專利名稱：在后代中固定農作物雜交種的雜種優勢的方法
在后代中固定農作物雜交種的雜種優勢的方法
技術領域：
本發明涉及農業領域，特別涉及選擇方法。
依靠無性繁殖的方式固定宿根稻雜種優勢的方法是已知的(例如，參見F.Hu， P. Xu, J.Li, J. Zhou, E.Sacks, Z.Li, D. Tao, “Rice heterosis fixing by means of vegetative propagation from Oryza longistaminata”//摘要，第四屆國際雜交水稻研討會，2002年，第95頁)，該方法包括轉移稻的野生親緣物種中與根形成相關的基因(例如,來自長雄蕊野生稻(orisa Iongistominata),其中這些基因位于第三和第四染色體,分別與基因座CSR16和RMl 19相關聯)。
一種固定雜種優勢效果的方法是已知的(例如，參見Bennett J. , Xuezhi Bi， Kathiresan, Chaudhury A., Ivahova A. , Payne T., Dennis L.和 Khush G, “Molecular tools for achieving synthetic apomixes for hybrid rice，，//摘要，第四屆國際雜交水稻研討會，2002年，第12頁)，其中該方法包括通過轉移來自其他物種，包括玉米、高粱和小麥等稻的親緣物種的單性生殖相關基因使雜交種轉變為單性生殖。
已知另一種固定雜種優勢效果的方法(例如,參見V. Krishnasamy, 2002),其中該方法包括產生雜交種的人工種子。此處人工種子是指體細胞胚的使用，其中生長調節劑、營養物質和抗生素的混合物作為該胚的胚乳。
上述方法的不足之處在于，為了固定雜種優勢效果，它們提倡完整保留初代雜交種的基因復合體，包括在后代有性生殖的情況下導致生殖隔離(segregation)的致死和半致死基因。這些方法的主要目的均在于將雜交種轉變為無性繁殖或者單性生殖；此外，上述方法均未被實施。
已知一種在后代中固定雜交種的雜種優勢的方法，該方法可被考慮為本發明的原型，其詳述于專利2453253，A01K67/00, A01K67/04, 2000年7月27日公開，公告第21期 (第2部分)，該方法包括產生純合的樣本，用完全純合的樣本進行回交(于植物而言，即用花藥培養獲得的雙單倍體進行回交)以除去雜種優勢的雜交種基因型中的致死或半致死基因。
該方法的缺點是，歸因于雙單倍體樣本與初代樣本(即，其花粉被用于繁育雙單倍體植物種群的雜種優勢的雜交種植株)之間5-6代回交的復雜性。為了回交，必須要在多個正常生命周期內保持雜交種的生存能力；例如，水稻的生長期是3到5個月，然后植株死亡。為了消除致死和半致死基因并保留帶來雜種優勢的補償性基因復合體(CGC)，必須產生雙單倍體樣本與其花粉被用于繁育雙單倍體的雜種優勢的雜交種初代植株之間的雜交種。 產生雙單倍體的過程需要許多時間，約7個月；初代植株的生長周期已經完成，且植株非常衰弱。雙單倍體在衰弱的親本植株上進行的雜交導致非常低的結種率(seed set)和雜交種子的生存能力，并且這一流程還將重復5-6次。
本發明的目的在于提高保留雜交種中的補償性基因復合體(CGC)并且從雜種基因型中消除在后代中導致減產的半致死、致死基因以及無效基因這一過程的效率。
技術效果在于，以雜種優勢的雜交種為基礎，產生具有類似產率的高生產力品種。
當使用該方法時，上述技術效果通過在后代中固定雜交種的雜種優勢的方法來實現，該方法包括通過花藥培養產生純合的植株以消除雜種優勢的雜交種基因型中的致死和半致死基因，根據本發明，在不同基因型的雙單倍體品系之間進行雜交以恢復雜交種的 CGC，其中雜交過程僅涉及最具生產力的雙單倍體品系，且雙單倍體品系之間的差異根據一系列的形態學、生理學、和生化性質、分子標記物(SSR，SNP等)、遺傳體系對樣本生產力的貢獻等方式，以及所有提到的方式的細合來進行評估。
