纖維素酶在飼料原料中的最適添加量配方的制作方法
【專利摘要】本發明公開了一種纖維素酶在飼料原料中的最適添加量配方。本發明公開的一種飼料，由飼料原料和纖維素酶組成。本發明的選擇纖維素酶在飼料原料中最適添加量的方法和得到的最適添加量配方在飼料酶制劑的添加中具有指導意義。
【專利說明】纖維素酶在飼料原料中的最適添加量配方
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種纖維素酶在飼料原料中的最適添加量配方。
【背景技術】
[0002]新陳代謝是生命活動的基礎，而構成新陳代謝的許多復雜而有規律的物質變化和能量變化，都是在酶的催化下進行的，可以說，沒有酶的參與，生命活動一刻也不能進行。
[0003]20世紀20年代開始有報道，在飼糧中添加酶制劑可提高動物生長速度和飼料轉化效率，但是直到20世紀80年代人們才開始懂得如何在飼料工業中發揮酶的力量。飼用酶制劑一般來源于微生物，由木霉、曲霉、酵母和真菌等微生物發酵生產，它是集動物營養學、飼料學、動物生理生化、微生物發酵與酶工程、基因工程等諸學科于一體的應用于現代飼料工業中的一種綠色飼料添加劑，對提高飼料的轉化率、拓寬飼料原料的應用范圍和比例、節約飼料資源、降低飼料成本和養殖成本，改善飼養環境等起著重要作用。從1984年歐洲在全球首次將酶制劑商品化應用于大麥日糧上開始，到20世紀90年代中期，酶制劑在飼料工業中的應用得到了普遍認可。90年代初，我國開始自行生產銷售飼用酶制劑，2000年我國飼用酶制劑的銷售量已達到6000t。1998?2008年，動物飼料酶制劑在全球市場每年都以平均13%的速度增長。尤其是2008年后，由于無機磷源的成本高漲，促進了植酸酶在飼料中的普及應用，大大提高了人們對酶制劑的認識和接收程度，也推動了其它酶制劑在飼料工業和養殖領域的應用。
[0004]在動物生產上復合酶制劑的作用顯然要大于單體酶，但單體酶作用效果的研究毫無疑問將直接對復合酶的研究起指導作用，復合酶制劑在生產上的應用效果基本上已經得到肯定，但為進一步提高其性價比，更清楚地了解單體酶的作用機理和作用效果是很有必要的。不同的單酶都有其相對應的降解底物，酶的降解作用具有高度的選擇性和專一性，目前用在飼料工業上的單酶制劑約有20多種。
[0005]飼用單酶制劑可以根據是否在動物體內大量分泌而分為外源酶和內源酶兩種，夕卜源酶主要包括植酸酶和非淀粉多糖酶，其中非淀粉多糖酶又包括木聚糖酶、葡聚糖酶、甘露聚糖酶、果膠酶、纖維素酶等，而內源酶則主要包括蛋白酶、淀粉酶、糖化酶和脂肪酶等。
[0006]纖維素酶(Cellulase)是由多種水解酶組成的一個復雜酶系，其主要由葡聚糖內切酶、葡聚糖外切酶以及β -葡萄糖苷酶等組成，這類酶能將纖維二糖、三糖和纖維糊精等水解成單個葡萄糖。由于纖維素存在天然的特異性，纖維素酶必須用不同酶系協同作用才能完全將其分解，其中內切葡萄糖酶進入纖維素的非結晶區，形成外切纖維素酶所需的游離末端，然后外切纖維素酶從多糖鏈的非還原末端切下纖維二糖單位被β-葡萄糖苷酶水解形成葡萄糖。
