專利名稱：一種冷凍保護液以及冷凍保存人胎盤羊膜和絨毛膜的方法
技術領域：
本發明涉及組織工程技術領域，具體的說是涉及一種冷凍保護液以及冷凍保存人胎盤羊膜和絨毛膜的方法。
背景技術：
羊膜和絨毛膜是人胎盤的兩個主要組成部分。羊膜在胎盤的最內層，膜體光滑，無血管、神經及淋巴，具有一定的彈性 ，其含有豐富的具有多潛能性、移植后不會誘導免疫排斥反的多能干細胞，人胎盤羊膜細胞還可表達神經細胞特異標記，分泌神經營養因子，用于神經系統疾病，除此之外人胎盤羊膜還可以作為眼科手術的基底膜；而絨毛膜是胎盤主體部分，與羊膜相鄰，絨毛膜上同樣含有豐富的具有多分化潛能的干細胞，可應用于由于衰老和病變引起的組織器官損傷修復以及移植中。理想化的工程化組織，除了需要具備很高的生物活性外，還需要能隨時滿足移植等手術的需要，因此，如人胎盤羊膜和絨毛膜這樣含有多能干細胞的工程化組織就需要長期保存。低溫冷凍保存是活體組織保存的常用方法，它一般是在0 -196°c進行保存。盡管低溫冷凍技術能夠使工程化組織長期保存，但是也帶來了冷凍損傷的問題。為了減少冷凍損傷的問題，在保存細胞和組織的時候需要加入冷凍保護液，從而減輕或避免冷卻、復蘇過程中的冰晶對細胞的損傷。中國專利申請號201010528721. I的專利提供了一種“人臍帶華通氏膠組織塊凍存保護液”，其根據所要保護的間充質干細胞的特點，公開了由滲透性冷凍保護劑、非滲透性冷凍保護劑以及基礎液等等多種成分組成保護液，應對間充質干細胞在冷凍保存中可能出現的損傷情況。但是，目前尚未有針對人胎盤羊膜和絨毛膜的低溫冷凍保存技術報道。因此，提供一種冷凍保存人胎盤羊膜和絨毛膜的技術，無疑會提高羊膜和絨毛膜的保存質量，保證羊膜和絨毛膜干細胞臨床應用的效果。
發明內容
有鑒于此，本發明的目的在于提供一種冷凍保護液以及冷凍保存人胎盤羊膜和絨毛膜的方法，使得所述方法能夠有效保護人胎盤羊膜和絨毛膜，使其復蘇后的干細胞活性達到90%以上。為了實現上述目的，本發明提供如下技術方案—種冷凍保護液，由胎牛血清、二甲基亞砜和右旋糖酐40組成，所述胎牛血清、二甲基亞砜和右旋糖酐40的體積比為7-9:1: I。其中，作為優選，所述胎牛血清、二甲基亞砜和右旋糖酐40的體積比為8:1:1。二甲基亞砜(DMSO)是一種重要的滲透型細胞保護劑。在深低溫(零下196度)保存細胞時凍存過程中，能防止細胞內液冰晶形成、滲透壓改變、細胞結構紊亂等導致的損傷。DMSO能夠快速穿透細胞膜進入細胞中，降低冰點、延緩凍存過程，同時提高細胞內離子濃度，減少細胞內冰晶的形成，從而減少細胞損傷。而右旋糖酐40屬于非滲透性抗凍劑，能溶于水，但不能進入細胞，使溶液呈過冷狀態，可在特定溫度下降低溶質濃度，從而起到保護作用。由于其分子量大，分子濃度低，對溶劑的活性作用很小，能降低溶液中低分子溶質(電解質)濃度，減輕鹽損傷，慢速冷凍效果較好。凍存細胞是個緩慢的過程，胎牛血清給凍存細胞提供必要的營養，而且血清中含有豐富的蛋白質對細胞也有保護作用。胎牛血清、右旋糖酐40與DMSO按照本發明所述比例混合作為人胎盤羊膜和絨毛膜凍存時的保護液，右旋糖酐40是細胞外防護劑，DMSO具有高滲透性，是細胞內保護劑，胎牛血清是營養物質，三者適應于羊膜干細胞和絨毛膜干細胞的特性，協同保護細胞的活性，防止細胞在凍存和復蘇的時候形成冰晶，進而影響細胞的活性。因此，本發明所書冷凍保護液能夠應用在低溫冷凍保存人胎盤羊膜和絨毛膜中。