一種利用棉酚降低昆蟲介體內植物病毒攜帶率的方法
【專利摘要】本發明公開了一種利用棉酚降低煙粉虱體內番茄黃化曲葉病毒攜帶率的方法。針對尚未有降低煙粉虱體內番茄黃化曲葉病毒攜帶率以提高控病效果的問題，利用棉酚處理煙粉虱，可明顯降低害蟲體內番茄黃化曲葉病毒的攜帶率，從而減少了煙粉虱傳播病毒的機會，有利于提高病害控制效果。同生產上傳統的番茄黃化曲葉病防控主要利用抗病蟲品種、化學或物理手段控制煙粉虱數量、用病毒拮抗劑控制病毒等手段相比，本技術利用棉酚降低煙粉虱體內植物病毒攜帶率，從而提高控病毒效果，不僅控害方式新穎，而且安全性高，將具有一定的應用前景。
【專利說明】一種利用棉酚降低昆蟲介體內植物病毒攜帶率的方法
一、【技術領域】
[0001]本發明屬于病蟲害防治【技術領域】，具體涉及一種利用棉酚降低煙粉虱體內番茄黃化曲葉病毒攜帶率的方法。
二、技術背景
[0002]煙粉虱Bemisia tabaci是一種世界性害蟲，其一方面刺吸作物造成直接為害，另一方面傳播植物病毒，造成病毒病的大流行，給農業生產帶來毀滅性災害。番爺黃化曲葉病毒(Tomato Yellow LeafCurl Virus, TYLCV)是煙粉虱傳播的最重要植物病毒，其為單鏈環狀DNA病毒,屬雙生病毒科(Geminiviridae)菜豆金色花葉病毒屬(Begomovirus)病毒。由于煙粉虱的強入侵性導致其在世界各地普遍發生，番茄黃化曲葉病毒病也因此在非洲、美洲、亞洲等地區多個國家流行，在我國已蔓延到江蘇、浙江、云南等大多數省市，不僅使番茄大面積減產，而且使其品質下降。除危害番茄外，TYLCV還侵染辣椒、煙草和南瓜等其它植物。
[0003]煙粉虱一旦獲取TYLCV后，可在體內終身存留。如能有效降低煙粉虱體內TYLCV的存留，將可顯著提高病毒病的控制效果。然而當前生產上對番茄黃化曲葉病的防控主要采取利用抗病蟲品種、通過化學或物理手段控制煙粉虱數量、用病毒拮抗劑控制病毒等手段，尚未見如何有效降低煙粉虱體內病毒攜帶率以提高控病效果的研究報道。
[0004]棉酚(gossypol)是錦葵科植物草棉、樹棉或陸地棉成熟種子、根皮中提取的一種多元酚類物質，為棉屬植物體內所特有的次生物質。已發現棉酚與棉花抗蟲特性有關聯，還發現棉酚在醫學上具有抗癌、避孕和抗病毒等作用。棉酚是否也對植物病毒具有作用？國內外還未見研究報道。研究棉酚對煙粉虱體內番茄黃化曲葉病毒的影響，以期望利用棉酚作為一種植物病毒拮抗劑，在植物病毒病防控方面發揮作用。
三、
【發明內容】
[0005]1、發明目的
[0006]提供一種理想的煙粉虱體內TYLCV去除方法，能安全降低煙粉虱體內TYLCV的攜帶率，為番茄黃化曲葉病的控制提供新思路。
[0007]2、技術方案
[0008]本發明為一種昆蟲介體內植物病毒的去除方法，其特征在于利用棉酚降低煙粉虱體內TYLCV的攜帶率。
[0009]3、有益效果
[0010]本發明的方法與現有技術相比，產生以下有益效果:(1)與常規的控制煙粉虱數量以控制番茄黃化曲葉病相比，本發明通過有效降低煙粉虱體內植物病毒攜帶率來控制病毒病，防控思路新且針對性強；(2)與化學藥劑防治煙粉虱或病毒病相比，本發明利用棉酚進行控制，切實提高了病毒病控制的無公害控制水平，有效減少環境污染。四、【具體實施方式】
[0011]本發明的實施例是采用室內測定的方法。
[0012]測定方法如下:
[0013]1、煙粉虱接毒
[0014]采集同一種作物上煙粉虱高齡若蟲，羽化后，用剛羽化的煙粉虱接毒。將煙粉虱放在番茄黃化曲葉病發病嚴重番茄植株上進行取食，用套袋將煙粉虱套在發病且無蟲葉片上，于室內取食24h后取出。每張葉片套I個袋，每袋套35頭成蟲，共16袋。其中4袋試蟲在取食24h后即放置于_20°C冰箱中，直接用于病毒檢測，其余試蟲則用于后面的棉酚處
理試驗。
[0015]2、棉酚處理煙粉虱
