專利名稱：一種小麥麩皮抗凍蛋白的制備方法
技術領域：
一種小麥麩皮抗凍蛋白的制備方法，屬于小麥加工副產物的綜合利用技術領域。
背景技術：
小麥麩皮是小麥加工的副產物，每年小麥麩皮的產量在2000多萬噸以上，資源豐富，值得開發和利用。目前，我國小麥麩皮主要用作畜禽飼料、發酵培養基等，價格低廉，對于許多大型的面粉加工企業來說，如果能實現小麥麩皮的有效增值和利用，將具有十分重要的經濟效益和社會效益。
抗凍蛋白是一種具有非依數性降低冰點作用的蛋白質，在動物、植物、昆蟲等有機體抵抗外界寒冷環境的過程中具有重要的作用。它在極低的濃度下就可以使有機體提高抵抗寒冷的能力，可以避免在冷凍-解凍后肌體的損傷。因此，抗凍蛋白在農業、食品、醫學等領域都具有非常重要的作用。
北方冬小麥在生長過程中，經受冷應激，在其麩皮中會產生抗凍蛋白以抵抗外界的寒冷。因此，以北方冬小麥麩皮為原料，制備抗凍蛋白，可以廣泛應用于農業、食品、醫學等領域，市場前景廣闊。在農業生產中，可以將抗凍蛋白基因轉入目標作物，以提高目標作物的耐寒能力，擴展作物的生存環境；在食品工業中，抗凍蛋白具有改善食品質構，延長食品保質期等功能；在醫學領域中，抗凍蛋白可以使低溫保護精子細胞、卵母細胞和其它體細胞等的存活率提高，可以在冷凍手術中保護肌體細胞等作用。隨著抗凍蛋白應用范圍的不斷擴展，抗凍蛋白的市場將進一步擴大。
發明內容
本發明的目的是提供一種小麥麩皮抗凍蛋白的制備方法，最大限度地將小麥麩皮中的抗凍蛋白提取出來，并對其進行分離純化，以開發天然有效的低溫保護劑，從而實現麩皮的增值和深加工。
本發明的技術方案以小麥麩皮為原料，用小麥麩皮質量/體積比10倍量的去離子水提取，所得提取液使用80％的硫酸氨沉淀，將沉淀在抗凍蛋白提取液中復溶，濃縮，凍干，得小麥麩皮抗凍蛋白粗品；將小麥麩皮抗凍蛋白粗品再次在抗凍蛋白提取液中復溶，依次經過離子交換柱和凝膠過濾柱進行分離純化，最終得到小麥麩皮抗凍蛋白，其純度達到84.47％；(1)去離子水提取將小麥麩皮與10倍質量/體積比的去離子水混合，20℃，200轉/分鐘攪拌4小時，將混合液在2000g的離心力下離心30分鐘，收集上清液；(2)用硫酸氨沉淀向上清液中緩慢加入硫酸氨粉末，達到80％硫酸氨的飽和濃度，靜置60分鐘。將靜置后的混合液在2000g的離心力下離心30分鐘，收集沉淀；(3)復溶、透析、凍干得到粗品將沉淀復溶于抗凍蛋白提取液中，將復溶的蛋白液放置于截留分子量為6000Da的透析袋中對抗凍蛋白提取液充分透析；透析后，使用聚乙二醇10000對透析袋進行濃縮，當濃縮到本次復溶液原體積的1/15時，停止濃縮，進行冷凍干燥，該凍干粉為小麥麩皮抗凍蛋白粗品；(4)粗品復溶將小麥麩皮抗凍蛋白粗品復溶于抗凍蛋白提取液中，濃度為20mg/ml；(5)離子交換色譜純化用DEAE Sepharose Fast Flow柱，Φ30×300mm，對小麥麩皮抗凍蛋白粗品進行分離，分離首先使用1.2ml/min的抗凍蛋白提取液洗脫1小時，接著使用0-1.5M NaCl梯度洗脫，流速為1.2ml/min，紫外檢測器檢測波長為280nm，收集圖1中的P3餾分，將P3餾分放置于截留分子量為6000Da的透析袋中對抗凍蛋白提取液透析，透析后，使用聚乙二醇10000對透析袋進行濃縮，當濃縮到本次復溶液原體積的1/15時，停止濃縮，進行冷凍干燥，得到P3餾分凍干粉；(6)凝膠過濾色譜純化將P3餾分的凍干粉復溶于抗凍蛋白提取液中，使用Sephadex G75，Φ20×800mm，進一步進行分離，洗脫液為抗凍蛋白提取液，流速為0.8ml/min，收集圖2中的P2餾分，將P2餾分放置于截留分子量為6000Da的透析袋中對抗凍蛋白提取液透析，透析后，使用聚乙二醇10000對透析袋進行濃縮，當濃縮到本次復溶液原體積的1/15時，停止濃縮，進行冷凍干燥，標記為P32，即為小麥麩皮抗凍蛋白凍干粉產品。
所用抗凍蛋白提取液的組成為含1mM蛋白酶抑制劑的20mM磷酸鹽緩沖液，pH8.0。
本發明所制備的麩皮抗凍蛋白為純天然產品，在加工過程中未添加任何有毒，有害的物質，因此可以廣泛的應用于農業、食品、醫學、生物技術等行業。