[0007]纖維素酶作為飼料添加劑使用，其功能主要有以下幾點:①摧毀植物細胞壁，促進營養物質吸收。纖維素酶可在木聚糖酶、半乳糖苷酶等半纖維素酶的協同作用下破壞植物細胞壁，使細胞內容物釋放出來，以利于動物進一步降解吸收，同時也增加了非淀粉多糖的消化，進而改善高纖維飼料原料的利用率；②補充動物內源消化酶的不足，剌激動物內源酶的分泌。纖維素酶可以改善動物消化道酶系的組成、酶分泌量及活性，尤其對幼齡動物及病態和應激狀態下的成年畜禽；③改善動物胃腸道中微生態環境，促進小腸對營養物質的消化吸收。纖維素、半纖維素和果膠等會增加動物胃腸道內溶物的粘度，阻礙動物體內消化酶與營養物質的接觸，導致動物對飼料消化吸收利用率降低，黏稠的消化道食糜還會引起有害微生物滋生。而纖維素酶可降低食糜黏度，加強動物胃腸道內容物流動性，降低有害微生物在動物腸道附著可能性。纖維素酶還可促進腸道有益微生物生長，提高微生物對飼料的分解；纖維素酶同時具有維持動物小腸絨毛形態完整，提高營養物質吸收率的功能。
[0008]要在飼料中發揮酶制劑的最佳效果，必須有精確的應用體系。在一定日糧中如何精確的使用酶制劑，一是要考慮原料中酶的底物的種類，針對性地添加；二是要考慮其含量，確保有足夠的底物與酶作用才能發揮效果；三是要根據動物的特異性來設計。目前，對于飼用酶制劑在飼料中的添加量研究，多以動物養殖試驗為主，市場上對于飼用酶制劑的添加量，主要通過在動物試驗的基礎上再結合實際生產成本確定，很少有人從酶制劑作用關系入手，進行系統的研究。
【發明內容】
[0009]本發明的目的是提供一種纖維素酶在飼料原料中的最適添加量配方。
[0010]本發明提供的一種確定纖維素酶在飼料原料中最適添加量的方法，包括如下步驟:
[0011](I)得出每千克飼料原料中纖維素的量；
[0012](2)測量纖維素酶的酶活，所述纖維素酶的酶活定義為在37°C pH為5.5的條件下，每分鐘內從過量底物中降解釋放I μ mol還原糖所需的酶量定義為I個酶活力單位，IU ；
[0013]所述底物為步驟(I)所述的飼料原料；
[0014](3)根據步驟(2)所得的酶活，及下述公式，計算出每克步驟(I)中所述飼料原料所需纖維素酶的量，即為理論添加量；
[0015]Q= (CXI UX Imin) / (I μ mol XMX 120min)
[0016]式中:
[0017]Q——酶的理論添加量，U/g ；
[0018]C——每千克所述飼料原料中纖維素的量，g/kg ；
[0019]M——葡萄糖的摩爾質量，180g/mol ;
[0020]120min-酶的作用時間；
[0021]1U, Imin, I μ mol-酶活定義參數；
[0022](4)以步驟(3)所得酶的理論添加量為基數，記作Q ;n為Q的倍數，以nXQ組成該酶的梯度添加量，其中 η 為 1/2、1/4、1/6、1/8、1/10、1/20、1、2、4、6、8、10、20 ；
[0023]所述梯度添加量是針對飼料原料來說的，即每克飼料原料中應添加多少U的酶；
[0024](5)進行體外酶解實驗，體外酶解實驗的體系如下:
[0025]I)將2g飼料原料加入15.0mL pH3.0的0.2mol/L乙酸-乙酸鈉緩沖溶液中，再加入0.5mL濃度為70mg/mL的胃蛋白酶溶液，混勻，得食糜液；胃蛋白酶溶液中溶劑為0.01mol/L鹽酸水溶液；[0026]2)用1.0mol/L鹽酸水溶液調節食糜液的pH值至3.0 ;
[0027]3)將食糜液混合均勻后置于40°C振蕩消化，消化75分鐘；
[0028]4)用1.0mol/L氫氧化鈉水溶液調整步驟3)所得消化液的pH值至6.3,然后加入50mg胰酶；
[0029]5)實驗分兩組，第一組稱作加酶組，即向步驟4)所得體系中加入纖維素酶，所述酶的添加量為步驟(4)所設的梯度添加量；第二組稱作不加酶組，即向步驟4)所得體系中加入2.0mL 0.2mol/L pH6.3的乙酸-乙酸鈉緩沖溶液；然后，第一組和第二組均置于40°C振蕩消化，消化時間為120min ；
