對馬鈴薯y病毒屬具有抗性的南瓜屬植物的制作方法

對馬鈴薯y病毒屬具有抗性的南瓜屬植物的制作方法
【專利摘要】本發明涉及一種南瓜屬植物，特別是一種南瓜植物，該植物對馬鈴薯Y病毒屬，如小西葫蘆黃化花葉病毒（ZYMV）、西瓜花葉病毒（WMV）、番木瓜環斑病毒（PRSV）以及摩洛哥西瓜花葉病毒（MWMV）具有廣譜抗性。還提供了通過標記輔助育種來選擇一種具有廣譜馬鈴薯Y病毒屬抗性的南瓜植物的多種方法。
【專利說明】對馬鈴薯Y病毒屬具有抗性的南瓜屬植物
[0001]本發明涉及對馬鈴薯Y病毒屬具有抗性的新穎植物和所述植物的種子。本發明還涉及了制造這些植物和用于產生它們的種子的方法。本發明進一步涉及標記和它們在標記輔助育種中的用途。
[0002]馬鈴薯Y病毒組(它的原型成員稱為馬鈴薯Y病毒(PVY))是當前已識別的34個植物病毒組和家族中最大的(沃德和舒克拉，1991 ;國際病毒學32，269-296 (ffard&Shukla,1991; Intervirology32, 269-296))。這個組包含至少180個確定的和可能的成員(占所有已知的植物病毒的30%)，這些成員在農業、畜牧業、園藝以及觀賞作物中造成重大損失(沃德和舒克拉，1991 ;國際病毒學32，269-296)。
[0003]南瓜栽培中的一個主要問題是出現了損害植物和果實的馬鈴薯Y病毒屬。有至少四種最經常感染南瓜的馬鈴薯Y病毒屬，即小西葫蘆黃化花葉病毒(ZYMV)、西瓜花葉病毒(WMV)、番木瓜環斑病毒(PRSV)、摩洛哥西瓜花葉病毒(MWMV)。南瓜中的馬鈴薯Y病毒屬疾病的癥狀包括花葉病、黃化、細長形葉子、發育遲緩以及果實和種子畸形。
[0004]穩定的馬鈴薯Y病毒屬抗性是南瓜育種者的關鍵驅動因素，因為多種病毒傾向于突變并且戰勝現存的抗性基因。南瓜中迄今已知的唯一的穩定抗性已通過遺傳修飾方法實現。在歐洲，南瓜種植者在這些“抗性”品種中日益看到馬鈴薯Y病毒屬感染。因而，對方便并且經濟上可持續的防止南瓜植物被馬鈴薯Y病毒屬感染的策略的需要未被滿足。
[0005]本發明通過提供對總體上影響南瓜的不同的馬鈴薯Y病毒屬具有穩定并且廣泛的抗性的南瓜植物來解決這個需要。這種抗性是由已通過經典種間雜交和胚挽救引入到南瓜植物中的至少3個隱性遺傳決定子提供。

【發明內容】

`[0006]本發明涉及一種栽培的南瓜屬植物，包含至少一個能夠指導或控制對馬鈴薯Y病毒屬，優選地對MWMV、PRSV、WMV以及ZYMV中的I個或多個的抗性的遺傳決定子。
[0007]在一個實施例中，所述遺傳決定子是從中國南瓜(Cucurbita moschata),優選地從中國南瓜尼日利亞變種(C.moschata var.Nigeria)可獲得的。
[0008]在另一實施例中，根據任何前述實施例的植物包含所述至少一個能夠指導或控制對馬鈴薯Y病毒屬感染的抗性的遺傳決定子。
[0009]在另一實施例中，根據任何前述實施例的植物包含至少兩個能夠指導或控制對馬鈴薯Y病毒屬感染的抗性的遺傳決定子。
[0010]在另一實施例中，根據任何前述實施例的植物包含至少三個能夠指導或控制對馬鈴薯Y病毒屬感染，優選地對ZYMV和MWMV感染的抗性的遺傳決定子。
[0011]在另一實施例中，本發明涉及一種根據任何前述實施例的植物，其中
[0012]這些遺傳決定子中的至少一個與西葫蘆栽培品種(C.p^x) cv.) 268NiW中所存在的相應遺傳決定子互補，該西葫蘆栽培品種268NiW的代表性種子以登錄號NCMB41727保存在NCIMB,所述相應遺傳決定子與標記位點ZN遺傳連鎖,該標記位點與馬鈴薯Y病毒屬抗性性狀，優選地與ZYMV和PRSV抗性性狀共分離，并且可以在PCR中通過用以下寡核苷酸引物對擴增DNA片段將其鑒定:正向引物SEQ ID NO:1 (5’AGGTTTCATGGGCTTTTAATGG3’)和反向引物SEQ ID NO:2 (5’CGTGAGCCTAAAACGGTTAATG3’)，隨后用抗性等位基因特異性探針:FAM-CACTTCCCAGCCCAAAT-MGB-NFQ (SEQ ID NO:7)和 / 或易感等位基因特異性探針:VIC-CACTTTCCAGCCCAAAT-MGB-NFQ (SEQ ID NO:8)進行檢測；和 / 或
[0013]這些遺傳決定子中的至少兩個與西葫蘆栽培品種268NiW中所存在的相應遺傳決定子互補，該西葫蘆栽培品種268NiW的代表性種子以登錄號NCMB41727保存在NCMB，所述相應遺傳決定子與標記位點W2遺傳連鎖，該標記位點與馬鈴薯Y病毒屬抗性性狀，優選地與一種MWMV抗性性狀共分離，并且可以在PCR中通過用以下寡核苷酸引物對擴增 DNA 片段將其鑒定:正向引物 SEQ ID NO: 3 (5’ GGGCAAAGAAGATCTTGTCTAGAAAG3’ )和反向引物SEQ ID NO:4 (5’GTTTTTGTGCAGTGTGCATCTGT3’)，隨后用抗性等位基因特異性探針:FAM-TCATTGCACCCAACATG-MGB-NFQ (SEQ ID NO:9)和 / 或易感等位基因特異性探針:VIC-TCATTGCACTCAACATGG-MGB-NFQ (SEQ ID NO: 10)進行檢測；
[0014]和/ 或正向引物 SEQ ID NO: 5 (5’ TTGTGTTTATATGTATGTGTGCGAG3’)和反向引物SEQ ID NO:6 (5’TTTCTAGATCTCAGTGTAAGAGAACACA3’)，隨后用抗性等位基因特異性探針:FAM-TTTGTTTGCTTGAGCTGG-MGB-NFQ (SEQ ID NO: 11)和 / 或易感等位基因特異性探針:VIC-TTTGTTCGATTGAGCTGG-MGB-NFQ (SEQ ID NO: 12)進行檢測；和 / 或
[0015]這些遺傳決定子中的至少一個與西葫蘆栽培品種268NiW中所存在的相應遺傳決定子互補，該西葫蘆栽培品種268NiW的代表性種子以登錄號NCMB41727保存在NCIMB,所述相應遺傳決定子與標記位點Ni+遺傳連鎖，該標記位點與馬鈴薯Y病毒屬抗性性狀，優選地與一種ZYMV抗性性狀，更優選地與一種ZYMV病毒株Nivir抗性性狀共分離，并且可以在PCR中通過用以下寡核苷酸引物對擴增DNA片段將其鑒定:正向引物SEQ ID NO: 13 (5’ TTGCATGTTCCTTGGATGGGT3’ )和反向引物SEQ ID NO: 14 (5，GGCAACCTCTGTCCAATTTCTTTC3’ )，隨后用抗性等位基因特異性探針:FAM-AGTTGCGACTTTCCA-MGB-NFQ (SEQ ID NO: 15)和 / 或易感等位基因特異性探針:TET-AGTTGCGACTTTTCATT-MGB-`NFQ (SEQ ID NO: 16)進行檢測。
[0016]在另一實施例中，本發明涉及一種根據任何前述實施例的植物，其中
[0017]該遺傳決定子與西葫蘆栽培品種268NiW中所存在的相應遺傳決定子互補，該西葫蘆栽培品種268NiW的代表性種子以登錄號NCMB41727保存在NCMB，所述相應遺傳決定子與標記位點ZN遺傳連鎖，該標記位點與馬鈴薯Y病毒屬抗性性狀，優選地與一種ZYMV和PRSV抗性性狀共分離，并且可以在PCR中通過用以下寡核苷酸引物對擴增DNA片段在西葫蘆栽培品種268NiW基因組中將其鑒定:正向引物SEQ ID N0:1和反向引物SEQ ID N0:2,隨后用SEQ ID N0:7和/或SEQ ID NO:8進行檢測；
[0018]和/或這些遺傳決定子與西胡戶栽培品種268NiW中所存在的相應遺傳決定子互補，該西葫蘆栽培品種268NiW的代表性種子以登錄號NCMB41727保存在NCMB，所述相應遺傳決定子與標記位點Wl和W2遺傳連鎖，該標記位點與馬鈴薯Y病毒屬抗性性狀，優選地與一種MWMV抗性性狀共分離，并且可以在PCR中通過用以下寡核苷酸引物對擴增DNA片段在西葫蘆栽培品種268NiW基因組中將其鑒定:正向引物SEQ ID N0:3和反向引物SEQ IDNO:4，隨后用SEQ ID N0:9和/或SEQ ID NO: 10進行檢測；和/或正向引物SEQ ID NO:5和反向引物SEQ ID N0:6，隨后用SEQ ID NO: 11和/或SEQ ID NO: 12進行檢測；和/或[0019]該遺傳決定子與西葫蘆栽培品種268NiW中所存在的相應遺傳決定子互補，該西葫蘆栽培品種268NiW的代表性種子以登錄號NCMB41727保存在NCMB，所述相應遺傳決定子與標記位點Ni+遺傳連鎖，該標記位點與馬鈴薯Y病毒屬抗性性狀，優選地與一種ZYMV抗性性狀，更優選地與一種ZYMV病毒株Nivir抗性性狀共分離，并且可以在PCR中通過用以下寡核苷酸引物對擴增DNA片段在西葫蘆栽培品種268NiW基因組中將其鑒定:正向引物SEQ ID NO: 13 和反向引物 SEQ ID NO: 14，隨后用 SEQ ID NO: 15 和 / 或 SEQ ID NO: 16 進行檢測。
[0020]在另一實施例中，本發明涉及一種根據任何前述實施例的植物，其中
[0021]該遺傳決定子與標記位點ZN遺傳連鎖，該標記位點與馬鈴薯Y病毒屬抗性性狀，優選地與一種ZYMV和PRSV抗性性狀共分離，并且可以在PCR中通過用以下寡核苷酸引物對擴增DNA片段在所述植物基因組中將其鑒定:正向引物SEQ ID N0:1和反向引物SEQ IDN0:2，隨后用SEQ ID N0:7和/或SEQ ID N0:8進行檢測；和/或
[0022]該遺傳決定子與標記位點Wl和/或W2遺傳連鎖,該標記位點與馬鈴薯Y病毒屬抗性性狀，優選地與一種MWMV抗性性狀共分離，并且可以在PCR中通過用以下寡核苷酸引物對擴增DNA片段在所述植物基因組中將其鑒定:正向引物SEQ ID NO:3和反向引物SEQID NO:4，隨后用 SEQ ID N0:9 和 / 或 SEQ ID NO: 10 進行檢測；
[0023]和/或正向引物SEQ ID N0:5和反向引物SEQ ID N0:6，隨后用SEQ ID NO: 11和/或SEQ ID NO: 12進行檢測；和/或
[0024]該遺傳決定子與標記位點Ni+遺傳連鎖，該標記位點與馬鈴薯Y病毒屬抗性性狀，優選地與一種ZYMV抗性性狀，更優選地與一種ZYMV病毒株Nivir抗性性狀共分離，并且可以在PCR中通過用以下寡核苷酸引物對擴增DNA片段在所述植物基因組中將其鑒定:正向引物 SEQ ID NO: 13 和反向引物 SEQ ID NO: 14，隨后用 SEQ ID N0:15 和 / 或 SEQ ID NO: 16進行檢測。`
[0025]在另一實施例中，本發明涉及一種根據任何前述實施例的植物，其中該(這些)遺傳決定子是隱性遺傳的并且彼此獨立地分離。
[0026]在另一實施例中，本發明涉及一種根據任何前述實施例的植物，其中該植物是南瓜植物。
[0027]本發明還涉及一種根據任何前述實施例的南瓜植物的種子，該種子能夠生長成馬鈴薯Y病毒屬抗性南瓜植物。本發明還涉及所述種子的用途，用于生長成馬鈴薯Y病毒屬抗性南瓜植物。
[0028]本發明還涉及一種用于產生對馬鈴薯Y病毒屬，優選地對MWMV、PRSV, WMV以及ZYMV中的至少一個展現抗性的南瓜植物的方法，包括以下步驟:
[0029]a)選擇一種包含至少一個能夠指導或控制對馬鈴薯Y病毒屬的抗性的遺傳決定子的南瓜植物，其中所述遺傳決定子是從西葫蘆栽培品種268NiW的基因組中可獲得的并且與至少一個標記位點遺傳連鎖，該至少一個標記位點與對馬鈴薯Y病毒屬的抗性共分離，并且可以在PCR中用至少一個以下PCR寡核苷酸引物對將其鑒定:
[0030]1.正向引物SEQ ID NO:1和反向引物SEQ ID NO:2，隨后用SEQ ID N0:7和/或SEQ ID NO:8進行檢測；和/或
[0031]i1.正向引物SEQ ID N0:3和反向引物SEQ ID N0:4，隨后用SEQ ID N0:9和/或SEQ ID NO: 10進行檢測；和/或
[0032]iii. 正向引物 SEQ ID N0:5 和反向引物 SEQ ID N0:6，隨后用 SEQ ID NO: 11 和 /或SEQ ID NO: 12進行檢測；和/或
[0033]iv.正向引物 SEQ ID NO: 13 和反向引物 SEQ ID NO: 14，隨后用 SEQ ID NO: 15 和/或SEQ ID NO: 16進行檢測；和/或
[0034]V.一種正向和反向引物，它能夠鑒定與對馬鈴薯Y病毒屬的抗性共分離的一個標記位點；
[0035]b)使步驟a)的所述植物與易感染馬鈴薯Y病毒屬或對至少一種所述馬鈴薯Y病毒屬展現中等抗性水平的南瓜植物雜交；以及
[0036]c)從所述雜交中選擇一個后代，該后代對馬鈴薯Y病毒屬展現一種抗性表型，并且其中所述抗性表型與步驟a)的所述至少一個標記位點分離。
[0037]本發明還涉及一種用于產生根據任何前述實施例的對馬鈴薯Y病毒屬展現抗性的南瓜植物的方法，包括以下步驟:
[0038]a)選擇一種包含至少一個能夠指導或控制對馬鈴薯Y病毒屬，優選地對ZYMV和MWMV中的至少之一的抗性的遺傳決定子的南瓜植物，其中所述遺傳決定子是從西葫蘆栽培品種268NiW的基因組中可獲得的并且與至少一個標記位點遺傳連鎖，該至少一個標記位點與馬鈴薯Y病毒屬抗性共分離，并且可以在PCR中用包括以下的至少一個PCR寡核苷酸引物對將其鑒定:
[0039]i.如果該標記位點為ZN，則為正向引物SEQ ID NO:1和反向引物SEQ ID NO: 2，隨后用SEQ ID N0:7和/或SEQ ID NO:8進行檢測；或