賦予初代雜交種高生產力的最佳基因和因此不同樣本之間雙單倍體的交換和產生過程中分布的CGC的恢復，被作為不同雙單倍體品系之間(而非與初代雜交株之間)的雜交結果而聯合起來。這就使得育種過程避開了(在其多個正常生命周期中)維持初代雜交種的植物生存能力這一長期、非常艱難的過程，并避免了涉及其后代繁殖的問題。
雜交過程中僅使用具有最高生產力的雙單倍體品系，這允許了在培養基的培養階段能淘汰保有或獲得致死、半致死和亞致死基因的樣本，并因此提供了對初代雜交種基因型更為有效的清理。
不同雙單倍體品系的選擇能夠使攜帶不同雜種優勢基因(CGC)的樣本得以展現， 并因此加速了在所產生的基因型中的所述基因的聚集過程。
不同雙單倍體品系雜交所獲得的不同的高生產力樣本之間的雜交，進一步減少了 CGC聚集過程的時間。不同雙單倍體品系的兩次雜交幾乎節省了初代雜種優勢雜交種的 CGC聚集所需時間的一半，這使得在育種過程的最初就能生成高生產力的品種。
涉及對專利、科技信息來源的檢索，以及包括與本發明近似技術方案相關的數據在內的資源的新發現的現有技術分析可以得出結論未發現具有與本發明技術方案所有必要技術特征相同的技術特征的近似技術方案。在所檢索到的近似技術方案中，根據必要技術特征組合，將所述原型鑒定為最近似技術方案允許確定在所要求的方法中的區別技術特征的組合，其是本發明技術方案能產生其所述技術效果的本質所在。
因此，本發明請求保護的技術方案符合“新穎性”的條件。
為了評估請求保護的本發明是否符合“創造性”條件，針對其不同于最接近的現有技術的特征，進一步檢索了披露類似特征的已知方法和技術方案。評估結果顯示，本領域提術人員按照現有科技和工程水平無法顯而易見地獲得要求的發明，特別的，更求的發明不提供已知的轉換。
因此，依據法律規定，本發明技術方案符合“創造性”的條件。
本發明技術方案的實質如下所示。
根據所要求的方法，從雜種優勢的雜交種的花粉獲得多個雙單倍體品系的種群 (圖I)以固定雜種優勢。評估這些雙單倍體品系的生產能力和生存能力，選擇具有最高生產能力的雙單倍體品系用于進一步工作。所選的高生產能力雙單倍體品系之間的基因型差異根據一系列形態學、生理學、生化性質、分子標記物、遺傳體系對樣本生產能力的貢獻等不同方法，以及所有這些方法之間的組合來進行評估，以展現攜帶初代CGC的不同基因的品系。不同的雙單倍體品系被用于雜交以恢復CGC，因為當繁育雙單倍體時，決定雜種優勢雜交種高產能力的基因分散于不同的樣本中。雙單倍體由所獲雜交種的花粉通過花藥培養產生。雙單倍體的生產能力和生存能力均進行評估，最具生產能力的雙單倍體品系被選出用于進一步工作，對它們的生產能力也進行評估。這些步驟使得育種最初即能獲得高生產力品種。如果最初沒能在單一基因型中聯合足夠數量的CGC基因而使獲得的品系未4顯示出初代雜交株的產量，即進行下一步通過各種不同雙單倍體樣品雜交后的品系的雜交。再次由作為結果的雜交種的花粉衍生雙單倍體品系。最具生產能力的品系被從中選出和繁殖，對獲得的品種的生產能力進行。最好的品種送入新品種國家評測中心(the State Testing of New Varieties)。
圖I :在后代中固定雜交種的雜種優勢的方法
在花藥培養中選擇性基因清除的可能性被示范于生物和分子水平。使用第一代和第二代雜交種、13個雜交組合的親本形式、和通過衍生自第一代雜交種的花粉的花藥培養產生的雙單倍體品系作為此類研究的材料。用初代雜交種與由其花粉產生的雙單倍體回交以在后代中固定雜交優勢。繁育雙單倍體以消除半致死等位基因，其中任何會降低樣本生存能力的無效基因座都在此視為此類等位基因。致死基因向單倍體植株原核的滲透會導致胚胎在發育的某一階段中死亡，只有基因型中含有最少致死基因和最多有利基因的個體才能存活。當使用花藥培養獲得植株時，樣本的存活率不超過O. 5 %，所以，大部分基因型得以排除。含有最少數目致死基因的基因型具有更高的生存概率，這就能使初代雜交種基因型中的致死和半致死基因得以清除，就此留下一組有利基因。
