專利名稱：東北紅豆杉開放式簡化培養基的制作方法
技術領域：
本發明屬于植物組織培養工廠化育苗培養基技術領域，涉及一種東北紅豆杉開放式簡化植物組織培養基。
背景技術：
目前，雖然已經有上千種植物的組織培養取得了成功，但能真正用于商品化生產的植物種類不多。常規的封閉式組培有許多局限，如:配制培養基所用化學藥品種類繁多，用量多，要求精細，價格昂貴，組織培養過程中對設備要求嚴格，并且要求嚴格的滅菌條件，導致耗電量較大，生根方法煩瑣，且有的組培苗生根很難，移栽適應能力差，成活率低等問題使組培成本大大提高，甚至導致試管苗比普通苗價格高幾倍甚至幾十倍的成本，廣大種植者無力購買，試管苗銷售量下降，嚴重限制了該技術的擴大和推廣，致使許多品種沒有得到開發利用。針對以上問題，我們開展了開放式植物簡化組織培養技術研究，具有重要的現實意義。
發明內容
本發明要解決的技術問題是提供一種成本低、初培芽誘導及萌動效果好，繼代苗增殖率高，芽的平均伸長量大的東北紅豆杉開放式簡化培養基。為了解決上述技術問題，本發明的東北紅豆杉開放式簡化培養基包括初代培養基和繼代培養 基；所述初代培養基通過在優化的B5基礎母液中加入卡拉膠、白砂糖、吲哚丁酸IBA、活性炭AC和農用鏈霉素混合制成；混合液中卡拉膠濃度為6 10g/L,白砂糖濃度為20 30g/L，吲哚丁酸IBA濃度為2.5 5.0mg/L,活性炭AC濃度為0.5 2.5g/L，農用鏈霉素濃度為0.10 0.50g/L ；所述優化的B5基礎母液中，無機鹽組成如下:KN03:1500-3000mg/L ；MgS04.7H20:250-500mg/L ；CaC12.2H20:100-150mg/L ；(NH4) 2S04:70-134mg/L ；NaH2P04.H20:75-150mg/L ;其余成分及使用濃度與標準 B5 培養
基相同；所述繼代培養基通過在優化的MS基礎母液中加入卡拉膠、白砂糖、吲哚丁酸IBA、6-卞氨基腺嘌呤BA、活性炭AC和農用鏈霉素混合制成；混合液中卡拉膠濃度為8 IOg/L,白砂糖濃度為20 30g/L，吲哚丁酸IBA濃度為1.0 3.0mg/L, 6-卞氨基腺嘌呤BA濃度為0.03 1.00mg/L,活性炭AC濃度為0.5 2.5g/L，農用鏈霉素濃度為0.10 0.50g/L ；所述優化的MS基礎母液中，無機鹽組成如下:硝酸鉀KN03:950-1900mg/L ;硝酸銨 NH4N03:825-1650mg/L ;磷酸二氫鉀 KH2P04:85-170mg/L ;硫酸鎂 MgS04.7H20:185-370mg/L ;氯化鈣 CaC12.2H20:220_440mg/L，其余
成分及使用濃度與標準MS培養基相同。
所述優化的B5基礎母液中，無機鹽組成優選如下:KN03:1500-1550mg/L ；MgS04.7H20:250-270mg/L ；CaC12.2H20: 100-1lOmg/L ；(NH4) 2S04:70-80mg/L ；NaH2P04.H20:75-85mg/L ;其余成分及使用濃度與標準B5培養基相同。所述優化的MS基礎母液中，無機鹽組成優選如下:硝酸鉀KN03:950-1000mg/L ;硝酸銨 NH4N03:825-850mg/L ;磷酸二氫鉀 KH2P04:85-90mg/L ;硫酸鎂 MgS04.7H20:185-190mg/L ;氯化鈣 CaC12.2H20:220_230mg/L，其余成分及使用濃度與標準MS培養基相同。