[0040]ii.正向引物SEQ ID N0:3和反向引物SEQ ID N0:4，隨后用SEQ ID N0:9和/或SEQ ID NO: 10進行檢測；和/或
[0041]iii.如果該標記位點為W2，則為正向引物SEQ ID N0:5和反向引物SEQ ID N0:6,隨后用SEQ ID NO: 11和/或SEQ ID NO: 12進行檢測；和/或
[0042]iv.如果該標記位點為Ni+，則為正向引物SEQ ID NO: 13和反向引物SEQ IDNO: 14，隨后用 SEQ ID NO: 15 和 / 或 SEQ ID NO: 16 進行檢測；
[0043]b)使步驟a)的所述植物與易感染馬鈴薯Y病毒屬或對至少一種所述馬鈴薯Y病毒屬展現中等抗性水平的南瓜植物雜交；以及
[0044]c)從所述雜交中選擇一個后代，該后代對馬鈴薯Y病毒屬展現一種抗性表型，并且其中所述抗性表型與步驟a)的所述至少一個標記位點分離。
[0045]在一個實施例中，本發明涉及一種根據任何前述實施例的方法，其中在步驟a)中選擇的該植物包含至少兩個能夠指導或控制對馬鈴薯Y病毒屬的抗性的遺傳決定子；并且在步驟C)中選擇的該后代對馬鈴薯Y病毒屬，優選地對ZYMV和MWMV展現一種抗性表型，并且其中所述抗性表型與在步驟a)的兩個標記位點分離。
[0046]在另一實施例中，本發明涉及一種根據任何前述實施例的方法，其中在步驟a)中選擇的植物包含至少三個能夠指導或控制對馬鈴薯Y病毒屬，優選地對ZYMV和MWMV的抗性的遺傳決定子；并且在步驟c)中選擇的該后代對馬鈴薯Y病毒屬，優選地對ZYMV和MWMV展現一種抗性表型，并且其中所述抗性表型與步驟a)的三個標記位點分離。
[0047]在另一實施例中，本發明涉及一種根據任何前述實施例的方法，其中步驟a)的供體植物是如在此描述的一種植物。
[0048]在另一實施例中，本發明涉及一種根據任何前述實施例的方法，包括使步驟c)中獲得的該病毒抗性植物與步驟b)的該易感南瓜植物或中等抗性南瓜植物回交的附加步驟。
[0049]本發明還涉及一種用于產生對馬鈴薯Y病毒屬具有抗性的南瓜的雜種種子的方法，包括種植一種雄性不育雌性植物和一種雄性能育植物，其中所述雄性或雌性株系中的至少一個是如在此描述的植物，從而在兩個株系之間實現異花授粉，使該植物生長直到座果，收集這些果實并且獲得這些雜種種子。
[0050]本發明還涉及一種用于獲得馬鈴薯Y病毒屬抗性南瓜植物的方法，包括
[0051]a)通過如在此描述的一種方法來獲得如在此描述一種植物；
[0052]b)使所述植物與一種易感染馬鈴薯Y病毒屬的植物或一種中等抗性南瓜植物雜交；
[0053]c)挽救由步驟b)的該雜交產生的一個胚；
[0054]d)從步驟c)的所述胚再生出一種植物；以及
[0055]e)選擇對馬鈴薯Y病毒屬具有抗性的步驟d)的一種植物。
[0056]本發明還涉及一種用于獲得對馬鈴薯Y病毒屬具有抗性的南瓜果實的方法，包括播種如在此描述的或通過一種如 在此描述的方法獲得的一種植物的種子；和使所述植物生長以便產生果實并且收獲由所述植物產生的該果實。
[0057]本發明還涉及一種能夠指導或控制對馬鈴薯Y病毒屬的抗性的遺傳決定子，其中所述遺傳決定子是從西葫蘆栽培品種268NiW的基因組中可獲得的，并且其中
[0058]該遺傳決定子與西葫蘆栽培品種268NiW中所存在的相應遺傳決定子互補，該西葫蘆栽培品種268NiW的代表性種子以登錄號NCMB41727保存在NCMB，所述相應遺傳決定子與標記位點ZN遺傳連鎖，該標記位點與馬鈴薯Y病毒屬抗性性狀，優選地與一種ZYMV和PRSV抗性性狀共分離，并且可以在PCR中通過用以下寡核苷酸引物對擴增DNA片段將其鑒定:正向引物SEQ ID NO:1和反向引物SEQ ID NO:2，隨后用SEQ ID N0:7和/或SEQ IDNO:8進行檢測；和/或
[0059]該遺傳決定子與西葫蘆栽培品種268NiW中所存在的相應遺傳決定子互補，該西葫蘆栽培品種268NiW的代表性種子以登錄號NCMB41727保存在NCMB，所述相應遺傳決定子與標記位點W2遺傳連鎖，該標記位點與馬鈴薯Y病毒屬抗性性狀，優選地與一種MWMV抗性性狀共分離，并且可以在PCR中通過用以下寡核苷酸引物對擴增DNA片段將其鑒定:正向引物SEQ ID N0:3和反向引物SEQ ID N0:4，隨后用SEQ ID N0:9和/或SEQ ID NO: 10進行檢測；
[0060]和/或正向引物SEQ ID N0:5和反向引物SEQ ID N0:6，隨后用SEQ ID NO: 11和/或SEQ ID NO: 12進行檢測；和/或
[0061]該遺傳決定子與西葫蘆栽培品種268NiW中所存在的相應遺傳決定子互補，該西葫蘆栽培品種268NiW的代表性種子以登錄號NCMB41727保存在NCMB，所述相應遺傳決定子與標記位點Ni+遺傳連鎖，該標記位點與馬鈴薯Y病毒屬抗性性狀，優選地與一種ZYMV抗性性狀，更優選地與一種ZYMV病毒株Nivir抗性性狀共分離，并且可以在PCR中通過用以下寡核苷酸引物對擴增DNA片段將其鑒定:正向引物SEQ ID NO: 13和反向引物SEQ IDNO: 14，隨后用 SEQ ID NO: 15 和 / 或 SEQ ID NO: 16 進行檢測。[0062]本發明還涉及一種鑒定包含至少一個能夠指導或控制對馬鈴薯Y病毒屬，優選地對ZYMV和MWMV中的至少之一的抗性的遺傳決定子的南瓜植物的方法，其中所述遺傳決定子是從西葫蘆栽培品種268NiW的基因組中可獲得的并且與至少一個標記位點遺傳連鎖，該至少一個標記位點與所述馬鈴薯Y病毒屬抗性表型中的至少一種共分離，并且可以在PCR中通過用包括以下的PCR寡核苷酸引物對將其鑒定:
[0063]如果該標記位點為ZN，則為正向引物SEQ ID NO:1和反向引物SEQ ID NO: 2，隨后用SEQ ID N0:7和/或SEQ ID NO:8進行檢測；或
[0064]如果該標記位點為W1，則為正向引物SEQ ID N0:3和反向引物SEQ ID N0:4，隨后用SEQ ID N0:9和/或SEQ ID NO: 10進行檢測；和/或
[0065]如果該標記位點為W2，則為正向引物SEQ ID N0:5和反向引物SEQ ID N0:6，隨后用SEQ ID NO: 11和/或SEQ ID NO: 12進行檢測；或
[0066]如果該標記位點為Ni+，則為正向引物SEQ ID NO: 13和反向引物SEQ ID NO: 14,隨后用SEQ ID NO: 15和/或SEQ ID NO: 16進行檢測。
[0067]本發明還涉及了得自一種如在此描述的南瓜植物的馬鈴薯Y病毒屬抗性繁殖材料的用途，用于生長成一種馬鈴薯Y病毒屬抗性南瓜植物以便產生果實并且收獲所述果實。
[0068]定義
[0069]如在此所使用，短語“建立的育種群體”是指在育種計劃，例如商業育種計劃中產生的和/或用作親本的潛在育種配偶體的集合。建立的育種群體的成員典型地在基因和/或表型方面得到充分表征。例如，可能已經評估感興趣的若干表型性狀，例如在不同的環境條件下、在多個位置和/或在不同的時間。作為替代方案或另外，可能已經鑒定一個或多個與表型性狀的表達相關的基因位點，并且可能已經就該一個或多個基因位點方面以及就與該一個或多個基因位點相關的一個或多個基因標記方面對育種群體的一個或多個成員進行基因型分析。
[0070]栽培的西葫蘆植物在本發明的范圍內被理解為是指不再是呈天然狀態，而是已經通過人類的照料進行發育和馴化并且供農業使用和/或人類消費的植物。作為實例，根據本發明的西葫蘆植物將被認為是一種栽培的植物，并且可以選自下組，該組包括寶石南瓜、夏南瓜、冬南瓜、小西葫蘆、黃色曲頸南瓜、黃色夏南瓜、西葫蘆、扇形南瓜、直頸南瓜以及菜瓜。在本發明的上下文中，“栽培的西葫蘆植物”適于栽培并且展現疾病抗性，特別是中等抗性，如小西葫蘆黃化花葉病毒(ZYMV)中等抗性。栽培的南瓜屬植物應進一步被理解為不包括那些包含了本發明主題的性狀作為天然性狀和/或其天然遺傳學的一部分的野生型物種。
[0071]為了避免疑義，中國南瓜尼日利亞變種是抗性的“野生來源”并且不應被認為是一種栽培的植物。
[0072]如在此所使用，短語“二倍體個體”是指具有兩組染色體的個體，典型地，一組來自它的兩個親本中的每一個。然而，應理解在一些實施例中，二倍體個體可以從相同的單一生物體接收它的“母本”和“父本”組的染色體，如當植物自體授粉以產生植物的繼代時。
[0073]“純合的”在本發明的范圍內應理解為是指在同源染色體上的一個或多個相應位點處的相同的等位基因。
[0074]“雜合的”在本發明的范圍內應理解為是指在同源染色體上的一個或多個相應位點處的不同的等位基因。
[0075]“回交”在本發明的范圍內應理解為是指使雜種后代與親本之一重復往回雜交的方法。不同的輪回親本可以被用在隨后的回交中。
[0076]“位點”在本發明的范圍內應理解為是指染色體上包含基因或對性狀有貢獻的任何其他基因成分或要素的一個區域。
[0077]如在此所使用，“標記位點”是指染色體上包含了存在于個體的基因組中并且與一個或多個感興趣的位點相關的核苷酸或多核苷酸序列的一個區域，該區域可能包含基因或對性狀有貢獻的任何其他基因成分或要素。“標記位點”還指染色體上包含與基因組序列互補的多核苷酸序列(如用作探針的核酸的序列)的一個區域。
[0078]“遺傳連鎖”在本發明的范圍內應理解為是指由于基因在同一染色體上的位置鄰近而引起的遺傳特征關聯性，通過位點之間的重組百分比來量度(厘摩，CM)。
[0079]位點之間的距離通常由同一染色體上的位點之間的交換頻率來量度。兩個位點相隔越遠，它們之間就越可能發生交換。反之，如果兩個位點緊密地靠在一起，則它們之間不太可能發生交換。按照慣例，一厘摩(CM)等于位點(標記)之間的1%重組。當QTL可以通過多個標記指示時，端點標記之間的基因距離指示QTL的大小。
[0080]短語“與標記位點遺傳連鎖”將被認為是意指標記位點與提供抗性性狀的遺傳決定子相距不超過10cM，更優選地5cM，更優選地2cM，最優選地lcM。
[0081]“指導或控制表達的遺傳決定子”在此應理解為是指能夠在DNA自身的水平上、在最終多肽產物的翻譯、轉錄和/或活`化的水平上對性狀的表達有貢獻，從而引起該性狀的表型表達的可遺傳的基因成分。
[0082]出于本發明的目的，術語“共分離”是指以下事實:針對性狀的等位基因和針對標記的等位基因傾向于一起傳遞，這是因為它們在同一染色體上物理地緊靠在一起(它們之間的重組由于它們物理的鄰近而減少)，導致它們的等位基因由于它們在同一染色體上的鄰近而非隨機關聯。“共分離”還指單一植物內存在兩種或更多種性狀，已知其中至少一種是遺傳的并且這些性狀不能輕易地用偶然性解釋。
[0083]如在此所使用，術語“質量性狀位點處的基因結構”是指在統計上與感興趣的表型性狀有關并且代表著感興趣的表型性狀的遺傳基礎的基因組區域。
[0084]如在此所使用，短語“有性雜交的”和“有性生殖”在本發明披露的主題的上下文中是指配子融合以產生后代(例如，通過受精，如在植物中通過授粉產生種子)。“有性雜交”或“異體受精”在一些實施例中是一個個體被另一個體受精(例如，植物中的異花授粉)。術語“自體受精”在一些實施例中是指通過自體受精或自體授粉來產生種子；即，花粉和胚珠是來自同一植物。
[0085]如在此所使用，短語“基因標記”是指個體的基因組中與一個或多個感興趣的位點相關的特征(例如，存在于個體的基因組中的核苷酸或多核苷酸序列)。在一些實施例中，基因標記在感興趣的群體中是多態性的，或位點被多態性占據，取決于上下文。基因標記包括例如單一核苷酸多態性(SNP)、插入或缺失(即，插入/缺失)、簡單序列重復(SSR)、限制片段長度多態性(RFLP)、隨機擴增多態性DNA (RAPD)、裂解擴增多態性序列(CAPS)標記、多樣性陣列技術(DArT)標記以及擴增片段長度多態性(AFLP)以及許多其他實例。基因標記可以例如用于對包含染色體上對表型性狀的可變性有貢獻的等位基因進行定位的基因位點。短語“基因標記”還可以指與基因組序列互補的多核苷酸序列，如用作探針的核酸的序列。
[0086]短語“與西葫蘆栽培品種268NiW中所存在的相應基因組決定子互補”將被認為是意指在染色體DNA的一個區域上發現的一個基因(或它的啟動子區)，所述區域的長度是0.5MB、1MB、2MB、3MB、4MB、5MB或10MB，該基因與在西葫蘆栽培品種268NiW染色體DNA的相應區域上發現的相同基因(或它的啟動子區)一致。
[0087]基因標記可以物理地定位于染色體上在與它關聯的基因位點內部或外部(B卩，對應地是基因內的或基因外的)的一個位置。換句話說，盡管在相應于感興趣的位點的基因或功能突變在染色體上的位置(例如，在基因外部的控制元件內)還沒有被鑒定并且基因標記與感興趣的位點之間存在非零重組率時典型地使用多個基因標記，但本發明披露的主題還可以使用物理地處于基因位點的邊界內的基因標記(例如，在相應于基因的基因組序列內部，如但不限于基因的內含子或外顯子內的多態性)。在本發明披露的主題的一些實施例中，該一個或多個基因標記包含在一個與十個之間的標記，并且在一些實施例中，該一個或多個基因標記包括多于十個基因標記。
[0088]如在此所使用，術語“基因型”是指細胞或生物體的基因組成。個體的“一組基因標記的基因型”包括個體的單倍型中存在的一個或多個基因標記位點的具體等位基因。如本領域中已知，基因型可以涉及單一位點或多個位點，無論這些位點是相關還是非相關的，和/或是連鎖還是非連鎖的。在一些實施例中，個體的基因型涉及一個或多個相關的基因，因為這些基因中的一個或多個參與感興趣的表型(例如，如在此定義的數量或質量性狀)的表達。因而，在一些實施例中，基因型包括個體內在數量或質量性狀的一個或多個基因位點處存在的一個或多個等位基因的匯總。在一些實施例中，基因型從單倍型(定義于下文中)方面來表達。
