專利名稱：提高黃瓜子葉節離體再生及轉化率的方法
技術領域：
本發明涉及植物基因工程，特別涉及一種通過篩選黃瓜最優苗態做外植體，提高黃瓜子葉節離體再生和轉化率的方法。
背景技術：
黃瓜(Cucumis sativus L.),為葫蘆科(Cucurbitaceae)甜瓜屬，一年生蔓生或攀援草本植物。其果實食用方便，脆嫩多汁，風味獨特，果菜兼用，營養價值極高，甚至可用于美容，深受現代人喜愛。近年來，黃瓜育種目標集中在品質、抗逆和抗病蟲方面，以提高單位面積產量而獲取更大的經濟效益。由于黃瓜遺傳基礎狹窄，存在遠緣雜交障礙，因此利用基因工程技術將是今后黃瓜品種改良的有效手段。此外，因黃瓜花性型分化多樣，黃瓜已逐漸成為研究植物性型分化的模式材料。當前，越來越多的研究者加入到黃瓜分子育種和以黃瓜為研究材料的相關分子生物學研究領域。尤其是黃瓜基因組測序的完成，加速了黃瓜分子育種和相關分子生物學研究的進程，而植物基因工程則是進行上述研究的核心手段。目前，植物上一般采取以農桿菌介導的遺傳轉化系統進行轉基因操作，因此，成熟且穩定的植物組織離體再生培養和遺傳轉化體系成為利用植物基因工程進行遺傳改良和分子育種的瓶頸。黃瓜的離體再生培養和遺傳轉化研究始于1979年，影響黃瓜再生及遺傳轉化的因素諸多，包括基因型、外植體類型、苗態、植物生長調節劑、農桿菌菌株及活性、外力(如超聲波的使用)、酚類物質的使用、預培養時間、侵染時間、共培養時間、芽誘導的選擇壓、生根選擇壓等。目前，研究者已對黃瓜子葉、子葉節、真葉、下胚軸、胚根等進行了再生植株的研究，但仍存在出芽率、再生率和轉化率低下等一系列問題，嚴重阻礙了植物基因工程在黃瓜分子遺傳改良上的應用。趙軍良[1996，山西農業科學，黃瓜子葉組織培養再生植株]對六個黃瓜品種的子葉和下胚軸(培養基為BA 和NAA的MS培養基)進行了研究，結果發現子葉基部能直接分化出不定芽，而子葉的上部分則不能再生，下胚軸也不能分化，認為最適宜的黃瓜外植體為子葉節。侯愛菊[2003，園藝學報，誘導黃瓜直接器官發生主要影響因素的研究]和杜勝利[2000，天津農業科學，苗齡、基因型和外植體類型對黃瓜離體器官發生的影響]等也得到類似結果。在黃瓜子葉節離體再生系統中，ABA與激動素相配合可促進植株分化。Sekioka等研究表明在黃瓜的組織培養中，低濃度ABA可促進胚狀體的正常發育[1981，Hort Science Differentiation in callus culture of cucumber(Cucumis sativusL.)]，控制胚狀體處于球形胚或球形胚后期[陳崢等，2001，天津農業科學，提高黃瓜農桿菌遺傳轉化體系再生頻率的研究]。在植物組織培養過程中，細胞生長會產生并累積乙烯，進而影響細胞的分化，硝酸銀中Ag+為乙烯活性抑制劑，能競爭性地結合于乙烯作用部位，減輕了乙烯的作用，從而促進植物器官發生和體細胞胚胎發生[Mohiuddin A K M，1997，Plant Cell,Tissue and Organ Culture,Influences of silver nitrate oncucumber invitro shoot regeneration ;高武軍,2002,中國農學通報,硝酸銀在油菜基因轉化中的影響作用]。曹利仙等研究表明，AgNO3能顯著地提高黃瓜芽再生頻率，以2.0mg/L AgNO3效果最為明顯[2001，甘肅農業大學學報，硝酸銀對黃瓜離體子葉培養芽再生的促進效應]。外植體的大小是影響子葉節再生頻率的重要內在因素之一。外植體大小研究方面主要以苗齡為依據，認為最佳苗齡為l-7d的均有報道，由于同樣苗齡的外植體，其生理狀態并不相同，且一般情況下黃瓜種子的發芽率和發芽勢也有差異，所以采用不同苗態黃瓜子葉節更趨合理。
發明內容