本發明的東北紅豆杉組織培養方法包括下述步驟:初代培養:取當年生半木質化2_6cm的莖尖作為外植體，接種于塑料杯的初代培養基中，用透氣膜封口 ；接種后，將接種杯置于人工氣候箱中，溫度25 ± I °C、濕度80 85%、光照強度1700— 20001uX，光暗交替12h/12h，培養15天后獲得初培苗；繼代培養:取初培苗接種于塑料杯的繼代培養基中，用透氣膜封口 ；接種后，將接種杯置于人工氣候箱中，溫度25±1°C、濕度80 85%、光照強度1700— 20001UX，光暗交替12h/12h，培養 35-40 天。有益效果:初代培養基中添加0.1%活性炭可以使初代培養芽的萌動時間從13d降為6d，大大降低了初代培養的時間，抑制了褐化現象，可以使初代培養周期縮短一周，提高了成活率，降低了生產成本。初代培養基和繼代培養基當中添加了抑菌劑農用鏈霉素，對真菌和細菌均有良好的抑制作用，真菌和細菌污·染率均能保持在5%以下，配制好的培養基不需要高壓滅菌，簡化了生產程序，降低了生產成本。初代培養和繼代培養均采用塑料杯代替三角瓶，透氣膜和塑料杯可再利用，降低了成本；新開封的塑料杯不需要消毒滅菌處理，可以直接利用，簡化了操作程序；塑料杯無副作用，更有利于苗的生長；初代培養，雖然愈傷組織誘導率差異不顯著，但芽萌動率顯著提高；繼代培養，增殖率及芽平均伸長高度均顯著高于三角瓶；由于塑料杯內濕度較低，溫度與外界環境溫度基本處于平衡，不利于雜菌的滋生，因而塑料杯培養基不易發生污染，利于開放式簡化組培的進行。除各種營養元素母液采用蒸餾水配置以外，其余均可采用自來水代替蒸餾水，從而間接簡化了培養程序及成本。我們采用開放式簡化組培優勢:由于基礎母液中大量元素減半，卡拉膠代替瓊脂粉，白砂糖代替蔗糖，IBA取替NAA和BA，塑料杯代替玻璃瓶，自來水代替蒸餾水，抑菌劑代替高壓滅菌和嚴格封閉環境操作。所以，接種速度為封閉式組培的3-5倍，明顯節省了培養基成本和接種時間，省略了高壓滅菌程序，簡化了生產流程，可以使在工廠化育苗中減少人力和設備投資。節約資金30-50%。初代培養基采用白砂糖作為作為碳源，在對初培芽愈傷組織誘導及芽萌動不產生影響的基礎上，降低了成本；繼代培養基采用白砂糖代替蔗糖作為碳源，在增殖率及芽平均伸長高度不受影響的前提下降低了成本。當優化的B5基礎母液無機鹽的含量為B5培養基中無機鹽含量的一半左右，優化的MS基礎母液無機鹽的含量為MS培養基中無機鹽含量的一半時，在對初培芽愈傷組織誘導、芽萌動、增殖率及芽平均伸長高度不產生影響的基礎上，顯著降低了成本。
具體實施例方式實施例1根據表1、表2配制初代培養基:a、根據表I中無機鹽的使用濃度和標準B5培養基中其他成分的使用濃度配制優化的B5基礎母液,分裝于I號、2號、......、7號燒杯中。b、將吲哚丁酸IBA和農用鏈霉素加入各燒杯中與優化的B5基礎母液混合至所需濃度。C、取一定量自來水(代替蒸餾水)煮沸，用電子天平秤取卡拉膠及糖，將卡拉膠倒
入沸水中煮化，定容至1L,接著倒入白砂糖,溶化后,取卡拉膠液分裝在I號、2號、.......7號燒杯中。分裝后，攪拌均勻。d.用分析天平稱量活性炭加入I號、2號........7號燒杯，當液體溫度降低至
