl000、ΚΗ2Ρ04 200 400、MgS04 · 7Η20 :100 300、(NH4) 2S04 :400 1000、NH4N03 :350 850、FeS04 · 7H20 :10 50、KCl :20(T400、MnS04 · 4H20 :3. O 10. O ;
(4)生根培養
將3 4cm高的苗接入生根培養基中,培養基配方為改良的KC + ΝΑΑ0. 2^2mg/L +瓊脂6000 8000mg/L +糖20000 30000mg/L。培養條件為光照培養,溫度為20 28°C,光強1500 3000Lx,每天光照16小時。幼苗長成合格的瓶苗。有益效果
本發明與現有技術相比具有如下優點和積極效果
I、外植體選擇途徑有優勢,即可以擴大増殖系數,相比頂芽培養側芽分生力強,具有較高的培養成活率。2、液體培養可以克服卡特蘭莖尖培養極易發生褐變的障礙,提高培養質量。3、培養基配方在MS和KC基本培養基的基礎上改良,易配制,成本低。四

圖I新梢側芽誘導的愈傷組織 圖2愈傷組織分化的叢生苗 圖3卡特蘭幼苗 五具體實施例方式 I、切割卡特蘭新梢的頂芽和側芽作外植體培養材料。在毎年春秋兩季卡特蘭生長旺盛期采集材料,選6 8厘米長的新梢,用利刀切下放入保鮮袋中。在實驗室內先把外表的塵土 徹底沖洗干凈,用升汞消毒法進行消毒剝去外層葉片,再用流水沖洗30分鐘,再用O. 1%的升汞消毒10分鐘,最后用無菌蒸餾水漂洗6 8次,毎次5分鐘。分別取新梢上的頂芽和側芽作外植體進行培養。頂芽外植體在芽點下部水平切取,再在生長點中心部位的四周切割取出分生組織塊;側芽外植體切取先從芽點的上部縱向斜切一刀,在生長點下部橫切一刀,把生長點分離,再在生長點中心部位切取的分生組織塊大小為直徑4飛_。2、獲取的分生組織塊在解剖鏡下用無菌解剖刀剝除殘留的葉原基后,重新切取生長點中心部位的分生組織塊大小為直徑2 4_,作為外植體進行初始培養。3、將外植體放置在誘導培養基中,卡特蘭莖尖増殖的誘導培養基為改良MS基本培養基和附加不同成份的物質,改良MS基本培養基為,單位mg/L NH4N03 :850 1850、KN03 1000 1900、CaC12 · 2H20 :250 650、MgS04 · 7H20 :200 400、KH2P04 :50 200、KI 0. 4 O. 9、H3B03 3. O 7. O、MnS04 · 4H20 :12. O 25. O、ZnS04 · 7H20 :2. 5 9. 5、Na2Mo04 ·2H20 :0. 16 O. 35、CuS04 ·5Η20 :0. 016 O. 025、CoC12 ·6Η20 :0. 016 O. 025、FeS04 · 7H20 :20. O 30. O、Na2 · EDTA · 2H20 :18. O 40. O、肌醇50 100、氨基こ酸
2.0 3. O、谷氨酸10 18、天冬酰胺酸10 18 ;附加成份為6-BA 3 10mg/L、NAA O. 5 5mg/L、糖 20000 30000mg/L。
4、液體震蕩暗培養,溫度為20 25°C,液體培養皿放置在回旋器上,回旋頻率120rpm。培養40-60天。5、把增殖的愈傷組織轉接到繼代培養基,培養基配方包括改良KC基本培養基和附加不同成份的物質,改良KC基本培養基為,單位mg/L Ca(N03)2 · 4H20 :500 1000、KH2P04 :200 400、MgS04 · 7H20 :100 300、(NH4) 2S04 :400 1000、NH4N03 :350 850、FeS04 · 7H20 :10 50、KCl :20(T400、MnS04 ·4Η20 :3. O 10. O ;附加成份為瓊脂 6000 8000mg/L、糖 20000 30000mg/L ;
6、光照培養,溫度為20 28°C,光強1500 3000Lx,每天光照12 16小時。每30天轉接I次。愈傷組織上逐漸分化出原球莖,原球莖進ー步切割轉接培養,發育成幼苗;
7、生根轉接,將3 4cm高的苗接入生根培養基中,這種生根培養基包括改良KC基本培養基和附加不同成份的物質,改良KC基本培養基的成份與繼代培養基相同,附加成份為ΝΑΑ0. 2 2mg/L、瓊脂 6000 8000mg/L、糖 2000(T30000mg/L ;