[0089]如在此所使用，術 語“種質”是指一個群體或其他個體組(例如，一個物種)的基因型的總體。術語“種質”還可以指植物材料；例如，一組充當不同的等位基因的貯藏處的植物。短語“改適過的種質”是指例如對于給定的環境或地區具有經過證明的遺傳優越性的植物材料，而短語“未改適過的種質”、“原始種質”以及“外來種質”是指例如對于給定的環境或地區具有未知的或未經證明的遺傳價值的植物材料；因而，短語“未改適過的種質”在一些實施例中是指不是建立的育種群體的一部分并且與建立的育種群體的成員不具有已知的關系的植物材料。
[0090]如在此所使用，術語“雜種”、“雜種植物”以及“雜種后代”是指由在遺傳不同的親本產生的個體(例如，遺傳上雜合的或主要是雜合的個體)。
[0091]如在此所使用，短語“單次雜交Fl雜種”是指由兩個近交系之間的雜交產生的Fl雜種。
[0092]如在此所使用，短語“近交系”是指遺傳上純合的或近乎純合的群體。例如，近交系可以通過若干循環的兄弟/姐妹育種或自體受精或雙單倍體產生來獲得。在一些實施例中，近交系針對一個或多個感興趣的表型性狀進行純育。“近交”、“近交個體”或“近交后代”是來自一個近交系的單獨的樣品。
[0093]如在此所使用，術語“雙單倍體株系”是指由花藥栽培得出的穩定的近交系。在特殊介質和環境中栽培的一些花粉粒(單倍體)可以發育成含有η個染色體的小植株。然后使這些小植株“加倍”并且包含2η個染色體。這些小植株的后代稱為“雙單倍體”并且基本上不再分離(穩定的)。
[0094]如在此所使用，術語“連鎖”和它的語法變體是指同一染色體上不同的位點處的等位基因在它們的傳遞是單獨的情況下傾向于比偶然所預期的更經常地分離的。
[0095]如在此所使用，短語“核酸”是指可能相應于核苷酸串的任何物理單體單元串，包括核苷酸的聚合物(例如，典型的DNA、cDNA或RNA聚合物)、修飾過的寡核苷酸(例如，包括對于生物RNA或DNA不典型的堿基的寡核苷酸，如2’ -O-甲基化寡核苷酸)等等。在一些實施例中，核酸可以是單股、雙股、多股或它們的組合。除非另外指示，否則本發明披露的主題的具體核酸序列任選地包括或編碼除了明確指示的任何序列以外的互補序列。
[0096]如在此所使用，短語“表型性狀”是指個體中由個體的基因組、蛋白質組和/或代謝組與環境的相互作用產生的外觀或其他可檢測的特征。
[0097]如在此所使用，短語“抗性”是指當與易感植物比較時在類似的環境條件和病原體壓力下植物能夠限制指定病原體的生長和發展和/或它們所引起的損傷。抗性植物在病原體壓力,例如ZYMV病原體壓力下可能展現一些疾病癥狀或損傷。
[0098]如在此所使用，短語“易感性”是指植物不能夠充分地限制指定病原體，例如馬鈴薯Y病毒屬病原體，如ZYMV的生長和發展。
[0099]抗性植物在以下實例中定義的測試條件下將顯示無或極少的壞死以及無或極稀少的孢子形成。
[0100]如在此所使用，術語“多個”是指多于一個。因而，“多個個體”是指至少兩個個體。在一些實施例中，術語多數是指 多于整體的一半。例如，在一些實施例中，“群體中的多數”是指多于那個群體的成員的一半。
[0101]如在此所使用，術語“后代”是指具體雜交的一個或多個子代。典型地，后代由兩個個體的育種產生，但一些物種(特別是一些植物和雌雄同體的動物)可以自體受精(即，同一個植物充當雄性和雌性配子兩者的供體)。這一個或多個后代可以是例如F1、F2或任何繼代。
[0102]如在此所使用，短語“質量性狀”是指受一個或幾個展現大多數表型作用的基因控制的表型性狀。因此，質量性狀典型地被簡單地遺傳。在植物中的實例包括但不限于花的顏色、果實的顏色和若干已知的疾病抗性。
[0103]“基于標記的選擇”在本發明的范圍內應理解為是指例如使用基因標記從植物中檢測一個或多個核酸，其中該核酸與所希望的性狀遺傳連鎖，以鑒定出攜帶令人希望的(或不希望的)性狀的基因的植物，使得在選擇性育種計劃中可以使用(或避免)那些植物。
[0104]“聚合酶鏈反應(PCR)”在本發明的范圍內應理解為是指產生基因組的DNA或一個或多個子集的相對較大量的具體區域，從而進行可能的基于那些區域的不同的分析的方法。
[0105]“PCR引物”在本發明的范圍內應理解為是指DNA的具體區域的PCR擴增中所使用的相對較短的單股DNA片段。
[0106]“表型”在本發明的范圍內應理解為是指遺傳上控制的性狀的可區分的特征。
[0107]如在此所使用，短語“表型性狀”是指個體中由個體的基因組、蛋白質組和/或代謝組與環境的相互作用產生的外觀或其他可檢測的特征。
[0108]“多態性”在本發明的范圍內應理解為是指一個群體中存在兩種或更多種不同形式的基因、基因標記或遺傳性狀或例如通過交替剪接、DNA甲基化等可獲得的基因產物。
[0109]“選擇性育種”在本發明的范圍內應理解為是指使用具有或顯示令人希望的性狀的植物作為親本的育種計劃。
[0110]“測試”植物在本發明的范圍內應理解為是指用于遺傳上表征將被測試的植物中的性狀的植物。典型地，使將被測試的植物與“測試”植物雜交，并且對雜交后代中的性狀的分離比率進行評分。
[0111]如在此所使用的“探針”是指能夠識別并且結合于具體目標分子或細胞結構并且因而允許目標分子或結構的檢測的一組原子或分子。特別地，“探針”是指可以用于通過分子雜交來檢測互補序列的存在并且對其定量的經過標記的DNA或RNA序列。
[0112]如在此所使用的術語“雜交”是指常規的雜交條件，優選地是指以下雜交條件，即:使用5x SSPE、l%SDS、lx Denhardts溶液作為溶液和/或雜交溫度在35°C與70°C之間，優選地65 °C。雜交后，優選地首先用2x SSC、1%SDS并且隨后用0.2x SSC在35 °C到75 °C之間的溫度下、特別地在45°C到65°C之間、但尤其在59°C下進行洗滌(關于SSPE、SSC和Denhardts溶液的定義，參見上述引文中的薩姆布魯克(Sambrook)等人)。如例如以上薩姆布魯克等人中所述的高嚴格度雜交條件是特別優選的。特別優選的嚴格雜交條件例如在如上指示雜交和洗滌在65°C下進行時存在。例如雜交和洗滌在45°C下進行的非嚴格雜交條件是不太優選的并且在35°C下是更不太優選的。
[0113]“序列同源性或序列一致性”在此可互換地使用。在兩個或更多個核酸或蛋白序列的背景下，術語“一致”或“一致性”百分比是指如使用以下序列比較算法之一或通過目測進行測量，當比較和比對最大相應性時，兩個或更多個序列或子序列是相同的或具有指定百分比的相同的氨基酸殘基或核苷酸。如果將彼此進行比較的兩個序列長度不同，則序列一致性優選地涉及與較長序列的核苷酸殘基一致的較短序列的核苷酸殘基的百分t匕。常規地通過使用計算機程序例如Bestfit程序(威斯康星序列分析包，針對Unix操作系統的版本8，遺傳學電腦集團，大學研究園，科學先驅路575號，麥迪遜，WI53711)可以確定序列一致性。Bestfit使用史密斯和華特曼，應用數學進展2 (1981)，482-489(Smith and Waterman, Advances in Applied Mathematics〗(1981)，482-489)的局部同源性算法以便找到兩個序列之間具有最大序列一致性的區段。當使用Bestfit或其他序列比對程序來確定是否一個具體的序列與本發明的一個參照序列具有例如95%—致性時，優選地對參數進行這樣的調整從而在參照序列的整個長度上對一致性的百分比進行計算并且允許該參照序列中同源性缺口占核苷酸總數的高達5%。當使用Bestfit時，優選地將所謂的任選的參數保留在它們預設(“默認”)值。在一個給定的序列和上述本發明的序列之間的比較中出現的偏差可能是由例如加入、缺失、取代、插入或重組引起的。優選地還可以使用程序“fasta20u66” (版本2.0u66，1998年9月，由威廉.R.?皮爾遜(WilliamR.Pearson)和弗吉尼亞大學編寫，還參見W.R.皮爾遜(1990)，酶學方法183，63_9a(ff.R.Pearson (1990), Methods in Enzymologyl83, 63-9a)> 所附的實例以及 http://workbench, sdsc.edu/)進行這樣一種序列比較。對于這個目的，可以使用“缺省”參數設定。兩個核酸序列實質上一致的另一指示是這兩種分子在嚴格條件下彼此雜交。短語“特異性雜交”是指一個分子在嚴格條件下僅與一個特定的核苷酸序列結合、雙鏈化或雜交，這是在該序列存在于一種復合混合物(例如，總細胞)DNA或RNA中時進行的。“實質上結合”是指在一個探針核酸與一個目標核酸之間的互補雜交，并且涵蓋少量錯配，這些錯配可以通過降低該雜交介質的嚴格度來容納，以實現該目標核酸序列的所希望的檢測。
[0114]在核酸雜交實驗(如，南方和北方雜交)的背景下“嚴格雜交條件”和“嚴格雜交洗滌條件”是依賴于序列的，并且在不同的環境參數下是不同的。較長的序列特定地在較高的溫度下雜交。對核酸雜交的廣泛指導見于蒂森(1993)生物化學和分子生物學實驗室技術-使用核酸探針的雜交第2章第I部分“雜交原理和核酸探針檢驗策略綜述”，愛思唯爾，紐約(Ti jssen (1993) Laboratory Techniques in Biochemistry and MolecularBiology-Hybridization with Nucleic Acid Probes part I chapter2 “Overviewof principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probeassays^lsevier, New York)。總體而言,對于在限定的離子強度和pH值下的具體序列，高嚴格雜交和洗滌條件被選擇為比熱熔點低約5°C。典型地，在“嚴格條件”下，探針將會與它的目標子序列進行雜交，但不會與其他序列雜交。
[0115]熱熔點是50%的目標序列與完全匹配的探針雜交時溫度(在限定的離子強度和pH值下)。極嚴格條件被選擇為等于對于具體探針的Tm。對于在南方或北方印跡中在過濾器上具有超過100個互補殘基的互補核酸的雜交的嚴格雜交條件的一個實例是在42°C下，含Img肝素的50%甲酰胺，其中將雜交進行過夜。高度嚴格洗滌條件的一個實例是0.15MNaCl，在72°C下，持續約15分鐘。嚴格洗滌條件的一個實例是在65°C下，0.2x SSC洗滌，持續15分鐘(關于SSC緩沖液的說明，參見薩姆布魯克，以下)。經常，高嚴格度洗滌之前會先進行低嚴格度洗滌，以去除背景探針信號。對例如超過100個核苷酸的雙鏈體進行中等嚴格度洗滌的一個實例是在45°C下，Ix SSC，持續15分鐘。對例如超過100個核苷酸的雙鏈體進行低嚴格度洗滌的一個實例是在40°C下，4-6x SSC，持續15分鐘。對于短探針(例如，大約10到50個核苷酸)，嚴格條件典型地涉及小于約1.0M的Na離子的鹽濃度，典型地約0.01到1.0M的Na離子濃度(或其他鹽類)，在pH7.0到8.3下，并且該溫度典型地是至少約30°C。還可以通過加入去穩定試劑(如甲酰胺)來實現嚴格條件。總體而言，在具體的雜交檢驗中，信噪比是針對非相關的探針所觀測到的2倍(或更高)指示檢測到特異性雜交。如果在嚴格條件下彼此不雜交的核酸所編碼的蛋白是實質上一致的，則它們仍然是實質上一致的。例如，當使用遺傳密碼所允許的最大程度的密碼子簡并而生成一個核酸拷貝時發生這種情況。
[0116]“植物”是在發育的任何階段的任何植物，特別是種子植物。
[0117]“植物細胞”是植物的結構和生理單位，包括原生質體和細胞壁。植物細胞可以呈分離的單一細胞或培養細胞的形式，或作為高等組織化單位(如植物組織、植物器官或整株植物)的一部分。
[0118]“植物細胞培養物”意指植物單元(如例如原生質體，細胞培養物細胞、處于不同的發育階段的植物組織、花粉、花粉管、胚珠、胚囊、接合子以及胚中的細胞)的培養物。
[0119]“植物材料”或“從植物可獲得的植物材料”是指葉、莖、根、花或花的部分、果實、花粉、卵細胞、接合子、種子、切條、細胞或組織培養物、或植物的任何其他部分或產物。
[0120]“植物器官”是植物的一個獨特而明顯的已結構化并且分化的部分，如根、莖、葉、花蕾或胚。
[0121]如在此使用的“植物組織”意指組織化成結構和功能單元的一組植物細胞。包括植物中或培養物中的任何植物組織。這個術語包括但不限于:整株植物、植物器官、植物種子、組織培養物以及被組織化成結構和/或功能單元的任何植物細胞群組。結合如以上列出的任何具體類型的植物組織或由這個定義涵蓋的其他植物組織或在不存在其時使用這個術語并不打算排除任何其他類型的植物組織。
[0122]發明詳細說明
[0123]本發明涉及新穎的南瓜植物，這些南瓜植物對馬鈴薯Y病毒屬感染具有抗性，并且因而避免遭受由這種病原體所致的損害。本發明還涉及制造和使用這些植物的方法。
[0124]根據本發明的植物可以通過雜交兩個或更多個親本基因型來獲得，這些基因型中的至少一個可以具有一個或多個等位基因，特別是對馬鈴薯Y病毒屬抗性有貢獻的相應位點處的一個或多個等位基因，該一個或多個等位基因缺乏其他親本基因型或補充其他基因型以獲得根據本發明和如在此描述的植物。如果多于一個位點對抗性性狀的表達有貢獻并且兩個原始的親本基因型不提供整組等位基因，則育種群體中可以包括其他來源。其他親本基因型可以貢獻令人希望的性狀，包括市場所需求的作物品質。