[0030](6)還原糖測定，分別檢測加酶組和不加酶組的還原糖的濃度，分別記作Ye和\，單位為mg/mL ；
[0031](7)按照如下公式計算纖維素酶酶解產生的還原糖占飼料原料的質量百分含量:
[0032]ΔΜ=(( (Ye-Y0) X D X V) /m) X 100
[0033]ΔΜ——酶解產生的還原糖占所加飼料原料的質量百分含量，% ；
[0034]D—測定液稀釋倍數，等于ImL除以還原糖測定時離心上清液吸取量；
[0035]V-消化反應體系總體積,27mL ;
[0036]m-消化反應稱取飼料原料樣品的質量，2000mg ；
[0037]100——百分比換算系數；
[0038](8)以η為橫坐標，以對應的ΛΜ為縱坐標作圖，得到曲線的拐點，并取拐點前兩組和拐點后兩組的η值；
[0039](9)將步驟(8)得到的η對應的組之間進行ΛM差異分析，按照步驟(8)的η由小到大的順序，得到與步驟(8)的η最小的一組有顯著差異的第一組，纖維素酶在該組飼料中的添加量就是纖維素酶在所述飼料原料中的最適添加量；
[0040]所述酶為纖維素酶；
[0041]所述還原糖為葡萄糖。
[0042]上述方法中，所述還原糖測定步驟如下:
[0043](I)取出透析管，將消化液離心5min (5000r/min)，取一定量上清液，用水定容至
2.0mLjP 3.0mL DNS煮沸顯色，以水為空白調零，540nm測量加酶組和不加酶組的吸光值，分別記作Xe和X。；
[0044](2)用DNS法繪制葡萄糖標準曲線，以葡萄糖含量(mg)為Y軸、吸光度OD值為X軸，繪制標準曲線，得到公式Y=aX+b ；
[0045](3)分別將Xe和Xtl代入(2)的公式，計算加酶組和不加酶組的還原糖的濃度，分別記作Ye和Y0,單位換算為mg/mL ；
[0046]所述還原糖為葡萄糖。
[0047]上述任一所述的方法中，所述飼料原料為玉米、豆柏、小麥、麩皮、米糠柏、菜柏、棉柏和DDGS中任意一種。
[0048]一種飼料也屬于本發明的保護范圍，該飼料由飼料原料和纖維素酶組成。
[0049]上述飼料中，所述飼料原料為玉米、豆柏、小麥、麩皮、米糠柏、菜柏、棉柏和DDGS中任意一種。
[0050]上述任一所述的飼料中，所述玉米與所述纖維素酶的比例為lg:4.98U;所述豆柏與所述纖維素酶的比例為Ig:28.62U;所述小麥與所述纖維素酶的比例為Ig:8.88U；所述麩皮與所述纖維素酶的比例為Ig:19.44U ;所述米糠柏與所述纖維素酶的比例為Ig:
22.8U ;所述菜柏與所述纖維素酶的比例為Ig:27.78U ;所述棉柏與所述纖維素酶的比例為Ig:44.48U ;所述DDGS與所述纖維素酶的比例為Ig:9.72U ；
[0051]所述U的定義為:纖維素酶在37°C、pH為5.5的條件下，每分鐘從過量底物中降解釋放I μ mol還原糖所需的酶量定義為IU ；
[0052]所述底物為所述飼料原料；
[0053]所述還原糖為葡萄糖。
[0054]與理論添加量對比表明，各飼料原料對纖維素酶的需要量都高于理論添加量，要想完全發揮酶制劑在飼料中的酶解效果，必須添加足量的酶。本發明的選擇纖維素酶在飼料原料中最適添加量的方法和得到的最適添加量配方在飼料酶制劑的添加中具有指導意義。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0055]圖1為不同濃度的纖維素酶酶解不同飼料原料生成產物量的曲線圖。
【具體實施方式】