此外，本發明還提供一種冷凍保存人胎盤 羊膜和絨毛膜的方法，以胎牛血清二甲基亞砜右旋糖酐40為7-9:1 I的體積比稱量胎牛血清、二甲基亞砜和右旋糖酐40，配制成冷凍保護液，待儲存的人胎盤羊膜和絨毛膜分別浸入到冷凍保護液中，然后降溫至-100°C,最后轉移至液氮中保存。作為優選，所述胎牛血清、二甲基亞砜和右旋糖酐40的體積比為8:1:1，所述降溫操作優選為先以1°C /min的速率降至_40°C，然后再以5°C /min的速率降溫。將按照本發明所述方法凍存過的人胎盤羊膜和絨毛膜進行復蘇，然后分離、培養干細胞，同利用新采集的人胎盤羊膜和絨毛膜制備的干細胞進行活性對比，兩者活性均在90%，無明顯差異，表明了本發明所述冷凍保護液和方法能夠極其有效的保護羊膜和絨毛膜細胞活性，細胞幾乎沒有受到冷凍損傷，與新制備的羊膜和絨毛膜干細胞無差別。由以上技術方案可知，本發明在深入研究人胎盤羊膜和絨毛膜結構性的基礎上，選擇適合于保護人胎盤羊膜干細胞和絨毛膜干細胞的二甲基亞砜、右旋糖酐40和胎牛血清組成保護液，三者協同保護細胞的活性，防止細胞形成冰晶受到損傷，確保了復蘇后的干細胞活性與新制備的羊膜和絨毛膜干細胞活性無差別。
具體實施例方式本發明實施例公開了一種冷凍保護液以及冷凍保存人胎盤羊膜和絨毛膜的方法。本領域技術人員可以借鑒本文內容，適當改進工藝參數實現。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動對本領域技術人員來說是顯而易見的，它們都被視為包括在本發明。本發明的產品及方法已經通過較佳實施例進行了描述，相關人員明顯能在不脫離本發明內容、精神和范圍內對本文所述的產品及方法進行改動或適當變更與組合，來實現和應用本發明技術。為了進一步理解本發明，下面結合實施例對本發明提供的一種冷凍保護液以及冷凍保存人胎盤羊膜和絨毛膜的方法進行詳細說明。實施例I :利用本發明所述方法凍存人胎盤羊膜和絨毛膜I、凍存方法選取肝炎、梅毒、艾滋病等傳染病檢測陰性且無產科并發癥的胎盤，術前經得產婦知情同意并簽署知情同意書。術前準備無菌聚苯乙烯儲液瓶作為運送瓶，內裝市售細胞培養液，采集后4°C條件下12小時內送到凍存處。
無菌環境下，用有齒鑷輕輕的分離開羊膜和絨毛膜，手術剪剪取羊膜和絨毛膜。用生理鹽水分別沖洗羊膜和絨毛膜2-3次，去除表面血塊等污物后，將羊膜和絨毛膜分別在培養皿里剪成約Icm2大小。以胎牛血清二甲基亞砜右旋糖酐40為8:1:1的體積比稱量胎牛血清、二甲基亞砜和右旋糖酐40，配制成冷凍保護液，待儲存的人胎盤羊膜和絨毛膜分別浸入到冷凍保護液中，再分裝入凍存管中，擰緊管蓋。將凍存管放入程序降溫儀，先以1°C /min的速率降至-40°C，然后再以5°C /min的速率降溫至-100°C，最后將凍存管轉入液氮中，_196°C長期保存。
2、活性對比按照I中采集標準重新取新鮮胎盤并分離羊膜和絨毛膜，用生理鹽水分別沖洗羊膜和絨毛膜2-3次，去除表面血塊等污物后，將羊膜和絨毛膜分別在培養皿里剪成約Icm2大小置于離心管中，加入0. 2%的II型膠原酶，37°C水浴消化40min。往離心管加入生理鹽水，300目篩網過濾；濾液300G離心5min，洗滌2_3次。然后完全培養基重懸細胞，接種到培養瓶中，于37°C、5%C02培養。大約12-24小時后，觀察細胞貼壁即可進行第一次換液，此后每隔3天換液，待細胞生長至融合后即獲得干細胞，檢測干細胞活性達到90%以上。將I中凍存的羊膜和絨毛膜取出，立即投入到37°C水浴鍋中，并迅速晃動，待凍存液溶解后立即取出凍存管。