[0125]親本基因型可以彼此雜交以產生后代種子。親本基因型可以是通過從田間選擇的雜合植物利用不受控制的或開放的授粉進行自體受精并且使用輪回選擇程序發育而成的近交系。使出眾的植物自體受精并且在繼代中加以選擇。在這些繼代中，作為自體授粉和選擇的結果，雜合條件為同質株系提供途徑。利用近交的繼代，植物在后代植物內變得越來越純合和均一。典型地，可以實踐自體受精和譜系選擇的五到七代或更多代(Fl到F2 ；F3到F4 ；F4到F5)以獲得植物和種子特征均一并且在持續自體受精下仍將均一的近交系。
[0126]在近交的過程中，雜合位點處的許多不希望的等位基因將被更有利的等位基因置換，并且從后代中消除不利的或不希望的等位基因。此外，通過基于標記的選擇，可以使有利的等位基因的數目最大化，其中鑒定更不利的等位基因并且相繼用更有利的等位基因置換。
[0127]在一個方面，根據本發明的植物可以通過使來自祖先植物(特別是野生祖先植物)的能夠指導或控制對馬鈴薯Y病毒屬的抗性的遺傳決定子滲入到栽培的南瓜植物(特別是栽培的西葫蘆植物)中來獲得。
[0128]在本發明的一個具體實施例中，可以從中獲得能夠指導或控制對馬鈴薯Y病毒屬的抗性的遺傳決定子的野生祖先是野生中國南瓜，特別是野生中國南瓜尼日利亞變種，或來自包含所述遺傳決定子的其后代或祖先。在替代方案中，根據本發明的馬鈴薯Y病毒屬抗性性狀(該性狀向表達這個性狀的植物提供對馬鈴薯Y病毒屬感染，優選地對MWMV、PRSV, WMV以及ZYMV中的1個或多個的抗性)可以從西葫蘆栽培品種268NiW (它的代表性種子被以登錄號NCMB41727保存在NCMB)，或從西葫蘆栽培品種268NiW的包含能夠指導或控制對馬鈴薯Y病毒屬的抗性的遺傳決定子的后代或祖先獲得。
[0129]因此，在本發明的一個具體實施例中，對馬鈴薯Y病毒屬抗性性狀有貢獻的親本基因型是一種近交系，它具有本發明所保存的西葫蘆栽培品種268NiW的相關特性，即，在與馬鈴薯Y病毒屬抗性相關聯的位點處實質上相同的基因組構造，西葫蘆栽培品種268NiW的種子樣品已經在2010年6月14日以登錄號NCMB41727保存在NCMB。西葫蘆栽培品種268Niff對MWMV、PRSV、WMV以及ZYMV具有抗性。抗性是由遺傳決定子Zn、Ni+、Wl以及W2提供。這些決定子在268NiW中是純合隱性遺傳的。這些決定子在多個基因背景之間是可轉移的。抗性檢驗已證明，這些遺傳決定子在這些不同的背景(例如黃南瓜)中繼續提供針對馬鈴薯Y病毒屬的廣譜抗性。對不同的馬鈴薯Y病毒屬病毒株的抗性水平示于表2中。當用馬鈴薯Y病毒屬攻擊植物時，具有所有4個遺傳決定子的有益作用示于表2和圖10中。
[0130]為確定近交系的實用性和它遺傳上對雜種后代有貢獻的潛能，與另一近交系進行測試雜交，并且對所得后代在表型上進行評估。
[0131]在本發明的另一具體實施例中，對抗性性狀有貢獻的親本基因型是一種雜種，它具有本發明所保存的西葫蘆栽培品種268NiW的相關特性，即，在與馬鈴薯Y病毒屬抗性相關聯的位點處實質上相同的基因組構造，西葫蘆栽培品種268NiW的種子樣品已經在2010年6月14日以登錄號NCMB41727保存在NCMB。
[0132]西葫蘆栽培品種268NiW是由野生中國南瓜尼日利亞變種作為馬鈴薯Y病毒屬抗性性狀的供體與西葫蘆近交系雜交產生的。將這次雜交的馬鈴薯Y病毒屬抗性后代與不同基因背景的其他近交系雜交以最終獲得西葫蘆栽培品種268NiW。
[0133]因此，西葫蘆栽培品種268NiW或包含能夠指導或控制對馬鈴薯Y病毒屬的抗性的遺傳決定子的任何其他植物株系可以被用作源材料，用于使所述抗性性狀滲入到任何所希望的基因背景中以獲得根據本發明對馬鈴薯Y病毒屬感染具有高度抗性的南瓜植物，可以進一步包括一個或多個令人希望的性狀，如市場所需求的作物品質性狀。除了作物品質以外，還有農藝學上重要的特征，如例如良好的植物構造、高產量以及對病原體的基本抗性。
[0134]基于本發明的描述，擁有如在此描述的西葫蘆栽培品種268NiW (它的樣品已經被以登錄號NCMB41727保存在N CMB有限公司)或包含至少一個能夠指導或控制對馬鈴薯Y病毒屬的抗性的遺傳決定子的其后代或祖先的技術人員不難使用本領域中眾所周知的育種技術將本發明的所述至少一個遺傳決定子轉移到不同的類型的其他南瓜植物。本發明的性狀可以例如被轉移到其他南瓜屬。因此，在一個實施例中，本發明的植物是能夠抗馬鈴薯Y病毒屬感染的南瓜植物。在本發明的一個實施例中，使南瓜植物生長以獲得(雜種)種子或用于商業南瓜生產。
[0135]因此，在另一實施例中，本發明披露一種將根據本發明的至少一個能夠指導或控制對馬鈴薯Y病毒屬的抗性的遺傳決定子轉移到缺乏所述性狀的南瓜植物的方法，包括a)獲得包括所述性狀的植物山)使它與缺乏所述性狀的植物雜交；c)獲得步驟b)的雜交的植物；d)選擇根據本發明的能夠抗馬鈴薯Y病毒屬感染的步驟c)的植物。在一個實施例中，該方法進一步包括e)使由步驟d)產生的植物與南瓜植物回交，和f)選擇根據本發明的能夠抗馬鈴薯Y病毒屬感染的南瓜植物。在一個實施例中，該方法進一步包括獲得一種根據本發明能夠抗馬鈴薯Y病毒屬感染的近交南瓜植物，并且在一個實施例中，該方法進一步包括使所述近交南瓜植物與另一南瓜植物雜交以產生一種根據本發明的能夠抗馬鈴薯Y病毒屬感染的雜種南瓜植物。在一個實施例中，如在此描述，南瓜植物是通過確定存在或不存在馬鈴薯Y病毒屬來選擇。在一個實施例中，包括所述性狀的步驟a)的植物是西葫蘆栽培品種268NiW (它的代表性種子被以登錄號NCIMS41727保存在NCMB)或所述植物的后代或祖先。
[0136]還可以使用標記輔助育種來鑒定出包含至少一個能夠指導或控制對馬鈴薯Y病毒屬的抗性和/或側接如在此所描述的標記位點或與其連鎖的標記位點的遺傳決定子的那些個體。
[0137]基于標記的選擇可能已經被用于近交發育的早期階段，經常與很大程度上基于可以在視覺上確定并且涉及與植物用于商業雜種生產的適合性相關的關鍵性能指標的表型特征的篩選方法組合。選擇還可以基于分子標記，這些分子標記可能與或可能不與感興趣的性狀連鎖。
[0138]特別地，基于標記的選擇可以與表型選擇組合或在表型選擇之后應用以鑒定其中之前在此描述的所有本發明相關位點都具有有利的純合基因型的那些個體。
[0139]有若干類型的分子標記可以被用于基于標記的選擇，包括但不限于限制片段長度多態性(RFLP)、多態性DNA的隨機擴增(RAPD)以及擴增的限制片段長度多態性(AFLP)。
[0140]RFLP涉及在具體的短限制部位使用限制酶來切割染色體DNA，由這些部位之間的復制或缺失或這些限制部位處的突變產生多態性。
[0141]RAPD利用低嚴格度聚合酶鏈反應(PCR)擴增與具有任意序列的單一引物來產生匿名DNA片段的病毒株特異性陣列。該方法僅需要很少的DNA樣品并且分析大量的多態性位點。
[0142]AFLP需要在使用PCR和引物中的選擇性核苷酸擴增具體片段之前用限制酶消化細胞DNA。利用這種方法、目測所獲得的片段的技術，可以針對每個引物組合測量多達100個多態性位點，并且每一測試僅需要少量的DNA樣品。
[0143]SSR分析是基于廣 泛分布在真核生物的基因組中的微衛星DNA (短重復)序列，將這些序列選擇性地擴增以檢測簡單序列重復中的變化。SSR分析僅需要很少的DNA樣品。SNP使用可有效地獲得點突變的PCR延伸檢驗。該程序每份樣品需要極少DNA。在典型的基于標記的選擇育種計劃中可以使用上述方法中的一種或兩種。
[0144]實現了跨越植物基因組多態性區的核苷酸片段的擴增的最優選的方法使用聚合酶鏈反應(“PCR”)(穆利斯等人，冷泉港定量生物學討論會51:263-273 (1986) (Mullis etal., Cold Spring Harbor Symp.Quant.Biol.51:263273 (1986))),它使用了包括一個正向引物和一個反向引物的成對引物，這些引物能夠呈其雙股形式與界定了多態性的鄰近序列雜父。
[0145]可以使用替代方法來擴增片段，如“連接酶鏈反應”(“LCR”)(巴拉尼，美國國家科學院院刊 88:189-193 (1991) (Barany, Proc.Natl.Acad.Sc1.(U.SA)88:189193 (1991))，它使用兩對寡核苷酸探針來指數擴增具體目標。每一對寡核苷酸的序列經過選擇以允許這一對與該目標的同一股的鄰接序列雜交。這種雜交形成了模板依賴性連接酶的底物。正如PCR，如此所得產物在隨后的循環中充當模板，并且獲得所希望的序列的指數擴增。
[0146]可以利用具有多態性部位的同一股的近端和遠端序列的寡核苷酸來進行LCR。在一個實施例中，任一寡核苷酸將被設計成包括多態性的實際多態性部位。在這種實施例中，選擇反應條件以使得寡核苷酸僅在目標分子包含或缺乏與寡核苷酸上存在的多態性部位互補的特異性核苷酸的情況下可以被連接在一起。作為替代方案，可以選擇寡核苷酸以使得它們不包括多態性部位(參見賽格(Segev)，PCT申請W090101069)。
[0147]可以作為替代方案使用的另一方法是“寡核苷酸連接檢驗”(“0LA”)(蘭德格倫等人，科學 241:1077-1080 (1988) (Landegren et al.，Science241:10771080 (1988) ))。OLA方案使用了被設計成能夠與目標的單股的鄰接序列雜交的兩個寡核苷酸。如同LCR，OLA特別適合于檢測點突變。然而，不同于LCR，OLA獲得目標序列的“線性”而非指數擴增。
[0148]可以作為替代方案使用的再另一方法是“侵入式檢驗”，它使用結構特異性片狀核酸內切酶(FEN)來裂解由等位基因特異性重疊寡核苷酸與包含單一核苷酸多態性(SNP)部位的目標DNA雜交而形成的三維復合物。使與目標分子中的SNP等位基因互補的寡核苷酸退火通過熱穩定性FEN裂解而觸發寡核苷酸的裂解。裂解可以通過若干不同的方法來檢測。最常見的是，裂解產物在熒光共振能量轉移(FRET)盒上觸發二次裂解反應以釋放熒光信號。作為替代方案，裂解可以通過使用熒光偏振(FP)探針或通過質譜分析直接地檢測。裂解反應具有高度特異性，具有低失敗率，并且可以檢測10-21摩爾量的目標DNA。盡管該檢驗在傳統上已被用于每次反應查詢一份樣品中的一個SNP，但經過測試，新穎的基于芯片或基于珠粒的途徑已使其成為一種適于多路高通量SNP基因型分析的有效而精確的檢驗。
[0149]尼克森(Nickerson)等人已經描述了一種核酸檢測檢驗,它組合了 PCR和OLA的屬性(尼克森等人，美國國家科學院院刊87:8923-8927 (1990))。在這種方法中，PCR被用于實現目標DNA的指數擴增，然后使用OLA檢測。
[0150]基于在具有所得“二寡核苷酸”的序列的核酸的存在下連接兩個(或更多個)寡核苷酸，從而擴增該二寡核苷酸的方案也是已知的(吳等人，基因組4:560569 (1989) (Wu etal.，Genomics4:560569 (1989)))，并且可以針對本發明的目的被容易地改適。
[0151 ] 在一個實施例中，分子標記是通過PCR擴增的一個DNA片段，例如SSR標記或RAPD標記。在一個實施例中，經過擴增的DNA片段的存在或不存在表明性狀自身或該性狀的特定等位基因的存在或不存在。在一個實施例中，經過擴增的DNA片段的長度差異表明性狀的特定等位基因的存在，并且因而使得能夠區分性狀的不同等位基因。
[0152]在本發明的一個具體實施例中，`SNP標記被用于鑒定親本植物和/或其祖先中以及由所述親本植物的雜交產生的后代植物中的能夠指導或控制對馬鈴薯Y病毒屬的抗性的本發明遺傳決定子。SNP標記是通過端點讀數Taqman技術可檢測的，并且除了特定正向和反向引物序列以外，還可以使用探針(例如，如在此所披露)來檢測每一標記位點處的R和/或S等位基因的存在。所以，所披露的基因標記中的每一個是由四個而不是僅兩個序列構成:擴增目標區的正向和反向引物以及鑒定目標SNP的兩個探針。
[0153]在本發明中，與對馬鈴薯Y病毒屬的抗性共分離的本發明的一個或多個DNA標記可以在PCR中用由以下構成的至少一個PCR寡核苷酸引物對將其鑒定:
[0154]1.正向引物SEQ ID NO:1和反向引物SEQ ID NO:2，隨后用SEQ ID N0:7和/或SEQ ID NO:8進行檢測；和/或
[0155]i1.正向引物SEQ ID N0:3和反向引物SEQ ID N0:4，隨后用SEQ ID N0:9和/或SEQ ID NO: 10進行檢測；和/或
[0156]ii1.正向引物 SEQ ID N0:5 和反向引物 SEQ ID N0:6，隨后用 SEQ ID NO: 11 和 /或SEQ ID NO: 12進行檢測；和/或
[0157]iv.正向引物 SEQ ID NO: 13 和反向引物 SEQ ID NO: 14，隨后用 SEQ ID NO: 15 和/或SEQ ID NO: 16進行檢測，
[0158]所述引物在一個PCR反應中產生一種擴增產物，它展現了基本上與在一個利用一致的成對引物的PCR反應中從西葫蘆栽培品種268NiW可獲得的相應PCR擴增產物一致的分子量或核苷酸序列，或可以被視為該相應PCR擴增產物的等位基因，西葫蘆栽培品種268Niff的樣品已經被以登錄號NCMB41727保存在NCMB有限公司。
[0159]在第一個步驟中，DNA或cDNA樣品是通過使用已知的技術提取DNA或RNA而從合適的植物材料，如葉組織獲得。然后，側接一個包含在此披露的能夠指導或控制對馬鈴薯Y病毒屬的抗性的基因組區域內的SNP的區域的引物被用于使用聚合酶鏈反應(PCR)法來擴增DNA樣品。