60°C以下時在各燒杯中加入農用鏈霉素，用玻璃棒攪拌均勻，得到初代培養基；然后將各燒杯置于無菌超凈臺下。e.在超凈臺下將I號、2號........7號燒杯中配好初代培養基分別裝入I號、2
號........7號塑料杯中(新開封的不需要消毒)，每杯50mL，晾涼，凝固后用透氣膜封口，備
用。 根據表3、表4配制繼代培養基:a、根據表4中無機鹽的使用濃度和標準MS培養基中其他成分的使用濃度配制優化的MS基礎母液,分裝于6號、7號、......>12號燒杯中。b、將吲哚丁酸IBA，6-卞氨基腺嘌呤BA，農用鏈霉素加入各燒杯中與優化的MS基礎母液混合至所需濃度。C、其余成分按照與初代培養基相同的方法加入各燒杯中與優化的MS基礎母液混
合均勻，最后在超凈臺下分別裝入6號、7號、......、12號塑料杯中，每杯50mL,晾涼,凝固
后用透氣膜封口，備用。實施例2外植體的制備:試驗前一天取當年生半木質化2-3cm的莖尖，用流水沖洗12_24小時；在超凈臺下操作，用70%酒精將桌面及手擦拭干凈，點燃酒精燈。 將清洗好的半木質化莖尖在無菌超凈臺下進行消毒，用75%的酒精消毒30 60s，接著用0.1%升萊(HgCl2)消毒7 8min,消毒后用無菌水(高壓滅菌的自來水)沖洗4 5次，再用無菌濾紙(高壓滅菌的濾紙)吸干表面水潰。將手術刀、鑷子在酒精燈外沿灼燒，蘸95%的酒精，反復3遍(大概持續3min)，晾涼后，用手術刀將消過毒的半木質化莖尖于滅過菌的培養皿上將其基部Icm處葉片切掉，同時切除因消毒而被腐蝕的切口處，外植體制備完畢。實施例3外植體接種及培養
初代培養:在無菌超凈臺下酒精燈旁進行接種，用已殺過菌的鑷子將制備好的外植體接種于各塑料杯的初代培養基中，每杯3 4個外植體,每接種一瓶用已消過毒的透氣膜封口。接種后，將接種杯置于人工氣候箱中，各接種杯所處環境參數如下:培養條件:溫度26°C、濕度85%、光照強度20001ux，光暗交替12h/12h。初代培養15天后，對各塑料杯中的芽萌動及愈傷組織誘導狀況進行統計(實驗數據見表2。繼代培養:在無菌超凈臺下酒精燈旁進行接種，用已殺過菌的鑷子將初代培養獲得的生長狀況相近的小苗作為材料接種于各塑料杯的繼代培養基中，每接種一瓶用已消過毒的透氣膜封口。接種后，將接種杯置于人工氣候箱中，各接種杯環境參數與初代培養相同。繼代培養35天后，對各塑料杯中的增值率及芽平均生長高度狀況進行統計(實驗數據見表4)。表I初代培養無機鹽簡化方案B權利要求
1.一種東北紅豆杉開放式簡化培養基，包括初代培養基和繼代培養基； 所述初代培養基通過在優化的B5基礎母液中加入卡拉膠、白砂糖、吲哚丁酸IBA、活性炭AC和農用鏈霉素混合制成；混合液中卡拉膠濃度為6 10g/L,白砂糖濃度為20 30g/L,吲哚丁酸IBA濃度為2.5 5.0mg/L,活性炭AC濃度為0.5 2.5g/L，農用鏈霉素濃度為 0.10 0.50g/L ； 所述優化的B5基礎母液中，無機鹽組成如下:KN03:1500-3000mg/L ；MgS04.7H20:250-500mg/L ；CaC12.2H20:100-150mg/L ；(NH4) 2S04:70-134mg/L ；NaH2P04.H20:75-150mg/L ;其余成分及使用濃度與標準 B5 培養基相同； 所述繼代培養基通過在優化的MS基礎母液中加入卡拉膠、白砂糖、吲哚丁酸IBA、6-卞氨基腺嘌呤BA、活性炭AC和農用鏈霉素混合制成；混合液中卡拉膠濃度為8 