8、光照培養,溫度為20 28°C,光強1500 3000Lx,每天光照16小時。培養結果外植體選擇頂芽和側芽可以擴大培養基數4倍。統計了兩批新梢頂芽和不同部位側芽生長點的誘導成活率,頂芽、第一側芽、第二側芽、第三側芽、第四側芽的誘導成活率分別為40%、20%、75%、25%、25%。相比頂芽培養,第二側芽培養生長勢強,具有最高的誘導成活率。液體培養無褐化現象發生,可以克服卡特蘭莖尖固體培養極易發生褐變的 障礙,提高培養質量。培養基配方在MS和KC基本培養基的基礎上改良,易配制,成本低。
權利要求
1.卡特蘭的組織培養方法,其特征在干, (1)外植體的選擇與滅菌 選61厘米長的新梢作材料,用升汞消毒法進行消毒,切取頂芽和側芽生長點中心部位的分生組織塊作外植體進行培養; (2)愈傷組織誘導培養 將外植體分生組織塊放置在誘導培養基中,卡特蘭莖尖増殖的誘導培養基為改良的MS + 6-BA3 10mg/L + NAA0. 5 3mg/L + 糖 20000 30000mg/L,培養條件為液體震蕩暗培養,溫度20 25°C,液體培養皿放置在回旋器上,回旋頻率120rpm,培養40-60天; 其中,改良的MS基本培養基為,單位mg/L NH4N03 :850 1850、KN03 :1000 1900、CaCl2 · 2H20 :250 650、MgS04 · 7H20 :200 400、KH2P04 50 200、KI :0. 4 O. 9、H3B03 :3. O 7. 0、MnS04 · 4H20 :12. O 25. 0、ZnS04 · 7H20 :2. 5 9. 5、Na2Mo04 · 2H20 O. 16 O. 35、CuS04 · 5H20 :0. 016 O. 025、CoC12 · 6H20 :0. 016 O. 025、FeS04 · 7H20 20. O 30. O、Na2 · EDTA · 2H20 :18. O 40. O、肌醇:50 100、氨基こ酸2. 0 3· O、谷氨酸10 18、天冬酰胺酸10 18 ; (3)繼代培養 把增殖的愈傷組織轉接到繼代培養基,培養基配方為改良的KC +瓊脂6000 8000mg/L + 糖 20000 30000mg/L,培養條件為 溫度 20 28°C,光強 1500 3000Lx,每天光照12 16小時,每30天轉接I次,愈傷組織上逐漸分化出原球莖,原球莖進ー步發育成幼苗; 其中,改良的 KC 基本培養基為,單位mg/L Ca (N03) 2 · 4H20 :50(Tl000、ΚΗ2Ρ04 200 400、MgS04 · 7Η20 :100 300、(NH4) 2S04 400 1000、NH4N03 :350 850、FeS04 · 7H20 :10 50、KCl :20(T400、MnS04 · 4H20 :3. O 10. O ; (4)生根培養 將3 4cm高的苗接入生根培養基中,培養基配方為改良的KC + ΝΑΑ0. 2^2mg/L +瓊脂6000 8000mg/L +糖20000 30000mg/L,培養條件為光照培養,溫度為20 28°C,光強1500 3000Lx,每天光照16小時。
2.根據權利要求I所述卡特蘭的組織培養方法,其特征在于,切割頂芽和側芽生長點中心部位的分生組織塊大小為直徑2 4mm。
全文摘要
本發明涉及一種卡特蘭組織培養繁殖的方法,屬于植物細胞工程技術領域。以卡特蘭新梢為材料,通過愈傷組織誘導、繼代培養和生根培養,進行卡特蘭組培苗的快速擴繁。本發明提高了培養基數,有效解決了卡特蘭莖尖常規培養方法的外植體褐變現象,擴大了增殖系數,具有最高的誘導成活率;培養基配方在MS和KC基本培養基的基礎上改良,易配制,成本低。本發明是現有技術的有益改進,可為卡特蘭產業化開發應用提供技術支撐。
文檔編號A01H4/00GK102835311SQ20121028748
公開日2012年12月26日 申請日期2012年8月14日 優先權日2012年8月14日
發明者邵和平, 張瓊, 張寧寧, 孫永平, 夏明霞 申請人:江蘇丘陵地區南京農業科學研究所
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