本發明的目的，是為了提供一種提高黃瓜子葉節離體再生及轉化效率的方法，研究不同苗態對黃瓜遺傳轉化效率的影響情況，篩選出對黃瓜遺傳轉化最有利的苗態，及再生率高的最優培養基，豐富黃瓜離體再生體系，為今后黃瓜遺傳轉化體系的建立提供理論和技術基礎。本發明所采取的技術方案如下:—種提高黃瓜子葉節離體再生及遺傳轉化率的方法，包括以下步驟:(I)選擇兩片子葉剛脫離種殼的黃瓜子葉節為外置體；(2)在步驟(I)所得黃瓜子葉節基部輕輕劃上傷口 ；(3)將步驟(2)所得黃瓜子葉節接到芽誘導培養基中培養，該芽誘導培養基由MS培養基與6-BA、ABA、AgNO3配制而成，其中6-BA的濃度為1.5mg/L, ABA的濃度為0.5mg/L,AgNO3 的濃度為 2.0mg/L ；(4)將黃瓜子葉節接到芽誘導培養基后，經過芽誘導、伸長、生根，最后獲得完整植株。上述方法中，所述MS培養基為含5.8g/L瓊脂、30g/L蔗糖的培養基，pH為5.8。本發明以黃瓜子葉節作為外植體，研究了不同苗態對黃瓜離體再生及轉化效率的影響，包括苗態的篩選、不同苗態下的gus瞬時表達、植物生長調節劑(在本方法中為芽誘導培養基)配比的優化。具體按下列步驟進行:1、苗態的篩選4種苗態定義為:⑴、子葉脫殼1/2-2/3 ；⑵、兩片子葉剛脫離種殼；(3)、下胚軸直立，但子葉未展平；(4)、兩片子葉初展平(參見圖1)。剪下帶l_2mm葉柄的子葉，每片子葉斜切去除生長點，并切除子葉上半部分的1/3-1/2，將子葉節近軸面朝上75度角斜插入芽誘導培養基中(MS+1.5mg/L 6-BA+1.5mg/L ABA+2.0mg/LAgN03)，每2周繼代I次，待出芽后統計出芽外植體數、芽數，據此結果篩選出最優苗態。2、不同苗態下的gus瞬時表達將萌發到不同苗態的子葉切割，近柄端子葉節分別進行三種處理:(I)不劃傷口 ；
(2)輕輕地劃傷口 ；(3)較重地劃傷口。之后接到芽誘導培養基上預培養ld，之后用含有pCAMBIA2301-gus表達載體的菌液(OD6tltl = 0.3-0.6)侵染20min，結束后轉至共培養培養基上(芽誘導培養基+50 u mol/L乙酰丁香酮)培養3d，結束后將外植體轉至含有卡那霉素(Kan)的芽誘導培養基(添加300mg/L特美汀以抑制農桿菌的生長)中選擇培養，5d后，gus染色檢測其瞬時表達率,確定最優預培養時間。gus染色方法:先將外植 體置于染色液(100mmol/L磷酸鈉緩沖液,2mmol/LX_glue,2mmol/L鐵氰化鉀溶液，2mmol/L亞鐵氰化鉀溶液,0.5% (V/V)TritonX-100)中染色過夜，倒去染色液，加入丙酮:乙醇(I: 2，V/V)混合液中脫色過夜，解剖鏡下觀察染色情況并拍照。3、植物生長調節劑配比的優化以篩選的最佳苗態的子葉節為外植體進行切割，近軸面朝上75度角斜插入添加不同濃度6-BA (6-芐氨基腺嘌呤)和ABA (脫落酸)的MS培養基中(含5.8g/L瓊脂，30g/L蔗糖，pH 5.8，下同)，添加適量AgNO3 (2.0mg/L AgNO3可顯著提高芽再生頻率)進行芽誘導。6-BA 設 3 個濃度梯度(1.0、1.5、2.0mg/L) ,ABA 設 4 個濃度梯度(0.5、2.0、1.5、2.0mg/L)，雙因素互作，共12個處理組合。將外植體接到含6-BA和ABA的誘導培養基上，每2周繼代I次，待出芽后統計出芽外植體數、芽數，根據結果選出優化培養基配方。待芽長至l_2cm時，將其切下接到1/2MS培養基至根部發達，計算從接種至獲得完整植株所需時間。4、誘導率與平均出芽數的計算誘導率=出芽外植體數/外植體散X 100% ；平均出芽數=總芽數/出芽外植體數。全部數據采用SPSS 14.0 for Windows軟件進行LSD統計分析。本發明的方法提供了提高黃瓜子葉節再生及轉化效率的最佳苗態和芽誘導培養基，優化了黃瓜S52的子葉節再生體系，方法簡單、易操作；同時培養出來的不定芽數目多、質量好、健壯、玻璃化低，再生率高，再生周期短。為黃瓜遺傳轉化和分子改良提供了堅實的技術支撐，對利用現代基因工程技術創新黃瓜種質和新品種將具有重要的現實意義。