[0160]在替代方案中，所希望的等位基因的存在或不存在可以通過使用雙股DNA染料的實時PCR或熒光報告探針法來確定。
[0161]標記分析可以在植物發育早期使用從極幼小植物的葉組織或從種子提取的DNA樣品來進行。這允許在育種周期的早期鑒定具有令人希望的基因組成的植物并且在授粉之前丟棄不包含所希望的發明相關等位基因的植物，因而減小育種群體的大小并且降低表型分析的要求。
[0162]此外，通過使用分子標記，可以區分在能夠指導或控制對馬鈴薯Y病毒屬的抗性的至少一個遺傳決定子處攜帶所希望的發明相關等位基因的兩份拷貝的純合植物與僅攜帶一份拷貝的雜合植物和不包含有利等位基因的任何拷貝的植物。
[0163]因而，可以因此發展替代標記并用于鑒定和選擇根據本發明并且如在此所披露的具有質量性狀位點的等位基因或一組等位基因的植物。例如，可以獲得通過以下方式獲得的擴增產物的核苷酸序列:在PCR擴增中使用由以下組成的一個PCR寡核苷酸引物對:
[0164]1.正向引物SEQ ID NO:1和反向引物SEQ ID NO:2，隨后用SEQ ID N0:7和/或SEQ ID NO:8進行檢測；和/或
[0165]i1.正向引物SEQ ID N0:3和反向引物SEQ ID N0:4，隨后用SEQ ID N0:9和/或SEQ ID NO: 10進行檢測；和/或
[0166]ii1.正向引物 SEQ ID N0:5 和反向引物 SEQ ID N0:6，隨后用 SEQ ID NO: 11 和 /或SEQ ID NO: 12進行檢測；和/或
[0167]iv.正向引物 SEQ ID NO: 13 和反向引物 SEQ ID NO: 14，隨后用 SEQ ID NO: 15 和/或SEQ ID NO: 16進行檢測，
[0168]并且基于PCR擴增產物的新確定的核苷酸序列來設計新引物或成對引物。此外，根據本發明和之前在此披露的標記可以在南瓜或其他物種的基因圖譜上定位，并且相同或同源或直接同源區域中的已知標記作圖可以被用作發展新標記的起點。
[0169]因此，本發明中明確披露的標記還可以被用于鑒定和/或發展新的或附加的與對馬鈴薯Y病毒屬的抗性相關聯的標記，這些新的或附加的標記然后又可以被用于標記輔助育種和/或尋找側接馬鈴薯Y病毒屬抗性位點的重組體，和/或精細作圖，和/或克隆馬鈴薯Y病毒屬抗性位點。
[0170]有若干種可利用的方法或辦法，它們可以被用于鑒定和/或發展呈連鎖不平衡和/或與感興趣的區域連鎖和/或位于感興趣的區域中的標記，以及代表著引起馬鈴薯Y病毒屬抗性性狀的實際因果突變的標記。在不十分全面的情況下，一些途徑包括:
[0171]-在雜交途徑中使用所披露的序列/標記來鑒定感興趣的區域中的其他序列。
[0172]-在PCR途徑中使用所披露的序列/標記來鑒定感興趣的區域中的其他序列。
[0173]-在PCR途徑中使用所披露的序列/標記來鑒定感興趣的區域中的其他序列。[0174]-在作圖和/或比較作圖途徑中使用所披露的序列/標記來鑒定相同區域中的標記(在其他圖譜上定位所述至少一個能夠指導或控制對馬鈴薯Y病毒屬的抗性的遺傳決定子)。
[0175]-在“通過計算機進行的”途徑中使用所披露的序列/標記來鑒定附加的序列/標
記/ (候選)基因。
[0176]-在物理作圖途徑中使用所披露的序列/標記(在物理作圖或基因組序列上定位所述遺傳決定子)。
[0177]-使用所披露的序列/標記在其他(物理)圖譜或基因組上定位所述至少一個遺傳決定子。
[0178]-使用所披露的序列/標記選擇適當的個體，允許通過基因途徑鑒定感興趣的區域中的標記。
[0179]-使用所披露的信息尋找(位置上的)候選基因。
[0180]對于基因型分析、作圖或關聯作圖，DNA是從合適的植物材料，如例如葉組織中提取。具體來說，收集多個植物的大批葉子。使用多種多態性SSR、SNP或覆蓋整個南瓜基因組的任何其他合適的標記類型對DNA樣品進行基因型分析。
[0181]基因型和表型數據的聯合分析可以使用標準軟件來進行。可以針對在此披露的相應的至少一個能夠指導或控制對馬鈴薯Y病毒屬的抗性的遺傳決定子處的等位基因，基于與所述至少一個遺傳決定子連鎖的標記位點處的標記或已知位于同一染色體上的任何其他標記的核苷酸序列和這些等位基因的分子量，使用在此披露的或本領域的普通技術人員已知的一種或多種技術來篩選 植物引種和種質。
[0182]標記、連鎖標記或在此披露的至少一個能夠指導或控制對馬鈴薯Y病毒屬的抗性的遺傳決定子的核酸序列可以通過技術人員已知的方法來確定。例如，可以從馬鈴薯Y病毒屬抗性供體植物中，通過破碎所述植物的基因組并且選擇具備一個或多個指示所述至少一個遺傳決定子的標記的那些片段來分離出包括所述至少一個遺傳決定子或其抗性賦予部分的核酸序列。隨后，或作為替代方案，指示所述抗性位點的標記序列(或其部分)可以被用作(PCR)擴增引物，以便從獲自所述植物的基因組核酸樣品或基因組片段擴增包含所述抗性位點的一個或多個核酸序列。所述至少一個遺傳決定子和/或其中包含的任何附加標記的核苷酸序列可以通過標準測序方法來獲得。
[0183]因此，本發明還涉及一種分離的核酸(優選地為DNA但不限于DNA)序列，它包括本發明的至少一個能夠指導或控制對馬鈴薯Y病毒屬的抗性的遺傳決定子或其抗性賦予部分。因而，所披露的標記可以被用于從南瓜或其他蔬菜作物中鑒定和分離一個或多個與馬鈴薯Y病毒屬抗性連鎖或編碼馬鈴薯Y病毒屬抗性的標記或基因。
[0184]與本發明的所述至少一個能夠指導或控制對馬鈴薯Y病毒屬的抗性的遺傳決定子連鎖的附加標記的核苷酸序列還可以例如通過確定與所述至少一個遺傳決定子相關聯的一個或多個標記的核苷酸序列，并且針對所述標記的所述序列設計引物，然后所述引物可以被用于進一步確定所述標記外部的序列來解析。例如，在此披露的SNP標記或預計在所述至少一個遺傳決定子的區域中和/或與所述區域連鎖的任何其他標記的核苷酸序列可以通過本領域中眾所周知的方法對所述標記的PCR擴增產物進行測序，或作為替代方案在一個PCR中使用所述標記序列或用作雜交探針以通過例如但不限于BAC篩選來鑒定連鎖的核苷酸序列來獲得。
[0185]種子保存詳情
[0186]2010年6月14日根據布達佩斯條約(the Budapest Treaty)的規定以先正達公司(Syngenta Participations AG)的名義將以下種子樣品保存在英國蘇格蘭阿伯丁郡AB219YA貝克斯伯恩的克萊伯斯通莊園弗格森大廈的NCMB (FergusonBuilding, Craibstone Estate, Bucksburn, Aberdeen AB219YA, Scotland, UK):
[0187]NCIMB41726西葫蘆栽培品種PP415
[0188]NCIMB41727 西葫蘆栽培品種 268NiW
[0189]本發明的實施例
[0190]1.一種栽培的南瓜屬植物，優選地西葫蘆，包含至少一個能夠指導或控制對馬鈴薯Y病毒屬，優選地對MWMV、PRSV、WMV以及ZYMV中的I個或多個的抗性的遺傳決定子。
[0191]2.根據實施例1的植物，其中所述遺傳決定子是從中國南瓜，優選地中國南瓜尼日利亞變種可獲得的。
[0192]3.根據實施例1或2的植物，其中所述遺傳決定子是以一種純合狀態存在。
[0193]4.根據實施例1到3的植物，包含至少一個所述能夠指導或控制對馬鈴薯Y病毒屬感染的抗性的遺傳決定子。
[0194]5.根據實施例1到3的植物，包含至少兩個所述能夠指導或控制對馬鈴薯Y病毒屬感染的抗性的遺傳決定子。
`[0195]6.根據實施例1到3的植物，包含至少四個所述能夠指導或控制對馬鈴薯Y病毒屬感染，優選地對ZYMV和MWMV感染的抗性的遺傳決定子。
[0196]7.根據任何前述實施例的植物，其中
[0197]a)該遺傳決定子與西胡戶栽培品種268NiW中所存在的相應遺傳決定子互補，該西葫蘆栽培品種268NiW的代表性種子以登錄號NCMB41727保存在NCMB，所述相應遺傳決定子與標記位點ZN遺傳連鎖，該標記位點與馬鈴薯Y病毒屬抗性性狀，優選地與一種ZYMV和PRSV抗性性狀共分離，并且可以在PCR中通過用以下寡核苷酸引物對擴增DNA片段將其鑒定:正向引物SEQ ID NO:1和反向引物SEQ ID NO:2，隨后用SEQ ID N0:7和/或SEQ IDNO:8進行檢測；和/或
[0198]b)該遺傳決定子與西胡戶栽培品種268NiW中所存在的相應遺傳決定子中的兩個互補，該西葫蘆栽培品種268NiW的代表性種子以登錄號NCMB41727保存在NCMB，所述相應遺傳決定子與標記位點Wl和/或W2遺傳連鎖，這些標記位點與馬鈴薯Y病毒屬抗性性狀，優選地與一種MWMV抗性性狀共分離，并且可以在PCR中通過用以下寡核苷酸引物對擴增DNA片段將其鑒定:正向引物SEQ ID N0:3和反向引物SEQ ID N0:4，隨后用SEQ ID NO:9和/或SEQ ID NO: 10進行檢測；
[0199]和/或正向引物SEQ ID N0:5和反向引物SEQ ID N0:6，隨后用SEQ ID NO: 11和/或SEQ ID NO: 12進行檢測；和/或
[0200]c)該遺傳決定子與西葫蘆栽培品種268NiW中所存在的相應遺傳決定子互補，該西葫蘆栽培品種268NiW的代表性種子以登錄號NCMB41727保存在NCMB，所述相應遺傳決定子與標記位點Ni+遺傳連鎖，該標記位點與馬鈴薯Y病毒屬抗性性狀，優選地與一種ZYMV抗性性狀，更優選地與一種ZYMV病毒株Nivir抗性性狀共分離，并且可以在PCR中通過用以下寡核苷酸引物對擴增DNA片段將其鑒定:正向引物SEQ ID NO: 13和反向引物SEQ IDNO: 14，隨后用 SEQ ID NO: 15 和 / 或 SEQ ID NO: 16 進行檢測。
[0201]8.根據任何前述實施例的植物，其中
[0202]a)該遺傳決定子與西胡戶栽培品種268NiW中所存在的相應遺傳決定子互補，該西葫蘆栽培品種268NiW的代表性種子以登錄號NCMB41727保存在NCMB，所述相應遺傳決定子與標記位點ZN遺傳連鎖，該標記位點與馬鈴薯Y病毒屬抗性性狀，優選地與一種ZYMV和PRSV抗性性狀共分離，并且可以在PCR中通過用以下寡核苷酸引物對擴增DNA片段在西葫蘆栽培品種268NiW基因組中將其鑒定:正向引物SEQ ID N0:1和反向引物SEQ ID N0:2,隨后用SEQ ID N0:7和/或SEQ ID NO:8進行檢測；和/或
[0203]b)該遺傳決定子與西胡戶栽培品種268NiW中所存在的相應遺傳決定子中的兩個互補，該西葫蘆栽培品種268NiW的代表性種子以登錄號NCMB41727保存在NCMB，所述相應遺傳決定子與標記位點Wl和/或W2遺傳連鎖，這些標記位點與馬鈴薯Y病毒屬抗性性狀，優選地與一種MWMV抗性性狀共分離，并且可以在PCR中通過用以下寡核苷酸引物對擴增DNA片段在西葫蘆栽培品種268NiW基因組中將其鑒定:正向引物SEQ ID N0:3和反向引物 SEQ ID NO:4,隨后用 SEQ ID N0:9 和 / 或 SEQ ID NO: 10 進行檢測；
[0204]和/或正向引物SEQ ID N0:5和反向引物SEQ ID N0:6，隨后用SEQ ID NO: 11和/或SEQ ID NO: 12進行檢測；和/或
[0205]c)該遺傳決定子與西葫蘆栽培品種268NiW中所存在的相應遺傳決定子互補，該西葫蘆栽培品種268NiW的代表性種子以登錄號NCMB41727保存在NCMB，所述相應遺傳決定子與標記位點Ni+遺傳連鎖，該標記位點與馬鈴薯Y病毒屬抗性性狀，優選地與一種ZYMV抗性性狀，更優選地與一種ZYMV病毒株Nivir抗性性狀共分離，并且可以在PCR中通過用以下寡核苷酸引物對擴增DNA片段在西 葫蘆栽培品種268NiW基因組中將其鑒定:正向引物SEQ ID NO: 13 和反向引物 SEQ ID NO: 14，隨后用 SEQ ID N0:15 和 / 或 SEQ ID NO: 16 進行檢測。
[0206]9.根據任何前述實施例的植物，其中
[0207]a)該遺傳決定子與標記位點ZN遺傳連鎖，該標記位點與馬鈴薯Y病毒屬抗性性狀，優選地與一種ZYMV和PRSV抗性性狀共分離，并且可以在PCR中通過用以下寡核苷酸引物對擴增DNA片段在所述植物基因組中將其鑒定:正向引物SEQ ID NO:1和反向引物SEQID NO:2，隨后用SEQ ID N0:7和/或SEQ ID NO:8進行檢測；和/或
[0208]b)該遺傳決定子與標記位點W2遺傳連鎖，該標記位點與馬鈴薯Y病毒屬抗性性狀，優選地與一種MWMV抗性性狀共分離，并且可以在PCR中通過用以下寡核苷酸引物對擴增DNA片段在所述植物基因組中將其鑒定:正向引物SEQ ID N0:3和反向引物SEQ IDNO:4,隨后用SEQ ID N0:9和/或SEQ ID NO: 10進行檢測；
[0209]和/或正向引物SEQ ID N0:5和反向引物SEQ ID N0:6，隨后用SEQ ID NO: 11和/或SEQ ID NO: 12進行檢測；和/或
[0210]c)該遺傳決定子與標記位點Ni+遺傳連鎖，該標記位點與馬鈴薯Y病毒屬抗性性狀，優選地與一種ZYMV抗性性狀，更優選地與一種ZYMV病毒株Nivir抗性性狀共分離，并且可以在PCR中通過用以下寡核苷酸引物對擴增DNA片段在所述植物基因組中將其鑒定:正向引物SEQ ID NO: 13和反向引物SEQ ID NO: 14，隨后用SEQ ID NO: 15和/或SEQ IDNO: 16進行檢測。
[0211]10.根據任何前述實施例的植物，其中該(這些)遺傳決定子是隱性遺傳的。
[0212]11.根據任何前述實施例的植物，其中該植物是一種非轉基因南瓜植物。