10g/L，白砂糖濃度為20 30g/L，吲哚丁酸IBA濃度為1.0 3.0mg/L, 6-卞氨基腺嘌呤BA濃度為0.03 1.00mg/L,活性炭AC濃度為0.5 2.5g/L，農用鏈霉素濃度為0.10 0.50g/L ； 所述優化的MS基礎母液中，無機鹽組成如下: 硝酸鉀 KN03:950-1900mg/L ；硝酸銨 NH4N03:825-1650mg/L ;磷酸二氫鉀 KH2P04:85-170mg/L ;硫酸鎂 MgS04.7H20:185-370mg/L ;氯化鈣 CaC12.2H20:220_440mg/L，其余成分及使用濃度與標準MS培養基相同。
2.根據權利要求1所述的東北紅豆杉開放式簡化培養基，其特征在于所述優化的B5基礎母液中，無機鹽組成如下:KN03:1500- 1550mg/L ；MgS04.7H20:250-270mg/L ；CaC12.2H20:100-110mg/L ；(NH4) 2S04:70-80mg/L ；NaH2P04.H20:75-85mg/L ;其余成分及使用濃度與標準B5培養基相同。
3.根據權利要求2所述的東北紅豆杉開放式簡化培養基，其特征在于所述優化的B5基礎母液中，無機鹽組成如下:KN03:1500mg/L ；MgS04.7H20:250mg/L ；CaCl2.2H20:100mg/L ； (NH4) 2S04:70mg/L ；NaH2P04.H20:75mg/L ;其余成分及使用濃度與標準B5培養基相同。
4.根據權利要求1所述的東北紅豆杉開放式簡化培養基，其特征在于所述優化的MS基礎母液中，無機鹽組成如下: 硝酸鉀 KN03:950-1000mg/L ；硝酸銨 NH4N03:825-850mg/L ;磷酸二氫鉀 KH2P04:85-90mg/L ;硫酸鎂 MgS04.7H20:185-190mg/L ;氯化鈣 CaC12.2H20:220_230mg/L，其余成分及使用濃度與標準MS培養基相同。
5.根據權利要求4所述的東北紅豆杉開放式簡化培養基，其特征在于所述優化的MS基礎母液中，無機鹽組成如下: 硝酸鉀 KN03:950mg/L ;硝酸銨 NH4N03:825mg/L ;磷酸二氫鉀 KH2P04:85mg/L ;硫酸鎂MgS04.7H20:185mg/L ;氯化鈣CaC12.2H20:220mg/L,其余成分及使用濃度與標準MS培養基相同。
全文摘要
本發明涉及一種東北紅豆杉開放式簡化培養基，該培養基包括初代培養基和繼代培養基；所述初代培養基通過在優化的B5基礎母液中加入卡拉膠、白砂糖、吲哚丁酸IBA、活性炭AC和農用鏈霉素混合制成；繼代培養基通過在優化的MS基礎母液中加入卡拉膠、白砂糖、吲哚丁酸IBA、6-卞氨基腺嘌呤BA、活性炭AC和農用鏈霉素混合制成。本發明采用開放式簡化組培，用抑菌劑代替高壓滅菌和嚴格封閉環境操作，明顯節省了培養基成本和接種時間，省略了高壓滅菌程序，簡化了生產流程，可以使在工廠化育苗中減少人力和設備投資，節約資金30-50%。
文檔編號A01H4/00GK103238522SQ201310204499
公開日2013年8月14日 申請日期2013年5月28日 優先權日2013年5月28日
發明者王淑杰, 劉麗麗, 袁麗娜, 于海業, 鐘香梅, 李純, 牛海微, 戶新宇, 張蕾, 姚寧寧, 隋媛媛, 趙靜 申請人:吉林大學