[0056]下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。
[0057]下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。
[0058]纖維素酶購自北京挑戰生物技術有限公司，產品目錄號為YL-156。
[0059]DDGS (酒糟蛋白飼料)購自吉林省新天龍實業股份有限公司。
[0060]胃蛋白酶購自Sigma，貨號為P7000。
[0061]胰蛋白酶購自Sigma，貨號為P7545。
[0062]氫氧化鈉溶液(200g/L)按照如下方法配制:稱取氫氧化鈉20.0g，加水溶解，定容至 IOOml ο
[0063]乙酸溶液(0.lmol/L)按照如下方法配制:吸取冰乙酸0.60ml,加水溶解,定容至IOOml。
[0064]乙酸鈉溶液(0.lmol/L)按照如下方法配制:稱取三水乙酸鈉1.36g,加水溶解,定容至100ml。
[0065]乙酸-乙酸鈉緩沖溶液(0.lmol/L, pH5.5)按照如下方法配制:稱取三水乙酸鈉
23.14g，加入冰乙酸1.35ml，再加水溶解，定容至2000ml，測定溶液的pH值，如果pH值偏離
5.5，再用乙酸溶液(0.lmol/L)或乙酸鈉溶液(0.lmol/L)調節至ρΗ5.5。
[0066]10.0mg/ml葡糖糖溶液按照如下方法配制:
[0067]稱取無水葡萄糖1.000g，加乙酸-乙酸鈉緩沖液(0.lmol/L, pH5.5)溶解，定容至IOOml。
[0068]羧甲基纖維素鈉購自Sigma,貨號為C5678。
[0069]8.0g/Ι羧甲基纖維素鈉溶液按照如下方法配制:
[0070]稱取羧甲基纖維素鈉0.80g,加入80ml乙酸-乙酸鈉緩沖溶液(0.lmol/L,PH5.5)。磁力攪拌，同時緩慢加熱，直至羧甲基纖維素鈉完全溶解(注:在攪拌加熱的過程中可以補加適量的緩沖液，但是溶液的總體積不能超過100ml)。然后停止加熱，繼續攪拌30min，用乙酸-乙酸鈉緩沖溶液(0.lmol/L,pH5.5)定容至100ml。羧甲基纖維素鈉溶液能立即使用，使用前適當搖勻。4°C避光保存，有效期為3天。
[0071]DNS試劑按照如下方法配制:稱取3，5-二硝基水楊酸3.15g(分析純)，加水500ml，攪拌5s，水浴至45°C。然后逐步加入IOOml氫氧化鈉溶液(200g/L)，同時不斷攪拌，直到溶液清澈透明(注意:在加入氫氧化鈉過程中，溶液溫度不要超過48°C)。再逐步加入四水酒石酸鉀鈉91.0g、苯酚2.50g和無水亞硫酸鈉2.50g。繼續45°C水浴加熱，同時補加水300ml,不斷攪拌,直到加入的物質完全溶解。停止加熱,冷卻至室溫后,用水定容至1000ml。用燒結玻璃過濾器過濾。取濾液儲存在棕色瓶中，避光保存。室溫下存放7天后可以使用，有效期6個月。
[0072]下述實施例中纖維素酶活力的測定方法如下:
[0073](一)標準曲線的繪制
[0074]吸取乙酸一乙酸鈉緩沖溶液(0.lmol/L, pH5.5) 4.0mL，加入DNS試劑5.0mL，沸水浴加熱5min。用自來水冷卻至室溫,用水定容至25.0mL,制成標準空白樣。
[0075]分別吸取葡萄糖溶液(10.0mg/ml) 0、0.10,0.20,0.30,0.40,0.50,0.60 和0.70ml,分別用乙酸-乙酸鈉緩沖溶液(0.lmol/L, ρΗ5.5)定容至10ml,配制成濃度為0.10mg/ml-0.70mg/ml葡萄糖標準溶液。