凍存管表面消毒后，在超凈工作臺內打開，將羊膜和絨毛膜懸液轉移入離心管中，加入預冷生理鹽水，300G離心5min，洗滌2_3次。之后按照前述新采集胎盤的羊膜和絨毛膜制備干細胞的方法，制備復蘇后羊膜干細胞和絨毛膜干細胞，檢測干細胞活性同樣達到90%以上。結果表明，凍存后的羊膜和絨毛膜干細胞幾乎沒有受到冷凍損傷，與新制備的羊膜和絨毛膜干細胞無差別，細胞活性均在90%以上，且兩者細胞生長至融合所用時間也相同。實施例2 :利用本發明所述方法凍存人胎盤羊膜和絨毛膜I、凍存方法選取肝炎、梅毒、艾滋病等傳染病檢測陰性且無產科并發癥的胎盤，術前經得產婦知情同意并簽署知情同意書。術前準備無菌聚苯乙烯儲液瓶作為運送瓶，內裝市售細胞培養液，采集后4°C條件下12小時內送到凍存處。無菌環境下，用有齒鑷輕輕的分離開羊膜和絨毛膜，手術剪剪取羊膜和絨毛膜。用生理鹽水分別沖洗羊膜和絨毛膜2-3次，去除表面血塊等污物后，將羊膜和絨毛膜分別在培養皿里剪成約Icm2大小。以胎牛血清二甲基亞砜右旋糖酐40為7:1:1的體積比稱量胎牛血清、二甲基亞砜和右旋糖酐40，配制成冷凍保護液，待儲存的人胎盤羊膜和絨毛膜分別浸入到冷凍保護液中，再分裝入凍存管中，擰緊管蓋。將凍存管放入程序降溫儀，先以1°C /min的速率降至-40°C，然后再以5°C /min的速率降溫至-100°C，最后將凍存管轉入液氮中，_196°C長期保存。2、活性對比按照I中采集標準重新取新鮮胎盤并分離羊膜和絨毛膜，用生理鹽水分別沖洗羊膜和絨毛膜2-3次，去除表面血塊等污物后，將羊膜和絨毛膜分別在培養皿里剪成約Icm2大小置于離心管中，加入0. 2%的II型膠原酶，37°C水浴消化40min。往離心管加入生理鹽水，300目篩網過濾；濾液300G離心5min，洗滌2_3次。然后完全培養基重懸細胞，接種到培養瓶中，于37°C、5%C02培養。大約12-24小時后，觀察細胞貼壁即可進行第一次換液，此后每隔3天換液，待細胞生長至融合后即獲得干細胞，檢測干細胞活性達到90%以上。將I中凍存的羊膜和絨毛膜取出，立即投入到37°C水浴鍋中，并迅速晃動，待凍存液溶解后立即取出凍存管。凍存管表面消毒后，在超凈工作臺內打開，將羊膜和絨毛膜懸液轉移入離心管中，加入預冷生理鹽水，300G離心5min，洗滌2_3次。之后按照前述新采集胎盤的羊膜和絨毛膜制備干細胞的方法，制備復蘇后羊膜干細胞和絨毛膜干細胞，檢測干細胞活性同樣達到90%以上。
結果表明，凍存后的羊膜和絨毛膜干細胞幾乎沒有受到冷凍損傷，與新制備的羊膜和絨毛膜干細胞無差別，細胞活性均在90%以上，且兩者細胞生長至融合所用時間也相同。實施例3 :利用本發明所述方法凍存人胎盤羊膜和絨毛膜I、凍存方法選取肝炎、梅毒、艾滋病等傳染病檢測陰性且無產科并發癥的胎盤，術前經得產婦知情同意并簽署知情同意書。術前準備無菌聚苯乙烯儲液瓶作為運送瓶，內裝市售細胞培養液，采集后4°C條件下12小時內送到凍存處。無菌環境下，用有齒鑷輕輕的分離開羊膜和絨毛膜，手術剪剪取羊膜和絨毛膜。用生理鹽水分別沖洗羊膜和絨毛膜2-3次，去除表面血塊等污物后，將羊膜和絨毛膜分別在培養皿里剪成約Icm2大小。以胎牛血清二甲基亞砜右旋糖酐40為9:1:1的體積比稱量胎牛血清、二甲基亞砜和右旋糖酐40，配制成冷凍保護液，待儲存的人胎盤羊膜和絨毛膜分別浸入到冷凍保護液中，再分裝入凍存管中，擰緊管蓋。