[0213]12.根據任何前述實施例的植物，其中該植物是一個近交系、一個雙單倍體或一個雜種。
[0214]13.根據任何前述實施例的植物，其中該植物是雄性不育的。
[0215]14.一種植物材料，是從根據任何前述實施例的植物中可獲得的，包括但不限于葉、莖、根、花或花的部分、果實、花粉、卵細胞、接合子、種子、切條、細胞或組織培養物、或該植物的任何其他部分或產物，該植物材料仍展現一種馬鈴薯Y病毒屬抗性表型，特別是當生長成一個植物時。
[0216]15.根據任何前述實施例的植物的多個植物部分，包括但不限于植物種子、植物器官(如例如根、莖、葉、花蕾或胚等)、胚珠、花粉小孢子、植物細胞、植物組織、植物細胞培養物(如例如原生質體、細胞培養物細胞、處于不同的發育階段的植物組織、花粉、花粉管、胚珠、胚囊、接合子以及胚中的細胞等)；這些植物部分仍展現一種馬鈴薯Y病毒屬抗性表型，特別是當生長成一個植物時。
[0217]16.一種根據任何前述實施例的南瓜植物的種子，該種子能夠生長成一種馬鈴薯Y病毒屬抗性南瓜植物。
[0218]17.根據實施例16的種子,其中所述種子是雜種種子。
[0219]18.根據實施例17的種子，被以登錄號41727保存在NCMB有限公司。
[0220]19.一種實施例16到18的種子的用途，用于生長成一種馬鈴薯Y病毒屬抗性南瓜植物。
[0221]20.一種用于檢測南瓜植物中能夠指導或控制對馬鈴薯Y病毒屬的抗性的遺傳決定子的試劑盒，其中所述試劑盒包括能夠擴增與該遺傳決定子連鎖的DNA標記的一個PCR寡核苷酸引物或一個PCR寡核苷酸引物對，并且其中所述DNA標記可以在一個PCR中用選自以下的一個PCR寡核苷酸引物對進行擴增:
[0222]a)正向引物SEQ ID NO:1和反向引物SEQ ID NO:2，隨后用SEQ ID N0:7和/或SEQ ID NO:8進行檢測；和/或
[0223]b)正向引物SEQ ID N0:3和反向引物SEQ ID N0:4，隨后用SEQ ID N0:9和/或SEQ ID NO: 10進行檢測；和/或
[0224]c)正向引物SEQ ID N0:5和反向引物SEQ ID N0:6，隨后用SEQ ID NO: 11和/或SEQ ID NO: 12進行檢測；和/或
[0225]d)正向引物 SEQ ID NO: 13 和反向引物 SEQ ID NO: 14，隨后用 SEQ ID NO: 15 和 /或SEQ ID NO: 16進行檢測。
[0226]21.一種DNA標記，與能夠指導或控制對馬鈴薯Y病毒屬的抗性的遺傳決定子連鎖并且可以在一個PCR中用選自以下的一個PCR寡核苷酸引物對進行擴增:
[0227]a)正向引物SEQ ID NO:1和反向引物SEQ ID NO:2，隨后用SEQ ID N0:7和/或SEQ ID NO:8進行檢測；和/或
[0228]b)正向引物SEQ ID N0:3和反向引物SEQ ID N0:4，隨后用SEQ ID N0:9和/或SEQ ID NO: 10進行檢測；和/或[0229]c)正向引物SEQ ID N0:5和反向引物SEQ ID N0:6，隨后用SEQ ID NO: 11和/或SEQ ID NO: 12進行檢測；和/或
[0230]d)正向引物 SEQ ID NO: 13 和反向引物 SEQ ID NO: 14，隨后用 SEQ ID NO: 15 和 /或SEQ ID NO: 16進行檢測。
[0231]22.根據實施例21的任何一種DNA標記的用途，用于診斷性選擇南瓜中一種能夠指導或控制對馬鈴薯Y病毒屬的抗性的遺傳決定子。
[0232]23.根據實施例21到22所述的任何一種DNA標記的用途，用于鑒定植物中一種能夠指導或控制對馬鈴薯Y病毒屬的抗性的遺傳決定子的存在和/或用于監測南瓜中該能夠指導或控制對馬鈴薯Y病毒屬的抗性的遺傳決定子的基因滲入。
[0233]24.多核苷酸，是用以下方式可獲得的:在一個PCR中通過用選自以下的一個PCR寡核苷酸引物對擴增一個DNA片段:
[0234]a)正向引物SEQ ID NO:1和反向引物SEQ ID NO:2，隨后用SEQ ID N0:7和/或SEQ ID NO:8進行檢測；和/或
[0235]b)正向引物SEQ ID N0:3和反向引物SEQ ID N0:4，隨后用SEQ ID N0:9和/或SEQ ID NO: 10進行檢測；和/或
[0236]c)正向引物SEQ ID N0:5和反向引物SEQ ID N0:6，隨后用SEQ ID NO: 11和/或SEQ ID NO: 12進行檢測；和/或
[0237]d)正向引物 SEQ ID NO: 13 和反向引物 SEQ ID NO: 14，隨后用 SEQ ID NO: 15 和 /或SEQ ID NO: 16進行檢測，
[0238]所述多核苷酸包含在統計上相關并且因而與一種能夠指導或控制對馬鈴薯Y病毒屬的抗性的遺傳決定子遺傳連鎖的一種DNA標記，并且其中所述多核苷酸相應于在一個PCR中利用相同的成對引物從西葫蘆栽培品種268NiW可獲得的一種擴增產物，該西葫蘆栽培品種268NiW的代表性種子以登錄號NCMB41727保存在NCMB，其條件是，對應的標記位點仍存在于所述西葫蘆栽培品種268NiW植物中，和/或可以被視為其等位基因。
[0239]25.一種多核苷酸，與實施例24的多核苷酸的序列具有至少90%、特別是至少95%、特別是至少96%、特別是至少97%、特別是至少98%、特別是至少99%序列一致性。
[0240]26.一種多核苷酸,展現與實施例25的多核苷酸的核苷酸序列雜交的一種核苷酸序列。
[0241]27.一種用于將至少一個能夠指導或控制對馬鈴薯Y病毒屬的抗性的遺傳決定子引入到缺乏所述遺傳決定子的南瓜植物中的方法，包括:
[0242]a)獲得一個根據任何一個前述實施例的第一南瓜植物；
[0243]b)使所述第一南瓜植物與一個第二南瓜植物雜交，其中所述第二南瓜植物缺乏所述等位基因；以及
[0244]c)鑒定一種由該雜交產生的展現增加的對馬鈴薯Y病毒屬的抗性并且包含至少一個與所述馬鈴薯Y病毒屬抗性共分離的DNA標記的植物；以及
[0245]d)任選地，分離所述植物；以及
[0246]e)任選地，使所述植物與該第一或第二南瓜植物回交。
[0247]28.一種用于獲得根據任何前述實施例的植物的種子的方法，包括以下步驟:
[0248]a)獲得一個根據任何一個前述實施例的第一南瓜植物；[0249]b)使所述第一南瓜植物與一個第二南瓜植物雜交，其中所述第二南瓜植物缺乏所述遺傳決定子；以及
[0250]c)鑒定一種由該雜交產生的展現增加的對馬鈴薯Y病毒屬的抗性并且包含至少一個與所述馬鈴薯Y病毒屬抗性共分離的DNA標記的植物；以及
[0251 ] d)從所述雜交收獲包含至少一個與所述馬鈴薯Y病毒屬抗性共分離的DNA標記的后代種子。
[0252]29.根據實施例27或28中任何一個的方法，其中在步驟c)中，一種由該雜交產生并且包含至少一個能夠指導或控制對馬鈴薯Y病毒屬的抗性的遺傳決定子的植物可以在PCR中通過用選自以下的一個PCR寡核苷酸引物對擴增DNA片段將其鑒定:
[0253]a)正向引物SEQ ID NO:1和反向引物SEQ ID NO:2，隨后用SEQ ID N0:7和/或SEQ ID NO:8進行檢測；和/或
[0254]b)正向引物SEQ ID N0:3和反向引物SEQ ID N0:4，隨后用SEQ ID N0:9和/或SEQ ID NO: 10進行檢測；和/或
[0255]c)正向引物SEQ ID N0:5和反向引物SEQ ID N0:6，隨后用SEQ ID NO: 11和/或SEQ ID NO: 12進行檢測；和/或
[0256]d)正向引物 SEQ ID NO: 13 和反向引物 SEQ ID NO: 14，隨后用 SEQ ID NO: 15 和 /或SEQ ID NO: 16進行檢測。
[0257]30.根據實施例29的方法，其中確定一個或多個成對引物的擴增產物的片段尺寸。
[0258]31.一種用于產生對馬鈴薯Y病毒屬，優選地對MWMV、PRSV、WMV以及ZYMV中的I個或多個展現抗性的南瓜植物的方法，包括以下步驟:
[0259]a)選擇一種包含至少一個能夠指導或控制對馬鈴薯Y病毒屬的抗性的遺傳決定子的南瓜植物，其中所述遺傳決定子是從西葫蘆栽培品種268NiW的基因組中可獲得的并且與至少一個標記位點遺傳連鎖，該至少一個標記位點與對馬鈴薯Y病毒屬的抗性共分離，并且可以在PCR中用包括以下的至少一個PCR寡核苷酸引物對將其鑒定:
[0260]1.正向引物SEQ ID NO:1和反向引物SEQ ID NO:2，隨后用SEQ ID N0:7和/或SEQ ID NO:8進行檢測；和/或
[0261]i1.正向引物SEQ ID N0:3和反向引物SEQ ID N0:4，隨后用SEQ ID N0:9和/或SEQ ID NO: 10進行檢測；和/或
[0262]ii1.正向引物 SEQ ID N0:5 和反向引物 SEQ ID N0:6，隨后用 SEQ ID NO: 11 和 /或SEQ ID NO: 12進行檢測；和/或
[0263]iv.正向引物 SEQ ID NO: 13 和反向引物 SEQ ID NO: 14，隨后用 SEQ ID NO: 15 和/或SEQ ID NO: 16進行檢測；和/或
[0264]V.一種正向和反向引物，它能夠鑒定與所述馬鈴薯Y病毒屬抗性表型中的至少一種共分離的一個標記位點；
[0265]b)使步驟a)的所述 植物與一種易感染馬鈴薯Y病毒屬或對至少一種所述馬鈴薯Y病毒屬展現中等抗性水平的南瓜植物雜交；以及
[0266]c)從所述雜交中選擇一個后代，該后代對馬鈴薯Y病毒屬展現一種抗性表型，并且其中所述抗性表型與步驟a)的所述至少一個標記位點分離。[0267]32.根據實施例31的用于產生對馬鈴薯Y病毒屬，優選地對ZYMV和MWMV中的至少之一展現抗性的南瓜植物的方法，包括以下步驟:
[0268]a)選擇一種包含至少一個能夠指導或控制對馬鈴薯Y病毒屬的抗性的遺傳決定子的南瓜植物，其中所述遺傳決定子是從西葫蘆栽培品種268NiW的基因組中可獲得的并且與至少一個標記位點遺傳連鎖，該至少一個標記位點與對馬鈴薯Y病毒屬的抗性共分離，并且可以在PCR中用包括以下的至少一個PCR寡核苷酸引物對將其鑒定:
[0269]1.如果該標記位點為ZN，則為正向引物SEQ ID NO:1和反向引物SEQ ID NO: 2，隨后用SEQ ID N0:7和/或SEQ ID NO:8進行檢測；和/或
[0270]i1.如果該標記位點為W1，則為正向引物SEQ ID N0:3和反向引物SEQ ID NO:4,隨后用SEQ ID N0:9和/或SEQ ID NO: 10進行檢測；和/或
[0271]ii1.如果該標記位點為W2，則為正向引物SEQ ID N0:5和反向引物SEQ ID N0:6,隨后用SEQ ID NO: 11和/或SEQ ID NO: 12進行檢測；
[0272]iv.如果該標記位點為Ni+，則為正向引物SEQ ID NO: 13和反向引物SEQ IDNO: 14，隨后用 SEQ ID NO: 15 和 / 或 SEQ ID NO: 16 進行檢測；
[0273]b)使步驟a)的所述植物與一種易感染馬鈴薯Y病毒屬或對至少一種所述馬鈴薯Y病毒屬展現中等抗性水平的南瓜植物雜交；以及
[0274]c)從所述雜交中選擇一個后代，該后代對馬鈴薯Y病毒屬展現一種抗性表型，并且其中所述抗性表型與步驟a)的所述至少一個標記位點分離。
[0275]33.根據實施例31或32的方法，其中步驟a)中選擇的該植物包含至少兩個能夠指導或控制對馬鈴薯Y病毒屬的抗性的遺傳決定子；并且步驟c)中選擇的該后代展現一種馬鈴薯Y病毒屬抗性表型，并且其中所述抗性表型與步驟a)的兩個標記位點分離。
[0276]34.根據實施例31或32的方法，其中步驟a)中選擇的該植物包含至少三個能夠指導或控制對馬鈴薯Y病毒屬，優選地對ZYMV和MWMV的抗性的遺傳決定子；并且步驟c)中選擇的該后代對馬鈴薯Y病毒屬，優選地對ZYMV和MWMV展現一種抗性表型，并且其中所述抗性表型與步驟a)的這些標記位點分離。
[0277]35.根據任何前述實施例31到34的方法，其中步驟a)的該供體植物是一種任何前述實施例1到13的植物。
[0278]36.根據實施例31到35的方法，包括使步驟c)中獲得的該病毒抗性植物與步驟b)的該易感南瓜植物或中等抗性南瓜植物回交的附加步驟。
[0279]37.一種用于產生對馬鈴薯Y病毒屬具有抗性的南瓜的雜種種子的方法，包括
[0280]a)種植一個雄性不育雌性植物和一個雄性能育植物，其中所述雄性不育雌性植物或雄性能育植物之一是一種根據任何前述實施例1到13的植物，
[0281]b)在兩個株系之間實現異花授粉，
[0282]c)使該植物生長直到座果，
[0283]d)收集這些果實；以及
[0284]e)獲得這些雜種種子。
[0285]38.一種用于獲得馬鈴薯Y病毒屬抗性南瓜植物的方法，包括
[0286]a)通過任何前述實施例的方法獲得任何前述實施例的植物或；
[0287]b)使所述植物與一種易感染馬鈴薯Y病毒屬的植物或中等抗性南瓜植物雜交；[0288]c)挽救由步驟b)的該雜交產生的一個胚；
[0289]d)從步驟c)的所述胚再生出一種植物；以及
[0290]e)選擇對馬鈴薯Y病毒屬，優選地對ZYMV和MWMV中的至少之一具有抗性的步驟d)的一種植物。
[0291]39.一種用于獲得對馬鈴薯Y病毒屬具有抗性的南瓜果實的方法，包括
[0292]a)播種一種根據任何前述實施例中的任何一個的或通過根據任何前述實施例中的任何一個的方法獲得的植物的種子；以及
