堇葉紫金牛快速工廠化生產方法
【專利說明】
一、技術領域
[0001]本發明屬于植物組織培養快速繁殖技術領域，具體涉及堇葉紫金牛快速工廠化生產方法
[0002]二、研究背景
[0003]堇葉紫金牛(Ardisia V1lacea)，又名裹堇紫金牛，屬紫金牛科紫金牛屬，是一種特產于浙江和臺灣的珍稀瀕危植物。堇葉紫金牛莖皮灰褐色，被微柔毛，葉片略呈蓮座狀，葉片基部鈍圓或微心形，上面微帶紅色，下面帶淡紫色，邊緣呈不規則波狀淺圓齒，傘形花序單生于葉腋或莖的上部，花冠白色，花期6-7月，植株姿態幽雅，紅果艷麗經久，圓滑晶瑩，清秀、典雅，紅果配紫葉，令人賞心悅目，并且具有較強的耐蔭性和耐旱性，可作為庭院地被、林下地被和觀葉觀果小盆栽類產品，具有極高的市場開發價值。由于堇葉紫金牛為野生資源，且資源量極為有限，常規的繁育方式，無法在最大化保護野生資源的基礎上進行工廠化生產，而組培快繁技術體系的建立則能夠以較少的野生資源為材料，短時間內來進行大規模的工廠化生產，能夠實現該瀕危植物的資源保護和種苗繁育，并推動該物種市場化的進程。
三、
【發明內容】
[0004]針對現有技術存在的問題，本發明提供一種堇葉紫金牛的快速工廠化生產方法，提高了生產效率和成活率，降低了生產成本，并且獲得的再生苗能夠穩定的延續野生資源的優良性狀。
[0005]為此，本發明采取如下的技術方案:
[0006]I)將無病蟲害的堇葉紫金牛性狀優良的單株于3月份開始恢復生長時，將其放到溫室內養護，每隔一周葉面噴灑一次0.3%-0.5%的多菌靈溶液，直至5月份左右。待新芽抽出后，剪取其中半木質化的嫩莖，將葉片沿葉柄基部切去，嫩莖切成小段，先用0.5%的新潔爾滅+洗潔精混合溶液攪拌消毒處理lh，倒掉消毒液，在流水下沖洗lh，備用。超凈工作臺中，處理過備用的小段用無菌水沖洗一下，倒掉無菌水，用70%-75%的酒精溶液消毒60-90s，倒掉酒精后，再用0.1%的升汞溶液消毒5-10min，倒掉消毒液，最后用無菌水反復沖洗
4-5次，備用。無菌水沖洗和消毒處理的過程中，都要不間斷地搖動，以保證無菌水和消毒液能夠完全與外植體接觸，提高消毒效率;將以上消毒處理過的莖段切成2cm左右的小段(每段上有I個休眠的腋芽)，用無菌刀片先把莖段最下端切口褐化的部分切去，迅速將腋芽莖段的芽向上接種到啟動培養基上。培養條件為:溫度25±2°C，光照時間為10h/d，光照強度為 1500-2000Lx，濕度為60%-65%。啟動培養基為:MS+0.15-0.30mg/L氯吡苯脲(CPPU) +
0.10-0.20mg/L 萘乙酸(NAA)+3% 蔗糖+0.7%瓊脂，pH 為 5.8-6.0；
[0007]2)啟動培養20d以后，休眠的腋芽萌發，將新萌發的嫩芽切下來，接種到不定芽分化(增殖)培養基上。不定芽分化培養基為:MS+0.50-0.80mg/L氯吡苯脲(CPPU)+0.10-0.20mg/L 萘乙酸(NAA)+3% 蔗糖+0.7%瓊脂，pH為 5.8-6.0;
[0008]3)增殖培養40d以后，腋芽分化產生大量不定芽，不定芽以芽叢的形式存在。將得到的不定芽叢，輕輕撥散成單個不定芽，將單個不定芽接種到壯苗生根培養基上。壯苗生根培養條件為:溫度25±2°C，光照時間為8h/d，光照強度為100Lx，濕度為60%-65%。所述的壯苗生根培養基為:MS+0.10-0.15mg/L氯吡苯脲(CPPU)+0.5-0.8mg/L吲哚丁酸(IBA) +