將凍存管放入程序降溫儀，先以1°C /min的速率降至-40°C，然后再以5°C /min的速率降溫至-100°C，最后將凍存管轉入液氮中，_196°C長期保存。2、活性對比按照I中采集標準重新取新鮮胎盤并分離羊膜和絨毛膜，用生理鹽水分別沖洗羊膜和絨毛膜2-3次，去除表面血塊等污物后，將羊膜和絨毛膜分別在培養皿里剪成約Icm2大小置于離心管中，加入0. 2%的II型膠原酶，37°C水浴消化40min。往離心管加入生理鹽水，300目篩網過濾；濾液300G離心5min，洗滌2_3次。然后完全培養基重懸細胞，接種到培養瓶中，于37°C、5%C02培養。大約12-24小時后，觀察細胞貼壁即可進行第一次換液，此后每隔3天換液，待細胞生長至融合后即獲得干細胞，檢測干細胞活性達到90%以上。將I中凍存的羊膜和絨毛膜取出，立即投入到37°C水浴鍋中，并迅速晃動，待凍存液溶解后立即取出凍存管。凍存管表面消毒后，在超凈工作臺內打開，將羊膜和絨毛膜懸液轉移入離心管中，加入預冷生理鹽水，300G離心5min，洗滌2_3次。之后按照前述新采集胎盤的羊膜和絨毛膜制備干細胞的方法，制備復蘇后羊膜干細胞和絨毛膜干細胞，檢測干細胞活性同樣達到90%以上。結果表明，凍存后的羊膜和絨毛膜干細胞幾乎沒有受到冷凍損傷，與新制備的羊膜和絨毛膜干細胞無差別，細胞活性均在90%以上，且兩者細胞生長至融合所用時間也相同。以上實施例的說明只是用于幫助理解本發明的方法及其核心思想。應當指出，對于本技術領域的普通技術人員來說，在不脫離本發明原理的前提下，還可以對本發明進行若干改進和修飾，這些改進和修飾也落入本發明權利 要求的保護范圍內。
權利要求
1.一種冷凍保護液，其特征在于，由胎牛血清、二甲基亞砜和右旋糖酐40組成，所述胎牛血清、二甲基亞砜和右旋糖酐40的體積比為7-9:1: I。
2.根據權利要求I所述冷凍保護液，其特征在于，所述胎牛血清、二甲基亞砜和右旋糖酐 40的體積比為8:1 I。
3.權利要求I所述冷凍保護液在低溫冷凍保存人胎盤羊膜和絨毛膜中的應用。
4.一種冷凍保存人胎盤羊膜和絨毛膜的方法，其特征在于，以胎牛血清二甲基亞砜右旋糖酐40為7-9:1:1的體積比稱量胎牛血清、二甲基亞砜和右旋糖酐40，配制成冷凍保護液，待儲存的人胎盤羊膜和絨毛膜分別浸入到冷凍保護液中，然后降溫至_100°C，最后轉移至液氮中保存。
5.根據權利要求4所述方法，其特征在于，所述胎牛血清、二甲基亞砜和右旋糖酐40的體積比為8:1:1。
6.根據權利要求4所述方法，其特征在于，所述降溫具體為 先以1°C /min的速率降至_40°C，然后再以5°C /min的速率降溫。
全文摘要
本發明涉及組織工程技術領域，公開了一種冷凍保護液以及冷凍保存人胎盤羊膜和絨毛膜的方法。本發明所述由胎牛血清、二甲基亞砜和右旋糖酐40組成，所述胎牛血清、二甲基亞砜和右旋糖酐40的體積比為7-9:1∶1。本發明在深入研究人胎盤羊膜和絨毛膜結構性的基礎上，選擇適合于保護人胎盤羊膜干細胞和絨毛膜干細胞的二甲基亞砜、右旋糖酐40和胎牛血清組成保護液，三者協同保護細胞的活性，防止細胞形成冰晶受到損傷，確保了復蘇后的干細胞活性與新制備的羊膜和絨毛膜干細胞活性無差別。
文檔編號A01N1/02GK102763642SQ20121028870
公開日2012年11月7日 申請日期2012年8月14日 優先權日2012年8月14日
發明者呂康濤, 李春波, 江鶴, 燕舞 申請人:鄭州賽英科干細胞技術有限公司