[0016]采用營養液飼喂法對煙粉虱進行棉酚處理。將棉酚(標準品，Sigma公司產品)溶解于丙酮中配成母液，然后再與營養液混合，分別配制含500mg/L和62.5mg/L兩種濃度棉酚的營養液，用于喂飼煙粉虱，同時以不含棉酚但含與500mg/L棉酚營養液中相同量丙酮的營養液作對照，共喂飼6天。應用兩頭通玻璃管進行試驗，將100 μ L營養液加入兩頭通的玻璃管的一端封口膜夾層中，煙粉虱放入管內，另一端用紗布封口。每管30頭，每處理4管。
[0017]期間每兩天加營養液一次，分別在第I天、第3天和第5天加，每次加100 μ L。
[0018]3、煙粉虱中TYLCV的檢測
[0019]將喂食6天后各管內存活的煙粉虱取出，放入冰箱_20°C內，用于TYLCV檢測。
[0020]單頭煙粉虱DNA提取:在1.5ml的離心管中加入20 μ L的DNA堿裂解液(50mmol/LTris-HCl (ρΗ8.0), 20mmol/LNaCl, lmmol/LEDTA, I % SDS)，用滅菌牙簽充分研磨。加 I μ L蛋白酶K(20mg/ml)，離心30秒，60°C水浴I小時，追加I μ L蛋白酶K，離心30s，繼續水浴2小時，加178口1^的雙蒸水，1001:水浴51^11，滅活蛋白酶1(。取100 μ L提取液于另一離心管中，加2倍體積的預冷無水乙醇，充分混勻，4°C冰箱沉淀過夜后4°C 13000rpm離心10分鐘，倒出乙醇，晾干后加20 μ L的雙蒸水溶解DNA，-20°C保存。
[0021]檢測TYLCV 的特異性引物為 TV_P833 (5，-GGTCTACACGCTTACGCCTTATT-3 ’ )和PATY_R(5’ -TTCCATCCGAACATTCAGGCAGC-3’)，擴增片段大約為 800bp 左右。PCR 的反應體系為 10 μ L，包含 5 μ Lmix (IOOmM KCl,20mM Tris-HCl,3mM MgCl2,400 μ M dNTPs，溴酚藍)，
0.2μ L taq 酶(5U/μ L)，0.5 μ L 引物 TV_P833，0.5 μ L 引物 PATY_R，3.2 μ L H2O, 0.6 μ LDNA模板。PCR參數為:95°C預變性5min，94°C變性45s，56°C退火45s，72°C延伸lmin，35個循環，循環結束后72°C延伸20min。PCR產物進行電泳和克隆測序，明確其病毒種類。記錄各處理攜帶病毒煙粉虱頭數，計算病毒攜帶率。
[0022]用DPS軟件進行各處理病毒攜帶率統計分析比較。
[0023]實施效果:
[0024]研究發現煙粉虱經棉酚處理后可顯著降低其體內TYLCV的攜帶率(表1)。比較了剛羽化煙粉虱成蟲在室內經TYLCV發病苗獲毒后，再經棉酚處理后體內TYLCV攜帶率的變化，發現煙粉虱成蟲在發 病番茄苗上接毒后，其體內TYLCV攜帶率為100%，再經不含棉酚營養液飼喂6d后，其TYLCV的攜帶率為96.9%，兩者差異不顯著，而取食含62.5mg/L棉酚營養液后，煙粉虱體內TYLCV攜帶率為44.8%，極顯著低于取食不含棉酚營養液處理組的攜帶率，取食含500mg/L棉酚營養液后，煙粉虱體內TYLCV攜帶率更低，僅為17.4 %，均極顯著低于取食含62.5mg/L棉酚營養液和不含棉酚營養液處理組的攜帶率(F = 188.446，df=3，15，P < 0.0001)。
[0025]表1棉酚處理后煙粉虱體內TYLCV攜帶率
【權利要求】
1.一種昆蟲介體內植物病毒攜帶率降低的方法，其特征在于利用棉酚降低煙粉虱體內番茄黃化曲葉病毒的攜帶率。
2.根據權利要求1所述的利用棉酚降低煙粉虱體內病毒攜帶率，其特征在于62.5mg/L棉酚處理害蟲，可顯著 降低害蟲病毒攜帶率。
【文檔編號】A01P1/00GK103563897SQ201310291677
【公開日】2014年2月12日 申請日期:2013年7月12日 優先權日:2013年7月12日
【發明者】郭慧芳, 鐘萬芳, 劉寶生, 牛洪濤, 方繼朝 申請人:江蘇省農業科學院