0.5g/L 活性炭+2 % 蔗糖+0.6 % 瓊脂，pH 為 5.8-6.0；
[0009]4)壯苗生根培養20d以后，不定芽逐漸分化為健壯的再生小苗，同時基部產生少量愈傷組織，愈傷組織上部分化出少量不定根。培養40-50d以后，再生小苗的平均株高為4.68cm，平均單株小苗的根系條數為4.28。將生根的組培瓶苗轉移到煉苗坑道中的苗床上，自然環境下煉苗10d。移栽前3-4d，將組培瓶的瓶蓋松動，但不要完全打開，移栽前l-2d，將組培瓶的瓶蓋完全打開，并往組培瓶內灌入少量的無菌水，生根組培苗移栽前，先用鑷子將生根苗輕輕地從培養基內夾出來，將根部所帶的培養基用清水完全清洗干凈，將清洗好的生根苗以3-4株為一叢種入煉苗基質(松鱗，移栽前I周左右，用0.8%高錳酸鉀溶液消毒處理)中。最后，用0.3%多菌靈溶液對移栽的生根苗和基質表面進行均勻噴施，以松鱗完全浸濕為宜，然后用塑料薄膜做成封閉的小拱棚，進行保溫保濕40d左右。待生根小苗長出新的須狀根并恢復健壯生長后，將小拱棚的兩端打開，緩慢放風，約I周后，將小拱棚完全打開，使其在自然條件下生長。
[0010]本發明與傳統的繁育技術和常規的組培技術相比，能夠將組培快繁過程中的壯苗培養和瓶內生根培養兩個階段合二為一，使再生苗在增壯的同時進行瓶內生根，縮短組培苗生產周期的同時減少了組培苗繼代的次數，大大節約了生產成本。其中不定芽增殖系數高達12.8，瓶內生根率高達96.7%,煉苗移栽成活率可達到95 %以上，整個快繁周期縮短到只有4.5個月，大大提高了生產效率，并且獲得的再生苗能夠穩定的延續野生資源的優良性狀。
四、【具體實施方式】
[0011]實施案例I
[0012]2014年5月12日，溫室內選取生長旺盛，無病蟲害，性狀表現優良的堇葉紫金牛野生單株，剪取當年新發幼嫩枝條，用剪刀將葉片沿葉柄基部切去，嫩莖切成小段，用清水反復沖洗3-4次，先用0.5 %的新潔爾滅+洗潔精混合溶液攪拌消毒處理30min，倒掉消毒液，在流水下沖洗lh，備用。超凈工作臺中，處理過備用的小段用無菌水沖洗一下，倒掉無菌水，用70 % -75 %的酒精溶液消毒30s，倒掉酒精后，再用0.1 %的升汞溶液消毒5min，倒掉消毒液，最后用無菌水反復沖洗4-5次，備用。無菌水沖洗和消毒處理的過程中，都要不間斷地搖動，以保證無菌水和消毒液能夠完全與外植體接觸，提高消毒效率；
[0013]將以上消毒處理過的莖段切成2cm左右的小段(每段上有I個休眠的腋芽)，用無菌刀片先把莖段最下端切口褐化的部分切去，迅速將腋芽莖段的芽向上接種到啟動培養基上。培養條件為:溫度25±2°C，光照時間為10h/d，光照強度為1500-2000LX，濕度為60%-65%。啟動培養基為:MS+0.20mg/L氯吡苯脲(CPPU)+0.10mg/L萘乙酸(NAA) +3%蔗糖+0.7%瓊脂，PH為5.8-6.0;啟動培養28d以后，休眠的腋芽萌發，將新萌發的嫩芽切下來，接種到不定芽分化(增殖)培養基上。不定芽分化培養基為:MS+0.50mg/L氯吡苯脲(CPPU)+0.10mg/L萘乙酸(NAA)+3 %蔗糖+0.7 %瓊脂，pH為5.8-6.0；增殖培養45d以后，腋芽分化產生大量不定芽，不定芽以芽叢的形式存在。將得到的不定芽叢，輕輕撥散成單個不定芽，將單個不定芽接種到壯苗生根培養基上。壯苗生根培養條件為:溫度25±2°C，光照時間為8h/d，光照強度為lOOOLx，濕度為60%-65%。所述的壯苗生根培養基為:MS+0.10mg/L氯吡苯脲(CPPU) +