回交在純合和雜合雜件中不含有害基因的樣本產生其基因型在純合條件中同樣不包含半致死基因的后代。該事實加上大量的基因修飾，不但使雜種優勢得以維持，而且在所有回交后代中得以增強。
因此，固定雜種優勢的問題可通過獲得不含致死和半致死基因的雜交種而得以解決。同時，初代雜交種的主要基因型不僅應當維持，而且要進行提升。從第一代開始，回交后代的高生存能力即是最大的關注點，因為這些后代實質上都是自我繁殖的結果，而通常自我繁殖會嚴重降低生存力。高生存力可通過以下事實解釋，即作為簡單的兩性繁殖，回交不會導致純合條件下后代基因型中出現有害基因。同時回交將初代復合體中增強生存能力的部分基因回復到基因型中。獲得了水稻13個雜交組合的回交后代。通過將回交植株與初代雜交種、由該初代雜交種花粉培育獲得的雙單倍體、二代雜交種以及親本形式進行比較來評估回交植株的生產能力。由于這些品種是多系品種(育種者控制形態型決定基因， 然而，品種維持穩定性的多態性和生理過程的高效性)，相同組合、但獲自相同品種不同遺傳品系的雜交的第一代雜交種，其在遺傳上也是不相同的。實施了兩個變化實驗。第一個變化實驗旨在通過用相同雜交組合的植株雜交產生回交后代，其在獲得雙單倍體品系之后進行播種。第二個變化實驗中，用雜交組合的最佳初代植株雜交獲得回交后代，其被選擇用于培育雙單倍體(在雙單倍體培育期間維持其生存能力并生長至開花)。
第一個變化實驗表現出生殖隔離，其符合初代品種是多系品種、且回交后代應當僅通過使用作為花粉供體的植物來產生這一事實。第二個變化實驗未在回交后代中表現出生殖隔離，因此，在花藥培養中清除雜種優勢的雜交種基因型中的無效基因是可行的(表 1_2)。
表IFl和F2種群以及初代雜交種花粉培育出的雙單倍體與初代雜交種回交產生
權利要求
1.一種在后代中固定農作物雜交種的雜種優勢的方法，包括通過使用花藥培養產生純合的樣本，繼而恢復決定初代雜交種雜種優勢的基因復合體，其特征在于，所述基因復合體通過基因型不同的雙單倍體品系之間的雜交來恢復，雙單倍體品系之間的差異根據一系列的形態學、生理學、生化性質、分子標記物(SSR，SNP等)、遺傳體系對樣本生產能力的貢獻、以及所有提到的這些方法的組合來進行評估。
全文摘要
本發明涉及農業領域，特別涉及選擇方法。請求保護的方法能夠以雜種優勢的雜交種為基礎、通過固定雜種優勢產生具有相似產量的高生產力品種，例如水稻品種。用于在后代中固定農作物雜交種的雜種優勢的方法，其中包括通過使用花藥培養產生純合的樣本、繼而恢復決定初代雜交種雜種優勢的基因復合體，該方法是通過基因型不同的雙單倍體品系之間的雜交來實現的，且雙單倍體品系之間的差異是根據一系列的形態學、生理學和生化性質、分子標記物(SSR，SNP等)、遺傳體系對樣本生產能力的貢獻、以及所有提到的這些方法的組合來進行評估的。所公開的方法能更有效地清理初代雜交種的基因型，加速雜種優勢決定基因(CGC)的聚集，避開(在其多個正常生命周期中)維持初代雜交種的植物生存能力這一長期、非常艱難的過程，并避免了與其后代繁殖相關的問題。該方法減少基本一半的初始雜種優勢決定基因復合體聚集所需的時間，并清除降低雜交種生產能力和生存能力的基因。
文檔編號A01H1/02GK102972281SQ201210347650
公開日2013年3月20日 申請日期2012年7月13日 優先權日2011年7月13日
發明者Y·K·貢恰羅娃, E·M·哈里托諾夫 申請人:俄羅斯農業科學院全俄水稻研究所國家科學研究院