[0076]分別吸取上述濃度系列的葡萄糖標準溶液各2.0Oml (做兩個平行)，分別加入到刻度試管中，再分別加入2ml乙酸-乙酸鈉緩沖溶液(0.lmol/L,pH5.5)和5ml DNS試劑。電磁振蕩3s，沸水浴加熱5min。然后用自來水冷卻到室溫，再用水定容至25mL。以標準空白樣調零，在540nm處測定吸光度OD值。
[0077]以葡萄糖濃度mg為Y軸、吸光度OD值為X軸，繪制標準曲線。每次新配制DNS試劑均需要重新繪制標準曲線。
[0078](二)酶活的測定
[0079]1、吸取10.0mL羧甲基纖維素鈉溶液(8.0g/l)，37°C平衡IOmin。
[0080]2、吸取10.0mL經過適當稀釋的酶液，37°C平衡lOmin。
[0081]3、吸取2.0OmL經過適當稀釋的酶液(已經過37°C平衡)，加入到刻度試管中，再加入5mL DNS試劑，電磁振蕩3s。然后加入2.0mL羧甲基纖維素鈉溶液(8.0g/l )，37°C保溫30min,沸水浴加熱5min。用自來水冷卻至室溫,加水定容至25mL,電磁振蕩3s。以標準空白樣調零，檢測在540nm處吸光度，記作Ab。
[0082]4、吸取2.0OmL經過適當稀釋的酶液(已經過37°C平衡)，加入到刻度試管中，再加入2.0mL羧甲基纖維素鈉(8.0g/l)(已經過37°C平衡)，電磁振蕩3s，37°C精確保溫30min。加入5.0mL DNS試劑，電磁振蕩3s，以終止酶解反應。沸水浴加熱5min，用自來水冷卻至室溫，加水定容至25mL，電磁振蕩3s。以標準空白樣調零，檢測在540nm處吸光度，記作AE。
[0083]5、根據各試樣的吸光度值以及步驟(一)得到的標準曲線回歸方程，計算各試樣中的還原糖(葡萄糖)的量。
[0084]按照公式I和2計算試樣在對應溫度及pH條件下的酶活力。
[0085]
【權利要求】
1.一種確定纖維素酶在飼料原料中最適添加量的方法，包括如下步驟: (1)得出每千克飼料原料中纖維素的量； (2)測量纖維素酶的酶活，所述纖維素酶的酶活定義為在37°CpH為5.5的條件下，每分鐘內從過量底物中降解釋放I μ mol還原糖所需的酶量定義為I個酶活力單位，IU ； 所述底物為步驟(1)所述的飼料原料； (3)根據步驟(2)所得的酶活，及下述公式，計算出每克步驟(1)中所述飼料原料所需纖維素酶的量，即為理論添加量；
Q= (CXI UX Imin) / (I μ mol XMX 120min) 式中: Q——酶的理論添加量，U/g ； C—每千克步驟(1)所述飼料原料中纖維素的量，g/kg ； M——葡萄糖的摩爾質量，180g/mol ； 120min——酶的作用時間； 1U, Imin, I μ mol-酶活定義參數； (4)以步驟(3)所得酶的理論添加量為基數，記作Q;n為Q的倍數，以nXQ組成該酶的梯度添加量，其中 η 為 1/2、1/4、1/6、1/8、1/10、1/20、1、2、4、6、8、10、20 ； (5)進行體外酶解實驗，體外酶解實驗的體系如下: 1)將2g飼料原料加入15.0mL pH3.0的0.2mol/L乙酸-乙酸鈉緩沖溶液中，再加入·0.5mL濃度為70mg/mL的胃蛋白酶溶液，混勻，得食糜液；胃蛋白酶溶液中溶劑為0.01mol/L鹽酸水溶液； 2)用1.0mol/L鹽酸水溶液調節食糜液的pH值至3.0 ; 3)將食糜液混合均勻后置于40°C振蕩消化，消化75分鐘； 4)用1.0mol/L氫氧化鈉水溶液調整步驟3)所得消化液的pH值至6.3，然后加入50mg胰酶； 