0.5mg//L吲哚丁酸(IBA)+0.5g/L活性炭+2%蔗糖+0.6%瓊脂，pH為5.8-6.0；壯苗生根培養45d以后，將生根的組培瓶苗轉移到煉苗坑道中的苗床上，按照上述
【發明內容】
步驟4)相關的技術操作進行煉苗移栽。
[0014]本實施案例獲得的外植體消毒處理污染率為8%，不定芽增殖系數達到11.9，瓶內生根率達到95.8%，整個快繁周期(從增殖培養開始到煉苗移栽結束)為140d。
[0015]實施案例2
[0016]2014年5月28日，溫室內選取生長旺盛，無病蟲害，性狀表現優良的堇葉紫金牛野生單株，剪取當年新發幼嫩枝條，用剪刀將葉片沿葉柄基部切去，嫩莖切成小段，用清水反復沖洗3-4次，先用0.5%的新潔爾滅+洗潔精混合溶液攪拌消毒處理lh，倒掉消毒液，在流水下沖洗lh，備用。超凈工作臺中，處理過備用的小段用無菌水沖洗一下，倒掉無菌水，用70 % -75 %的酒精溶液消毒60s，倒掉酒精后，再用0.1 %的升汞溶液消毒Smin，倒掉消毒液，最后用無菌水反復沖洗4-5次，備用。無菌水沖洗和消毒處理的過程中，都要不間斷地搖動，以保證無菌水和消毒液能夠完全與外植體接觸，提高消毒效率；
[0017]將以上消毒處理過的莖段切成2cm左右的小段(每段上有I個休眠的腋芽)，用無菌刀片先把莖段最下端切口褐化的部分切去，迅速將腋芽莖段的芽向上接種到啟動培養基上。培養條件為:溫度25±2°C，光照時間為10h/d，光照強度為1500-2000LX，濕度為60%-65 %。啟動培養基為:MS+0.25mg/L氯吡苯脲(CPPU)+0.15mg/L萘乙酸(NAA)+3 %蔗糖+0.7 %瓊脂，PH為5.8-6.0;啟動培養24d以后，休眠的腋芽萌發，將新萌發的嫩芽切下來，接種到不定芽分化(增殖)培養基上。不定芽分化培養基為:MS+0.70mg/L氯吡苯脲(CPPU)+0.15mg/L萘乙酸(NAA)+3 %蔗糖+0.7 %瓊脂，pH為5.8-6.0；增殖培養5 Id以后，腋芽分化產生大量不定芽，不定芽以芽叢的形式存在。將得到的不定芽叢，輕輕撥散成單個不定芽，將單個不定芽接種到壯苗生根培養基上。壯苗生根培養條件為:溫度25±2°C，光照時間為8h/d，光照強度為1000LX，濕度為60%-65%。所述的壯苗生根培養基為:MS+0.10mg/L氯吡苯脲(CPPU) +
0.60mg/L吲哚丁酸(IBA)+0.50g//L活性炭+2 %蔗糖+0.6 %瓊脂，pH為5.8-6.0；壯苗生根培養49d以后，將生根的組培瓶苗轉移到煉苗坑道中的苗床上，按照上述
【發明內容】
步驟4)相關的技術操作進行煉苗移栽。
[0018]本實施案例獲得的外植體消毒處理污染率為8.6%，不定芽增殖系數達到14.1，瓶內生根率達到98.8%，整個快繁周期(從增殖培養開始到煉苗移栽結束)為132d。
[0019]實施案例3