圖1是四種苗態，其中，(I)號苗態為子葉脫殼1/2-2/3 ; (2)號苗態為兩片子葉剛脫離種殼；(3)號苗態為下胚軸直立，但子葉未展平；(4)號苗態為兩片子葉初展平。
具體實施例方式下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。這些實施例僅用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍。1、無菌苗的獲得黃瓜S52為華南品種，雌雄異花同株，取籽粒飽滿且均勻的黃瓜種子，在清水中室溫浸泡30min至lh，然后在超凈工作臺內用70%乙醇浸泡30s，再用1% NaClO溶液消毒IOmin,無菌水沖洗3-5次(每次3min)，之后在無菌水中浸泡4_5h，平鋪于1/2MS培養基上，每瓶接15粒種子，培養溫度25±1°C，黑暗條件下培養至種子露白后轉至光下培養、萌發。培養溫度25±1°C，光照時間16h，光照強度20001x。2、不同苗態對黃瓜子葉節再生的影響4種苗態定義為:⑴、子葉脫殼1/2-2/3 ；⑵、兩片子葉剛脫離種殼；(3)、下胚軸直立，但子葉未展平；(4)、兩片子葉初展平。每個處理組合20個外植體，共3次重復。剪下帶l_2mm葉柄的子葉，每片子葉斜切去除生長點，并切除子葉上半部分的1/3-1/2，將子葉節近軸面朝上75度角斜插入芽誘導培養基中(MS+1.5mg/L6-BA+l.5mg/LABA+2.0mg/L AgNO3)，每2周繼代I次，待出芽后統計出芽外植體數、芽數，如表I所示，據此結果篩選出最優苗態。從表I可看出，不同苗態的黃瓜外植體叢生芽誘導率不同，黃瓜外植體過小或過大時的再生頻率及平均每塊外植體出芽數均較低。(I)至(3)苗態的子葉節均能高頻誘導出不定芽，其中苗態(2)時的再生頻率及每塊外植體再生芽數最高，再生頻率高達100%，平均出芽數達到4.13，顯著高于其他苗態。苗態(4)時的誘導率(48.33% )及每塊外植體再生芽數(0.48)最低，顯著低于其他苗態。綜上所述，選擇苗態(2)的子葉節為最佳外植體苗態。表I不同苗態外植體對黃瓜子葉節再生的影響
權利要求
1.一種提高黃瓜子葉節離體再生及遺傳轉化率的方法，包括以下步驟: (1)選擇兩片子葉剛脫離種殼的黃瓜子葉節為外置體； (2)在步驟(I)所得黃瓜子葉節基部輕輕劃上傷口； (3)將步驟(2)所得黃瓜子葉節接到芽誘導培養基中培養，該芽誘導培養基由MS培養基與6-BA、ABA、AgNO3配制而成，其中6-BA的濃度為1.5mg/L,ABA的濃度為0.5mg/L, AgNO3的濃度為2.0mg/L ； (4)將黃瓜子葉節接到芽誘導培養基后，經過芽誘導、伸長、生根，最后獲得完整植株。
2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述MS培養基為含5.8g/L瓊脂、30g/L蔗糖的培養基，pH為 5.8。
全文摘要
一種提高黃瓜子葉節離體再生及轉化率的方法，包括以下步驟(1)選擇兩片子葉剛脫離種殼的黃瓜子葉節為外置體；(2)在黃瓜子葉節基部輕輕劃上傷口；(3)將黃瓜子葉節接到芽誘導培養基中培養；(4)經過芽誘導、伸長、生根，最后獲得完整植株。本發明的方法提供了提高黃瓜子葉節再生及轉化效率的最佳苗態和芽誘導培養基，優化了黃瓜S52的子葉節再生體系，方法簡單、易操作；同時培養出來的不定芽數目多、質量好、健壯、玻璃化低，再生率高，再生周期短。為黃瓜遺傳轉化和分子改良提供了堅實的技術支撐，對利用現代基因工程技術創新黃瓜種質和新品種將具有重要的現實意義。
文檔編號A01H4/00GK103098714SQ201310064149
公開日2013年5月15日 申請日期2013年2月28日 優先權日2013年2月28日
發明者蔡潤, 別蓓蓓, 潘俊松, 何歡樂 申請人:上海交通大學