[0293]b)使所述植物生長以便產生果實，并且收獲由所述植物產生的該果實。
[0294]40.一種能夠指導或控制對馬鈴薯Y病毒屬的抗性的遺傳決定子，其中所述遺傳決定子是從西葫蘆栽培品種268NiW的基因組中可獲得的，其中
[0295]a)該遺傳決定子與西葫蘆栽培品種268NiW中所存在的相應遺傳決定子互補，該西葫蘆栽培品種268NiW的代表性種子以登錄號NCHMB41727保存在NCMB，所述相應遺傳決定子與標記位點ZN遺傳連鎖，該標記位點與馬鈴薯Y病毒屬抗性性狀，優選地與一種ZYMV和PRSV抗性性狀共分離，并且可以在PCR中通過用以下寡核苷酸引物對擴增DNA片段將其鑒定:正向引物SEQ ID NO:1和反向引物SEQ ID NO:2，隨后用SEQ ID N0:7和/或SEQ IDNO:8進行檢測；和/或
[0296]b)該遺傳決定子與西胡戶栽培品種268NiW中所存在的相應遺傳決定子中的至少一個互補，該西葫蘆栽培品種268NiW的代表性種子以登錄號NCMB41727保存在NCMBjjf述相應遺傳決定子與標記位點Wl和/或`W2遺傳連鎖，該標記位點與馬鈴薯Y病毒屬抗性性狀，優選地與一種MWMV抗性性狀共分離，并且可以在PCR中通過用以下寡核苷酸引物對擴增DNA片段將其鑒定:正向引物SEQ ID N0:3和反向引物SEQ ID N0:4，隨后用SEQ IDN0:9和/或SEQ ID NO: 10進行檢測；
[0297]和/或正向引物SEQ ID N0:5和反向引物SEQ ID N0:6，隨后用SEQ ID NO: 11和/或SEQ ID NO: 12進行檢測；和/或
[0298]c)該遺傳決定子與西胡戶栽培品種268NiW中所存在的相應遺傳決定子互補，該西葫蘆栽培品種268NiW的代表性種子以登錄號NCMB41727保存在NCMB，所述相應遺傳決定子與標記位點Ni+遺傳連鎖，該標記位點與馬鈴薯Y病毒屬抗性性狀，優選地與一種ZYMV抗性性狀，更優選地與一種ZYMV病毒株Nivir抗性性狀共分離，并且可以在PCR中通過用以下寡核苷酸引物對擴增DNA片段將其鑒定:正向引物SEQ ID NO: 13和反向引物SEQ IDNO: 14，隨后用 SEQ ID NO: 15 和 / 或 SEQ ID NO: 16 進行檢測。
[0299]41.一種鑒定包含至少一個能夠指導或控制對馬鈴薯Y病毒屬，優選地對ZYMV和MWMV中的至少之一的抗性的遺傳決定子的南瓜植物的方法，其中所述遺傳決定子是從西葫蘆栽培品種268NiW的基因組中可獲得的并且與至少一個標記位點遺傳連鎖，該至少一個標記位點與所述馬鈴薯Y病毒屬抗性表型中的至少一種共分離，并且可以在PCR中用包括以下的至少一個PCR寡核苷酸引物對將其鑒定:
[0300]1.如果該標記位點為ZN，則為正向引物SEQ ID NO:1和反向引物SEQ ID NO: 2，隨后用SEQ ID N0:7和/或SEQ ID NO:8進行檢測；或
[0301]i1.如果該標記位點為W1，則為正向引物SEQ ID N0:3和反向引物SEQ ID NO:4,隨后用SEQ ID N0:9和/或SEQ ID NO: 10進行檢測；或[0302]ii1.如果該標記位點為W2，則為正向引物SEQ ID N0:5和反向引物SEQ ID N0:6,隨后用SEQ ID NO: 11和/或SEQ ID NO: 12進行檢測；或
[0303]iv.如果該標記位點為Ni+，則為正向引物SEQ ID NO: 13和反向引物SEQ IDNO: 14，隨后用 SEQ ID NO: 15 和 / 或 SEQ ID NO: 16 進行檢測。
[0304]42.得自根據任何一個前述實施例的南瓜植物的馬鈴薯Y病毒屬抗性繁殖材料的用途，用于生長成一種馬鈴薯Y病毒屬抗性南瓜植物以便產生果實并且收獲所述果實。
[0305]實例
[0306]實例I
[0307]南瓜中與ZYMV和MWMV抗性基因緊密連鎖的標記的發現
[0308]1.1 材料
[0309]出于標記發現的目的，從中國南瓜尼日利亞栽培品種產生多個能分離出ZYMV (R株系[PP452]x S 株系[T0SCA])和 MWMV(S 株系[PP477]x R 株系[PP477/(PP415/(PP419/(尼日利亞/PP432)])抗性基因的F2群體并且取樣；并且對應地針對ZYMV和MWMV抗性對它們的相應F3后代進行表型分析。
[0310]通過對由相應于不同的類型和市場區隔的96個南瓜株系和品種組成的多樣性驗證小組進行基因型分析來評估發展的檢驗的預計值。
[0311]1.2標記發現
[0312]對具有相反的抗性和易感表型的不同F2DNA池進行群體分離分析(BulkedSegregant Analysis, BSA),該分析使用隨機擴增多態性DNA (RAPD)標記(得自加利福尼亞州阿拉米達的奧佩隆技術公司(Operon technologies, Alameda, Calif.)和加拿大溫哥華的英屬哥倫比亞大學(University of British Columbia, Vancouver, Canada))。在 F2 群體的個別成員中對從BSA篩選鑒定的候選標記(RAPD帶顯示F2R和S群體之間明顯的存在/不存在模式)進一步測試連鎖；并且選擇最緊密連鎖的標記用于更具特異性的檢驗發展。
[0313]對于ZYMV，選擇在F2群體中顯示與ZYMV抗性表型完美相關(共分離)的單一 RAPD標記0PBB09_451用于Taqman端點讀數(EPR)檢驗的發展。
[0314]對于MWMV，在兩個不同位點(QTL)對與MWMV抗性表型相關的RAPD標記進行作圖，并且選擇最佳標記0PAR13_507和UBC385_656，它們顯示對應地與QTLl和QTL2最高關聯(連鎖)。
[0315]對于Ni+，通過將這兩個群體再測序來進行BSA。已經將所獲得的讀數與南瓜的參考序列進行比對，并且已經檢測到SNP。然后選擇最緊密連鎖的SNP用于進行更具特異性的Taqman EPR檢驗發展。
[0316]1.3Taqman EF1R 檢驗發展
[0317]根據乙酸鉀+蛋白酶K方案分離所有植物DNA。對于等位基因測序，在所選擇的RAro候選片段的5’和3’端設計多達3種不同的PCR引物組合。使用來自抗性和易感株系小組的株系獲得這些標記的PCR產物和DNA序列。
[0318]Taqman EPR檢驗發展是基于在序列小組中發現的等位基因特異性SNP。EPR檢驗發展是根據標準指南來進行，包括對不同的PCR混合物、DNA濃度和退火溫度進行測試。探針是FAM-MGB和VIC-MGB Taqman探針(歐洲基因技術公司(Eurogentec))。
[0319]1.4Taqman EF1R 檢驗方案[0320]1.用標準DNA提取乙酸鉀+蛋白酶K方案來分離DNA基因組。最后，獲得150 μ I
DNA溶液。
[0321]2.將模板DNA稀釋到1/15。
[0322]3.將4 μ I每一個被稀釋的DNA樣品吸移到單獨的384PCR板的孔中。
[0323]4.將該板蓋上并離心，并且放在冰上。
[0324]5.制造母液混合物。每次反應如下:
[0325]
蔬菜項目混合物Platinum體積(μ I) 最終濃度
Platinum 緩沖液 IOxIIx
MgCl250mM063mM
dNTPlOmM (各 2.5mM)080.8mM (各 0.2mM)
Taq platinum5U/μ I0.0660.33U
ZN R 等位基因 VIC-MG B-NFQ 探針 10 μ M07?IOOnM
ZN S 等位基因 FAM-MGB-NFQ 探針 10 μ M07?IOOnM
ZN 正義引物 12.5μ MοΤΤθ200ηΜ
ZN 反義引物 12.5μ MοΤΤθ200ηΜ
R0X50x07?05χ
Qsp H2O2.914
總體積6
[0326]6.將6 μ I母液混合物添加到每一個PCR板孔(其中已含有4 μ I模板DNA)中。
[0327]7.短暫地旋轉。
[0328]8.將該384板裝載在PCR機上。
[0329]9.基于 ABI GENEAMP PCR9700-384 板格式的 PCR 計劃如下:
[0330]2 分鐘，94 O
[0331]15 秒，94?
[0332]I 分鐘，60 °C
[0333]40X
[0334]5 分鐘，72 °C
[0335]10.在AB17900上對該板進行讀數。
[0336]1.5EPR檢驗引物和探針序列
[0337]1.5.1.ZYMV-尼日利亞
[0338]正向引物:5，AGGTTTCATGGGCTTTTAATGG3，(SEQID NO:1)[0339]反向引物:5’CGTGAGCCTAAAACGGTTAATG3’ (SEQ ID NO:2)
[0340]抗性等位基因特異性探針:FAM-CACTTCCCAGCCCAAAT-MGB-NFQ(SEQ ID NO:7)
[0341]易感等位基因特異性探針:VIC-CACTTTCCAGCCCAAAT-MGB-NFQ(SEQ ID N0:8)
[0342]Ni+
[0343]正向引物:5’TTGCATGTTCCTTGGATGGGT3’(SEQ ID NO: 13)
[0344]反向引物:5’GGCAACCTCTGTCCAATTTCTTTC3’(SEQ ID NO: 14)
[0345]抗性等位基因特異性探針:FAM-AGTTGCGACTTTCCA-MGB-NFQ(SEQ ID NO: 15)
[0346]易感等位基因特異性探針:TET-AGTTGCGACTTTTCATT-MGB-NFQ(SEQ ID NO: 16)
[0347]1.5.2.MWMV-尼日利亞
[0348]1.5.2.1QTLl
[0349]正向引物:5’GGGCAAAGAAGATCTTGTCTAGAAAG3’ (SEQ ID NO:3)
[0350]反向引物:5’GTTTTTGTGCAGTGTGCATCTGT3’(SEQID NO:4)
[0351]抗性等位基因特異性探針:FAM-TCATTGCACCCAACATG-MGB-NFQ(SEQ ID NO:9)
[0352]易感等位基因特異性探針:VIC-TCATTGCACTCAACATGG-MGB-NFQ(SEQ ID NO: 10) [0353]1.5.2.1QTL2
[0354]正向引物:5’TTGTGTTTATATGTATGTGTGCGAG3’(SEQID NO:5)
[0355]反向引物:5’TTTCTAGATCTCAGTGTAAGAGAACACA3’(SEQID NO:6)
[0356]抗性等位基因特異性探針:FAM-TTTGTTTGCTTGAGCTGG-MGB-NFQ(SEQ ID NO: 11)
[0357]易感等位基因特異性探針:VIC-TTTGTTCGATTGAGCTGG-MGB-NFQ(SEQ ID NO: 12)
[0358]實例2
[0359]疾病測試方案
[0360]2.1方案的使用
[0361]以下方案可適用于南瓜以及南瓜屬和黃瓜(黃瓜屬)上的所有病毒(CMV、ZYW、WMV、MWMV)。
[0362]2.2病毒株的保存
[0363]將新被感染的葉子(Ig)稱重。然后用解剖刀將這些葉子細細地切碎并且放在紙質稱重托盤上。將該稱重托盤放在一個包含無水氯化鈣的皮氏培養皿(55mm)上。用石臘膜將盒子密封。在盒子上指示病毒株的名稱、保存日期以及所制備的新鮮葉子的重量，并且記錄盒子的數目。將這些盤子保持在冰箱中的抽屜“蔬菜”中。
[0364]2.3來自脫水制劑的病毒的增殖
[0365]在一個或多個陶罐中播種易感品種。當植物處于“子葉”階段時，由脫水制劑進行接種(參見下文，測試物的接種)。在I周到10天之后，第一癥狀將會出現，并且處于該病毒最具侵襲性的階段。
[0366]2.4接種物的制備
[0367]從陶罐中挑出被感染的嫩葉。對于I克葉子，準備0.1克煤和4cc緩沖溶液。在添加該煤和最后添加該緩沖溶液之前，將這些葉子弄碎。將金剛砂撒到該混合物中。利用I克新鮮葉子，可以接種2到3個陶罐(I陶罐=80到100個植物)。
[0368]2.5測試物的接種
[0369]將這些接種物放在一個冰床上。在子葉階段對這些植物進行接種。用這些接種物摩擦這些子葉，必要時每小時更新該溶液。在干燥15分鐘之后，然后給該植物澆水。第一次讀數可以在接種之后5到6天時進行。然后可以在7到10天之后進行第二次讀數以證實并且完善信息。為了結束測試，將葉子密封在塑料袋中并且放在生物廢物中。進行該測試的最佳溫度條件是日間25°C ±2°和夜間20°C ±2°。
[0370]2.6大事記
[0371]第0-8天增殖的陶罐的播種
[0372]第0-2天陶罐的接種
[0373]第O天測試物的播種
[0374]第0+6天測試物的接種
[0375]第0+14天讀數的開始
[0376]第0+30天測試物的破壞
[0377]實例3
[0378]對夏南瓜(西葫蘆)進行馬鈴薯Y病毒屬病理學測試的指南
[0379]3.1評級指南
[0380]以下指南被用于確定葉子和果實上的ZYMV、WMV, PRSV, MWMV感染的程度。從第3葉階段直到成熟植物階段(具有植物學上成熟的果實)，自始至終對作物進行讀數、評估以及評級。
`[0381]根據以下指南在從I到9的量表上進行評級，其實例示于圖1到9中。
[0382]表1馬鈴薯Y病毒屬測試的指南
[0383]
【權利要求】
1.一種栽培的南瓜屬植物，優選地西葫蘆，包含至少一個能夠指導或控制對馬鈴薯Y病毒屬，優選地對MWMV、PRSV, WMV和/或ZYMV的抗性的遺傳決定子。
2.根據權利要求1所述的植物，其中所述遺傳決定子是從中國南瓜的基因組中可獲得的。