[0020]2014年6月15日，溫室內選取生長旺盛，無病蟲害，性狀表現優良的堇葉紫金牛野生單株，剪取當年新發幼嫩枝條，用剪刀將葉片沿葉柄基部切去，嫩莖切成小段，用清水反復沖洗3-4次，先用0.5%的新潔爾滅+洗潔精混合溶液攪拌消毒處理lh，倒掉消毒液，在流水下沖洗lh，備用。超凈工作臺中，處理過備用的小段用無菌水沖洗一下，倒掉無菌水，用70 %-75%的酒精溶液消毒90s，倒掉酒精后，再用0.1 %的升汞溶液消毒1min，倒掉消毒液，最后用無菌水反復沖洗4-5次，備用。無菌水沖洗和消毒處理的過程中，都要不間斷地搖動，以保證無菌水和消毒液能夠完全與外植體接觸，提高消毒效率；
[0021 ]將以上消毒處理過的莖段切成2cm左右的小段(每段上有I個休眠的腋芽)，用無菌刀片先把莖段最下端切口褐化的部分切去，迅速將腋芽莖段的芽向上接種到啟動培養基上。培養條件為:溫度25±2°C，光照時間為10h/d，光照強度為1500-2000LX，濕度為60%-65 %。啟動培養基為:MS+0.30mg/L氯吡苯脲(CPPU) +0.20mg/L萘乙酸(NAA) +3 %蔗糖+0.7 %瓊脂，PH為5.8-6.0;啟動培養20d以后，休眠的腋芽萌發，將新萌發的嫩芽切下來，接種到不定芽分化(增殖)培養基上。不定芽分化培養基為:MS+0.80mg/L氯吡苯脲(CPPU)+0.20mg/L萘乙酸(NAA)+3 %蔗糖+0.7 %瓊脂，pH為5.8-6.0；增殖培養55d以后，腋芽分化產生大量不定芽，不定芽以芽叢的形式存在。將得到的不定芽叢，輕輕撥散成單個不定芽，將單個不定芽接種到壯苗生根培養基上。壯苗生根培養條件為:溫度25±2°C，光照時間為8h/d，光照強度為lOOOLx，濕度為60%-65%。所述的壯苗生根培養基為:MS+0.15mg/L氯吡苯脲(CPPU) +
0.80mg/L吲哚丁酸(IBA)+0.50g//L活性炭+2 %蔗糖+0.6 %瓊脂，pH為5.8-6.0；壯苗生根培養52d以后，將生根的組培瓶苗轉移到煉苗坑道中的苗床上，按照上述
【發明內容】
步驟4)相關的技術操作進行煉苗移栽。
[0022]本實施案例獲得的外植體消毒處理污染率為9.3%，不定芽增殖系數達到13.6，瓶內生根率達到99.2%，整個快繁周期(從增殖培養開始到煉苗移栽結束)為137d。
【主權項】
1.堇葉紫金牛快速工廠化生產方法，其特征在于包括以下步驟: 1)選取堇葉紫金牛優良單株帶腋芽莖段為外植體，先誘導休眠腋芽快速萌發； 2)誘導腋芽分化不定芽； 3)增殖培養40d以后，腋芽分化產生大量不定芽，不定芽以芽叢的形式存在，將步驟2)得到的不定芽叢，撥散成單個不定芽，將單個不定芽接種到壯苗生根培養基上，培養20d以后，不定芽逐漸分化為健壯的再生小苗，同時基部產生少量愈傷組織，愈傷組織上部分化出少量不定根，所述的壯苗生根培養基為:MS+0.10-0.15mg/L氯吡苯脲CPPU+0.5-0.8mg/L吲哚丁酸IBA+0.5g/L活性炭+2 %蔗糖+0.6 %瓊脂，pH為5.8-6.0; 4)對生根的組培苗進行煉苗移栽。2.如權利要求1所述的堇葉紫金牛快速工廠化生產方法，其特征在于步驟I)中:選取無病蟲害的堇葉紫金牛性狀優良的單株，待新芽抽出后，剪取其中半木質化的嫩莖，將葉片沿葉柄基部切去，嫩莖切成小段，進行消毒，將消毒處理過的莖段切成2cm的小段，每段上有I個休眠的腋芽，用無菌刀片先將莖段最下端切口褐化的部分切去，迅速將腋芽莖段的芽向上接種到啟動培養基上，啟動培養基為:MS+0.15-0.30mg/L氯吡苯脲CPPU+0.10-0.20mg/L萘乙酸NAA+3%蔗糖+0.7%瓊脂，pH為5.8-6.0。