專利名稱：棉花的基因槍活體快速轉化方法
技術領域：
本發明涉及一種棉花的基因槍活體快速轉化方法。
背景技術：
在迄今發展起來的棉花轉基因技術中，農桿菌介導的遺傳轉化應用最為廣泛。自1987年Umbeck等通過農桿菌介導法成功獲得珂字棉轉基因植株后，農桿菌介導法逐漸成為國際上最普遍的轉化手段，并且取得很大進展。中國農科院棉花研究所成功建立了 20多個棉花品種的高效、穩定的規模化轉化體系，實現了流水線操作，建立了高效、工廠化的棉花轉基因技術體系。盡管農桿菌介導法是理論和實踐都較為完善的一種轉化技術，且已被廣泛用于雙子葉植物的轉化，但該方法受宿主基因型范圍的限制，很多優良品種(系)很難以此法進行轉化，并且轉化程序煩瑣復雜。花粉管通道轉化法雖然沒有基因型、種屬控制，但其轉化技術不太完善，對轉 化機制缺乏系統的研究，常局限于開花期才能應用。因此，需要發展出有效的基因轉化方法。
發明內容
本發明的一個目的是提供一種對棉花進行基因轉化的方法。本發明所提供的對棉花進行基因轉化的方法，包括如下步驟:(I)利用基因槍轟擊的方法，將子彈轟入父本棉花的花粉中；所述子彈中含有外源基因;(2)將基因槍轟擊后的父本花粉授粉到活體母本棉花中；(3)授粉后的母本棉花所結的種子便是轉基因棉花種子，實現了棉花的基因轉化。上述方法中，所述步驟(I)中，所述父本棉花的花粉是先從父本棉花中收集下來再進行基因槍轟擊的。上述方法中，所述基因槍轟擊的方法為:將0.2-0.5克花粉均勻鋪至花粉槽底部，然后進行基因槍轟擊，基因槍的轟擊參數為30Psi (轟擊壓力)+6cm (轟擊距離)。上述方法中，所述子彈按照如下方法制備: 將30mg金粉與500 μ I水混合，得到金粉懸浮液；將100 μ I金粉懸浮液與10 μ I濃度為lmg/ml的插入外源基因的載體溶液混合，得到金粉與基因的混合液；向金粉與基因的混合液中逐滴加入40 μ 10.1mol / L亞精胺，并混勻，逐滴加入100 μ 12.5mol/L CaCl2,混勻；離心,去上清,收集沉淀；向所述沉淀中加入200 μ I無水乙醇重懸，離心，去上清，收集沉淀；向所述沉淀中加入100 μ I無水乙醇，得到基因槍轟擊子彈。上述方法中，所述基因槍轟擊中，每槍使用10μ I子彈。上述方法中，所述基因槍為美國wealtec的型號為⑶S_80的基因槍。本發明方法無需組織培養步驟，直接在活體棉花上便實現基因轉化。而且本發明方法通過第三代便攜式基因槍和優化轉化的參數使活體轉化時對花蕾和花粉形成微創傷，大大縮短了獲得轉基因植株的周期。本發明方法實用、易操作、不依賴組織培養、穩定性好。
具體實施例方式下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。實施例、1、含有外源基因的重組載體的制備外源基因是GhTrx基因。含有外源基因的重組載體的構建:用Xma I和BamH I酶切載體pBI121，收集載體大片段；將載體大片段和基因片段用T4連接酶進行連接，得到重組載體。2、基因槍子彈制備:金粉處理(I)取30mg金粉置于離心管中，加入lml70%乙醇，充分振蕩3 — 5min,靜置15min，(2)以 12000rpm 離心 30s，去上清，(3)加入Iml無菌水重懸以12000rpm離心5s,去上清，(4)重復上述步驟5-7次，將金粉懸浮于500 μ I無菌蒸餾水中，置4°C或室溫下儲存。DNA的處理(I)取100 μ I金粉懸浮液，加入10 μ I的質粒DNA (lmg/ml)溶液。(2)0.1mol / L亞精胺(所用的溶液經無菌消毒)、2.5mol/L CaCl2和無水乙醇冰浴。逐滴加入40 μ 10.1mol / L亞精胺，并混勻。逐滴加入100 μ 12.5mol/L CaCl2，振蕩Imin0(3)以12000rpm離心30s，去上清，加入200 μ I無水乙醇重懸金粉，振蕩30s，以12000rpm離心30s,去上清。