3.根據權利要求1或2所述的植物，包含至少兩個所述能夠指導或控制對馬鈴薯Y病毒屬，優選地對ZYMV和/或MWMV的抗性的遺傳決定子。
4.根據權利要求1或2所述的植物，包含至少四個所述能夠指導或控制對馬鈴薯Y病毒屬，優選地對ZYMV和MWMV的抗性的遺傳決定子。
5.根據權利要求1到4所述的植物，其中 a.該遺傳決定子與西葫蘆栽培品種268NiW中所存在的相應遺傳決定子互補，該西葫蘆栽培品種268NiW的代表性種子以登錄號NCMB41727保存在NCMB，所述相應遺傳決定子與與標記位點ZN遺傳連鎖，該標記位點與馬鈴薯Y病毒屬抗性性狀共分離，并且可以在PCR中通過用以下寡核苷酸引物對擴增DNA片段將其鑒定:正向引物SEQ ID N0:1和反向引物SEQ ID NO: 2，隨后用SEQ ID NO: 7和/或SEQ ID NO:8進行檢測；和/或 b.該遺傳決定子與西胡戶栽培品種268NiW中所存在的相應遺傳決定子中的兩個互補，該西葫蘆栽培品種268NiW的代表性種子以登錄號NCMB41727保存在NCMB，所述相應遺傳決定子與標記位點Wl和/或W2遺傳連鎖，該標記位點與馬鈴薯Y病毒屬抗性性狀，優選地與一種MWMV抗性性狀共分離，并且可以在PCR中通過用以下寡核苷酸引物對擴增DNA片段將其鑒定:正向引物SEQ ID N0:3和反向引物SEQ ID N0:4，隨后用SEQ ID N0:9和/或SEQ ID NO: 10進行檢測；
和/或正向引物SEQ ID NO:5和反向引物SEQ ID NO:6，隨后對應地用SEQ ID NO: 11和/或SEQ ID NO: 12進行檢測；和/或 c.該遺傳決定子與西葫蘆栽培品種268NiW中所存在的相應遺傳決定子互補，該西葫蘆栽培品種268NiW的代表性種子以登錄號NCMB41727保存在NCMB，所述相應遺傳決定子與標記位點Ni+遺傳連鎖，該標記位點與馬鈴薯Y病毒屬抗性性狀，優選地與一種ZYMV抗性性狀共分離，并且可以在PCR中通過用以下寡核苷酸引物對擴增DNA片段將其鑒定:正向引物 SEQ ID NO: 13 和反向引物 SEQ ID NO: 14，隨后用 SEQ ID NO:15 和 / 或 SEQ ID NO: 16進行檢測。
6.根據權利要求1到5所述的植物，其中 a.該遺傳決定子與西葫蘆栽培品種268NiW中所存在的相應遺傳決定子互補，該西葫蘆栽培品種268NiW的代表性種子以登錄號NCMB41727保存在NCMB，所述相應遺傳決定子與標記位點ZN遺傳連鎖，該標記位點與馬鈴薯Y病毒屬抗性性狀共分離，并且可以在PCR中通過用以下寡核苷酸引物對擴增DNA片段在西葫蘆栽培品種268NiW基因組中將其鑒定:正向引物SEQ ID NO:1和反向引物SEQ ID NO:2，隨后用SEQ ID NO:7和/或SEQ ID NO:8進行檢測；和/或 b.該遺傳決定子與西胡戶栽培品種268NiW中所存在的相應遺傳決定子中的兩個互補，該西葫蘆栽培品種268NiW的代表性種子以登錄號NCMB41727保存在NCMB，所述相應遺傳決定子與標記位點Wl和/或W2遺傳連鎖，該標記位點與馬鈴薯Y病毒屬抗性性狀，優選地與一種MWMV抗性性狀共分離，并且可以在PCR中通過用以下寡核苷酸引物對擴增DNA片段在西葫蘆栽培品種268NiW基因組中將其鑒定:正向引物SEQ ID N0:3和反向引物SEQID NO:4，隨后用 SEQ ID N0:9 和 / 或 SEQ ID NO: 10 進行檢測； 和/或正向引物SEQ ID NO:5和反向引物SEQ ID NO:6，隨后對應地用SEQ ID NO: 11和/或SEQ ID NO: 12進行檢測；和/或 c.該遺傳決定子與西葫蘆栽培品種268NiW中所存在的相應遺傳決定子互補，該西葫蘆栽培品種268NiW的代表性種子以登錄號NCMB41727保存在NCMB，所述相應遺傳決定子與標記位點ZN遺傳連鎖，該標記位點與馬鈴薯Y病毒屬抗性性狀，優選地與一種ZYMV抗性性狀共分離，并且可以在PCR中通過用以下寡核苷酸引物對擴增DNA片段在西葫蘆栽培品種268NiW基因組中將其鑒定:正向引物SEQ ID NO: 13和反向引物SEQ ID NO: 14，隨后用SEQ ID NO: 15 和 / 或 SEQ ID NO: 16 進行檢測。
7.根據權利要求1到5所述的植物，其中 a.該遺傳決定子與標記位點ZN遺傳連鎖，該標記位點與馬鈴薯Y病毒屬抗性性狀，優選地與一種ZYMV抗性性狀共分離，并且可以在PCR中通過用以下寡核苷酸引物對擴增DNA片段在所述植物基因組中將其鑒定:正向引物SEQ ID ΝΟ:1和反向引物SEQ ID NO:2，隨后用SEQ ID NO:7和/或SEQ ID NO:8進行檢測；和/或 b.該遺傳決定子與標記位點Wl和/或W2遺傳連鎖，該標記位點與馬鈴薯Y病毒屬抗性性狀，優選地與一種MWMV抗性性狀共分離，并且可以在PCR中通過用以下寡核苷酸引物對擴增DNA片段在所述植物基因組中將其鑒定:正向引物SEQ ID NO:3和反向引物SEQ IDN0:4，隨后用SEQ ID NO:9和/或SEQ ID NO: 10進行檢測； 和/或正向引物SEQ ID NO:5和反向引物SEQ ID NO:6，隨后對應地用SEQ ID NO: 11和/或SEQ ID NO: 12進行檢測； c.該遺傳決定子與標記位點N i+遺傳連鎖，該標記位點與馬鈴薯Y病毒屬抗性性狀，優選地與一種ZYMV抗性性狀共分離，并且可以在PCR中通過用以下寡核苷酸引物對擴增DNA片段在所述植物基因組中將其鑒定:正向引物SEQ ID NO:13和反向引物SEQ ID N0:14，隨后用SEQ ID NO: 15和/或SEQ ID NO: 16進行檢測。
8.根據權利要求1到7所述的植物，其中該(這些)遺傳決定子是隱性遺傳的并且彼此獨立地分離。
9.根據權利要求1到8所述的植物，其中該植物是南瓜植物。
10.根據權利要求9所述的南瓜植物的種子，該種子能夠生長成一種馬鈴薯Y病毒屬抗性南瓜植物。
11.根據權利要求10所述的種子的用途，用于生長成一種馬鈴薯Y病毒屬抗性南瓜植物。
12.選擇對馬鈴薯Y病毒屬，優選地對ZYMV和MWMV中的至少之一展現抗性的南瓜植物的方法，包括以下步驟: a.鑒定包含至少一個能夠指導或控制對馬鈴薯Y病毒屬的抗性的遺傳決定子的南瓜植物，其中所述遺傳決定子是從西葫蘆栽培品種268NiW的基因組中可獲得的并且與至少一個標記位點遺傳連鎖，該至少一個標記位點與所述馬鈴薯Y病毒屬抗性表型中的至少一種共分離，并且可以在PCR中用包括以下的至少一個PCR寡核苷酸引物對將其鑒定: i.正向引物SEQ ID NO:1和反向引物SEQ ID NO:2，隨后用SEQ ID NO:7和/或SEQID NO:8進行檢測；和/或 i1.正向引物SEQID N0:3和反向引物SEQ ID N0:4，隨后用SEQ ID N0:9和/或SEQID NO: 10進行檢測;和/或 ii1.正向引物SEQID NO:5和反向引物SEQ ID NO:6，隨后用SEQ ID NO: 11和/或SEQ ID NO: 12進行檢測；和/或 iv.正向引物SEQID NO: 13和反向引物SEQ ID NO: 14，隨后用SEQ ID NO: 15和/或SEQ ID NO: 16進行檢測；和/或 V.一種正向和反向引物，能夠鑒定與對馬鈴薯Y病毒屬的抗性共分離的標記位點。
13.根據權利要求12所述的用于選擇對馬鈴薯Y病毒屬，優選地對ZYMV和MWMV中的至少之一展現抗性的南瓜植物的方法，包括以下步驟: a.鑒定包含至少一個能夠指導或控制對馬鈴薯Y病毒屬，優選地對ZYMV和MWMV中的至少之一的抗性的遺傳決定子的南瓜植物，其中所述遺傳決定子是從西葫蘆栽培品種268Niff的基因組中可獲得的并且與至少一個標記位點遺傳連鎖，該至少一個標記位點與所述馬鈴薯Y病毒屬抗性表型中的至少一種共分離，并且可以在PCR中用包括以下的至少一個PCR寡核苷酸引物對將其鑒定: 1.如果該標記位點為ZN，則為正向引物SEQID NO:1和反向引物SEQ ID NO: 2，隨后用SEQ ID NO:7和/或SEQ ID NO:8進行檢測；和/或 i1.如果該標記位點為W1，則為正向引物SEQID NO:3和反向引物SEQ ID N0:4，隨后用SEQ ID NO:9和/或SEQ ID NO: 10進行檢測；和/或 ii1.如果該標記位點為W2，則為正向引物SEQID NO:5和反向引物SEQ ID NO:6，隨后用 SEQ ID NO: 11 和 / 或 SEQ ID NO: 12 進行檢測； iv.如果該標記位點為Ni+，則為正向引物SEQID NO: 13和反向引物SEQ ID NO: 14，隨后用SEQ ID NO: 15和/或SEQ ID NO: 16進行檢測。
14.根據權利要求13所述的方法，其中在步驟a)中選擇的植物包含至少三個能夠指導或控制對馬鈴薯Y病毒屬，優選地對ZYMV和MWMV的抗性的遺傳決定子；并且在步驟c)中選擇的后代對馬鈴薯Y病毒屬，優選地對ZYMV和MWMV展現一種抗性表型，并且其中所述抗性表型與步驟a)的三個標記位點分離。
15.根據權利要求13到14所述的方法，其中在步驟a)中鑒定的南瓜植物是一種根據權利要求1到9所述的植物。
16.根據權利要求14和15所述的方法，包括使在步驟c)中獲得的病毒抗性植物與在步驟b)的易感南瓜植物或中等抗性南瓜植物回交的附加步驟。
17.一種用于產生對馬鈴薯Y病毒屬具有抗性的南瓜的雜種種子的方法，包括 a.種植雄性不育雌性植物和雄性能育植物，其中所述雄性不育雌性植物或雄性能育植物之一是一種根據權利要求1到9中任一項所述的植物， b.在兩個株系之間實現異花授粉， c.使該植物生長直到座果， d.收集這些果實；以及 e.獲得這些雜種種子。
18.一種用于獲得馬鈴薯Y病毒屬抗性南瓜植物的方法，包括a.提供種間非活性胚，該胚是由使權利要求1到10所述的植物與另一植物雜交而獲得的； b.挽救所述胚； c.從步驟c)的所述胚再生出一種植物；以及 d.選擇一種對馬鈴薯Y病毒屬，優選地對ZYMV、MWMV中的至少之一具有抗性的步驟d)的植物。
19.一種能夠指導或控制對馬鈴薯Y病毒屬的抗性的遺傳決定子，其中所述遺傳決定子是從西葫蘆栽培品種268NiW的基因組中可獲得的，其中 a.該遺傳決定子與西葫蘆栽培品種268NiW中所存在的相應遺傳決定子互補，該西葫蘆栽培品種268NiW的代表性種子以登錄號NCMB41727保存在NCMB，所述相應遺傳決定子與標記位點ZN遺傳連鎖，該標記位點與馬鈴薯Y病毒屬抗性性狀，優選地與一種ZYMV抗性性狀共分離，并且可以在PCR中通過用以下寡核苷酸引物對擴增DNA片段將其鑒定:正向引物SEQ ID ΝΟ:1和反向引物SEQ ID NO:2，隨后用SEQ ID NO:7和/或SEQ ID NO:8進行檢測；和/或 b.該遺傳決定子與西胡戶栽培品種268NiW中所存在的相應遺傳決定子中的至少Iv互補，該西葫蘆栽培品種268NiW的代表性種子以登錄號NCMB41727保存在NCMB，所述相應遺傳決定子與標記位點W2遺傳連鎖，該標記位點與馬鈴薯Y病毒屬抗性性狀，優選地與一種MWMV抗性性狀共分離，并且可以在PCR中通過用以下寡核苷酸引物對擴增DNA片段將其鑒定:正向引物SEQ ID NO:5和反向引物SEQ ID NO:6，隨后用SEQ ID NO: 11和/或SEQID NO: 12進行檢測；和/或 c.該遺傳決定子與西葫蘆栽培品種268NiW中所存在的相應遺傳決定子互補，該西葫蘆栽培品種268NiW的代表性種子以登錄號NCMB41727保存在NCMB，所述相應遺傳決定子與標記位點Ni+遺傳連鎖，該標記位點與馬鈴薯Y病毒屬抗性性狀，優選地與一種ZYMV抗性性狀共分離，并且可以在PCR中通過用以下寡核苷酸引物對擴增DNA片段將其鑒定:正向引物 SEQ ID NO: 13 和反向引物 SEQ ID NO: 14，隨后用 SEQ ID NO: 15 和 / 或 SEQ ID NO: 16進行檢測。
20.一種鑒定包含至少一個能夠指導或控制對馬鈴薯Y病毒屬，優選地對ZYMV和MWMV中的至少之一的抗性的遺傳決定子的南瓜植物的方法，其中所述遺傳決定子是從西葫蘆栽培品種268NiW的基因組中可獲得的并且與至少一個標記位點遺傳連鎖，該至少一個標記位點與所述馬鈴薯Y病毒屬抗性表型中的至少一種共分離，并且可以在PCR中用包括以下的至少一個PCR寡核苷酸引物對將其鑒定: . 1.如果該標記位點為ZN，則為正向引物SEQID NO:1和反向引物SEQ ID NO: 2，隨后用SEQ ID NO:7和/或SEQ ID NO:8進行檢測；或 i1.如果該標記位點為W1，則為正向引物SEQID NO:3和反向引物SEQ ID N0:4，隨后用SEQ ID NO:9和/或SEQ ID NO: 10進行檢測；和/或 ii1.如果該標記位點為W2，則為正向引物SEQID NO:5和反向引物SEQ ID NO:6，隨后用SEQ ID NO: 11和/或SEQ ID NO: 12進行檢測；和/或 iv.如果該標記位點為Ni+，則為正向引物SEQID NO: 13和反向引物SEQ ID NO: 14，隨后用SEQ ID NO: 15和/或SEQ ID NO: 16進行檢測。
【文檔編號】A01H5/08GK103501593SQ201280018999
【公開日】2014年1月8日 申請日期:2012年4月18日 優先權日:2011年4月20日
【發明者】M·尼克拉斯, J-L·尼科萊特, M·奧利弗, S·達南 申請人:先正達參股股份有限公司