5)實驗分兩組，第一組稱作加酶組，即向步驟4)所得體系中加入纖維素酶，所述酶的添加量為步驟(4)所設的梯度添加量；第二組稱作不加酶組，即向步驟4)所得體系中加入·2.0mL 0.2mol/L pH6.3的乙酸-乙酸鈉緩沖溶液；然后，第一組和第二組均置于40°C振蕩消化，消化時間為120min ； (6)還原糖測定，分別檢測加酶組和不加酶組的還原糖的濃度，分別記作Ye和\，單位為 mg/mL ； (7)按照如下公式計算纖維素酶酶解產生的還原糖占飼料原料的質量百分含量: ΔΜ=(( (Ye-Y0) X D X V) /m) X 100 ΔΜ——酶解產生的還原糖占所加飼料原料的質量百分含量，% ； D——測定液稀釋倍數，等于ImL除以還原糖測定時離心上清液吸取量； V-消化反應體系總體積，27mL ； m-消化反應稱取飼料原料樣品的質量，2000mg ； 100—百分比換算系數； (8)以η為橫坐標，以對應的AM為縱坐標作圖，得到曲線的拐點，并取拐點前兩組和拐點后兩組的η值；(9)將步驟(8)得到的η對應的組之間進行AM差異分析，按照步驟(8)的η由小到大的順序，得到與步驟(8)的η最小的一組有顯著差異的第一組，纖維素酶在該組飼料中的添加量就是纖維素酶在所述飼料原料中的最適添加量； 所述酶為纖維素酶； 所述還原糖為葡萄糖。
2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于:所述還原糖測定步驟如下: (1)取出透析管，將消化液離心5min(5000r/min )，取一定量上清液，用水定容至2.0mLjP 3.0mL DNS煮沸顯色，以水為空白調零，540nm測量加酶組和不加酶組的吸光值，分別記作Xe和X。； (2)用DNS法繪制葡萄糖標準曲線，以葡萄糖含量(mg)為Y軸、吸光度OD值為X軸，繪制標準曲線，得到公式Y=aX+b ； (3)分別將Xe和Xtl代入(2)的公式，計算加酶組和不加酶組的還原糖的濃度，分別記作Ye和Y。,單位換算為mg/mL ； 所述還原糖為葡萄糖。
3.根據權利要求1或2所述的方法，其特征在于:所述飼料原料為玉米、豆柏、小麥、麩皮、米糠柏、菜柏、棉柏和DDGS中任意一種。
4.一種飼料，由飼料原料和纖維素酶組成。
5.根據權利要求4所述的飼料，其特征在于:所述飼料原料為玉米、豆柏、小麥、麩皮、米糠柏、菜柏、棉柏和DDGS中任意一種。
6.根據權利要求4或5所述的飼料，其特征在于:所述玉米與所述纖維素酶的比例為Ig:4.98U ;所述豆柏與所述纖維素酶的比例為Ig:28.62U ;所述小麥與所述纖維素酶的比例為Ig:8.88U ;所述麩皮與所述纖維素酶的比例為Ig:19.44U ;所述米糠柏與所述纖維素酶的比例為Ig:22.8U ;所述菜柏與所述纖維素酶的比例為Ig:27.78U ;所述棉柏與所述纖維素酶的比例為Ig:44.48U ;所述DDGS與所述纖維素酶的比例為Ig:9.72U ； 所述U的定義為:纖維素酶在37°C、pH為5.5的條件下，每分鐘從過量底物中降解釋放Iμ mol還原糖所需的酶量定義為IU ； 所述底物為所述飼料原料； 所述還原糖為葡萄糖。
【文檔編號】A23K1/165GK103518976SQ201310484374
【公開日】2014年1月22日 申請日期:2013年10月16日 優先權日:2013年10月16日
【發明者】湯海鷗, 蔡輝益, 楊祿良, 謝寧, 王曉睿 申請人:天津博菲德科技有限公司