3.如權利要求1所述的堇葉紫金牛快速工廠化生產方法，其特征在于步驟I)中培養條件為:溫度25 ± 2°C，光照時間為10h/d，光照強度為1500-2000Lx，濕度為60%-65%。4.如權利要求2所述的堇葉紫金牛快速工廠化生產方法，其特征在于步驟I)中的消毒是將嫩莖切成小段后先用0.5%的新潔爾滅+洗潔精混合溶液攪拌消毒處理lh，倒掉消毒液，在流水下沖洗lh，備用，超凈工作臺中，處理過備用的小段用無菌水沖洗一下，倒掉無菌水，用70%-75%的酒精溶液消毒60-90s，倒掉酒精后，再用0.1 %的升汞溶液消毒5_10min，倒掉消毒液，最后用無菌水反復沖洗4-5次。5.如權利要求1所述的堇葉紫金牛快速工廠化生產方法，其特征在于步驟2)中:啟動培養20d以后，休眠的腋芽萌發，將新萌發的嫩芽切下來，接種到不定芽分化培養基上，所述的不定芽分化培養基為:MS+0.50-0.80mg/L氯吡苯脲CPPU+0.10-0.20mg/L萘乙酸NAA+3 %蔗糖+0.7% 瓊脂，pH 為 5.8-6.006.如權利要求1所述的堇葉紫金牛快速工廠化生產方法，其特征在于所述步驟3)中壯苗生根培養條件為:溫度25 土 2°C，光照時間為8h/d，光照強度為100Lx，濕度為60%-65%。7.如權利要求1所述的堇葉紫金牛快速工廠化生產方法，其特征在于步驟4)中移栽前3-4d，將組培瓶的瓶蓋松動，但不要完全打開，移栽前l-2d，將組培瓶的瓶蓋完全打開，并往組培瓶內灌入少量的無菌水，生根組培苗移栽前，先用鑷子將生根苗輕輕地從培養基內夾出來，將根部所帶的培養基用清水完全清洗干凈，將清洗好的生根苗以3-4株為一叢種入煉苗基質中，所述煉苗基質為松鱗，最后，用0.3 %多菌靈溶液對移栽的生根苗和基質表面進行均勻噴施，以松鱗完全浸濕為宜，然后用塑料薄膜做成封閉的小拱棚，進行保溫保濕40d左右。8.—種堇葉紫金牛快速工廠化生產方法的壯苗生根培養基，其特征在于由以下成分組成:MS+0.10-0.15mg/L氯吡苯脲CPPU+0.5-0.8mg/L吲哚丁酸IBA+0.5g/L活性炭+2% 蔗糖+.0.6% 瓊脂，pH 為 5.8-6.0。
【專利摘要】本發明涉及一種堇葉紫金牛快速工廠化生產方法，其特征在于包括以下步驟：1.選取堇葉紫金牛優良單株帶腋芽莖段為外植體，先誘導休眠腋芽快速萌發；2.誘導腋芽分化不定芽；3.增殖培養40d以后，腋芽分化產生大量不定芽，將單個不定芽接種到壯苗生根培養基上，培養20d以后，不定芽逐漸分化為健壯的再生小苗，同時基部產生少量愈傷組織，愈傷組織上部分化出少量不定根，所述的壯苗生根培養基為：MS+0.10?0.15mg/L氯吡苯脲CPPU+0.5?0.8mg/L吲哚丁酸IBA+0.5g/L活性炭+2％蔗糖+0.6％瓊脂，pH為5.8?6.0；4.對生根的組培苗進行煉苗移栽。本發明提高了生產效率和成活率，降低了生產成本，并且獲得的再生苗能夠穩定的延續野生資源的優良性狀。
【IPC分類】A01H4/00
【公開號】CN105706924
【申請號】CN201610068368
【發明人】孫英坤, 沈柏春, 陳林敬, 樊靖, 胡玉春, 王霽
【申請人】杭州市園林綠化股份有限公司