(4)加入100 μ I無水乙醇重懸金粉，可供10槍(每槍10 μ I)使用。3、基因槍轟擊基因槍為美國wealtec的基因槍⑶S-80。安裝氣罐并對氣罐和壓力調節表之間漏氣檢測、壓力調節表和⑶S-80連接管之間漏氣檢測多次漏氣檢測后，確保連接緊密，從而進行實驗。(I)父本棉花為中H177。收集父本棉花的花粉。(2)每次轟擊花粉量0.2-0.5克，將花粉薄薄的均勻至于花粉槽底部。便攜式基因槍轟擊花粉參數為30Psi+6cm (轟擊出來的氣體面積覆蓋花粉槽，保證95%花粉被轟擊)。
(3)母本棉花為中H177。將轟擊后的花粉授粉到活體母本棉花，并統計結鈴數。(4)收獲T。代種子。(5)收獲Ttl代種子后種植于溫室，3葉期后用卡納篩選，選擇具有抗卡那的植株，再取樣進行分子鑒定，分子鑒定選擇PBI121特異啟動子篩選引物(35S-F1:GCTCCTACAAATGCCATCATTGC,35S-R1:GATAGTGGGATTGTGCGTCATCCC)。結果，卡那篩選陽性且分子鑒定也為陽性的種子數為168粒。本發明方法的轉化效率為6%。轉化效率=陽性種子數/所有用于檢測的種子數。用棉花YU2067和 棉花H19進行試驗，也得到了類似的轉化效率。使用其它外源基因進行試驗，也得到了類似的轉化效率。
權利要求
1.一種對棉花進行基因轉化的方法，包括如下步驟: (1)利用基因槍轟擊的方法，將子彈轟入父本棉花的花粉中；所述子彈含有外源基因； (2)將基因槍轟擊后的父本花粉授粉到活體母本棉花中； (3)授粉后的母本棉花所結的種子便是轉基因棉花種子，實現了棉花的基因轉化。
2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于:所述步驟(I)中，所述父本棉花的花粉是先從父本棉花中收集下來再進行基因槍轟擊的。
3.根據權利要求2所述的方法，其特征在于:所述基因槍轟擊的方法為:將0.2-0.5克花粉均勻鋪至花粉槽底部，然后進行基因槍轟擊，基因槍的轟擊參數為30Psi+6cm。
4.根據權利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于:所述子彈按照如下方法制備: 將30mg金粉與500 μ I水混合，得到金粉懸浮液； 將100 μ I金粉懸浮液與10 μ I濃度為lmg/ml的含有外源基因的載體溶液混合，得到金粉與基因的混合液； 向金粉與基因的混合液中逐滴加入40 μ 10.1mol / L亞精胺溶液，并混勻，逐滴加入100 μ 12.5mol/L CaCl2溶液，混勻；離心，去上清，收集沉淀； 向所述沉淀中加入200 μ I無水乙醇重懸，離心，去上清，收集沉淀； 向所述沉淀中加入1 00 μ I無水乙醇，得到基因槍轟擊子彈。
5.根據權利要求 1-4中任一所述的方法，其特征在于:所述基因槍轟擊中，每槍使用10 μ I子彈。
全文摘要
本發明涉及一種棉花的基因槍活體快速轉化方法。該方法包括如下步驟(1)利用基因槍轟擊的方法，將含有外源基因的載體轟入父本棉花的花粉中；(2)將基因槍轟擊后的父本花粉授粉到活體母本棉花中；(3)授粉后的母本棉花所結的種子便是轉基因棉花種子，實現了棉花的基因轉化。本發明方法無需組織培養步驟，直接在活體棉花上便實現基因轉化。而且本發明方法通過第三代便攜式基因槍和優化轉化的參數使活體轉化時對花蕾和花粉形成微創傷，大大縮短了獲得轉基因植株的周期。本發明方法實用、易操作、不依賴組織培養、穩定性好。
文檔編號A01H1/02GK103070067SQ20131004620
公開日2013年5月1日 申請日期2013年2月5日 優先權日2013年2月5日
發明者葉武威, 王德龍, 陰祖軍, 王俊娟, 王帥, 樊寶香, 王桂峰, 孔靜靜, 宋貴方, 張德超, 陸許可 申請人:中國農業科學院棉花研究所