本發明的有益效果通過硫酸氨沉淀、離子交換色譜、凝膠過濾色譜、冷凍干燥等方法，將麩皮中的抗凍蛋白進行分離，顯著的提高了麩皮的價值，為谷物的深加工提出一條新的途徑。
圖1小麥麩皮抗凍蛋白粗品使用離子交換柱的分離效果。
圖2P3凍干粉使用凝膠過濾色譜柱的分離效果。
圖3HPLC檢測小麥麩皮抗凍蛋白的純度具體實施方式
實施例1準確稱量小麥麩皮500g，與5000ml去離子水混勻，20℃，200轉/分鐘攪拌4小時，將混合液在2000g的離心力下離心30分鐘，收集上清液。向上清液中緩慢加入硫酸氨粉末，達到80％硫酸氨的飽和濃度，靜置60分鐘。將靜置后的混合液在2000g的離心力下離心30分鐘，收集沉淀，并將上述沉淀復溶于抗凍蛋白提取液中(20mM磷酸鹽緩沖液，1mM蛋白酶抑制劑，pH8.0)，將復溶的蛋白液放置于截留分子量為6,000Da的透析袋中對抗凍蛋白提取液充分透析。透析后，使用聚乙二醇10000對透析袋進行濃縮。當濃縮到原體積的1/15時，停止濃縮，進行冷凍干燥，該凍干粉稱為小麥麩皮抗凍蛋白粗品，20克左右。
將小麥麩皮抗凍蛋白粗品復溶于抗凍蛋白提取液中，濃度為20mg/ml。使用DEAE Sepharose Fast Flow柱(Φ30×300mm)對上述粗品進行分離，分離首先使用1.2ml/min的抗凍蛋白提取液洗脫1小時，接著使用0-1.5M NaCl梯度洗脫5小時，流速為1.2ml/min，紫外檢測器檢測波長為280nm，洗脫分離效果如圖1。收集圖1中的P3，并將P3放置于截留分子量為6000Da的透析袋中對抗凍蛋白提取液充分透析。透析后，使用聚乙二醇10000對透析袋進行濃縮。當濃縮到原體積的1/15時，停止濃縮，進行冷凍干燥，得到P3凍干粉0.5克左右。
將上述P3的凍干粉復溶于抗凍蛋白提取液中，使用Sephadex G75(Φ20×800mm)進一步進行分離，洗脫液為抗凍蛋白提取液，流速為0.8ml/min，洗脫7小時，分離效果如圖2。收集P2，并將P2放置于截留分子量為6000Da的透析袋中對抗凍蛋白提取液充分透析。透析后，使用聚乙二醇10000對透析袋進行濃縮。當濃縮到原體積的1/15時，停止濃縮，進行冷凍干燥，標記為P32，0.3克左右。
將P32復溶于抗凍蛋白提取液，濃度為2mg/ml。使用Shodex KW804 ProteinColume對P32的純度進行鑒定。結果見圖3。色譜條件為50mM磷酸鹽緩沖液進行洗脫，洗脫速度為1.0ml/min，紫外檢測器波長為220nm。保留時間為11.694分鐘的組分為小麥麩皮抗凍蛋白，根據峰面積計算可以發現，小麥麩皮抗凍蛋白的含量為84.47％。
權利要求
1.一種小麥麩皮抗凍蛋白的制備方法，其特征是以小麥麩皮為原料，用小麥麩皮質量/體積比10倍量的去離子水提取，所得提取液使用80％濃度的硫酸氨沉淀，將沉淀在抗凍蛋白提取液中復溶，濃縮，凍干，得小麥麩皮抗凍蛋白粗品；將小麥麩皮抗凍蛋白粗品再次在抗凍蛋白提取液中復溶，依次經過離子交換柱和凝膠過濾柱進行分離純化，最終得到小麥麩皮抗凍蛋白，其純度達到84.47％；工藝為(1)去離子水提取將小麥麩皮與10倍質量/體積比的去離子水混合，20℃，200轉/分鐘攪拌4小時，將混合液在2000g的離心力下離心30分鐘，收集上清液；(2)用硫酸氨沉淀向上清液中緩慢加入硫酸氨粉末，達到80％硫酸氨的飽和濃度，靜置60分鐘，將靜置后的混合液在2000g的離心力下離心30分鐘，收集沉淀；(3)復溶、透析、凍干得到粗品將沉淀復溶于抗凍蛋白提取液中，將復溶的蛋白液放置于截留分子量為6000Da的透析袋中對抗凍蛋白提取液充分透析；透析后，使用聚乙二醇10000對透析袋進行濃縮，當濃縮到本次復溶液原體積的1/15時，停止濃縮，進行冷凍干燥，該凍干粉為小麥麩皮抗凍蛋白粗品；(4)粗品復溶將小麥麩皮抗凍蛋白粗品復溶于抗凍蛋白提取液中，濃度為20mg/ml；(5)離子交換色譜純化用DEAE Sepharose Fast Flow柱，Φ30×300mm，對小麥麩皮抗凍蛋白粗品進行分離，分離首先使用流速1.2ml/min的抗凍蛋白提取液洗脫1小時，接著使用0-1.5M NaCl梯度洗脫5小時，流速為1.2ml/min，紫外檢測器檢測波長為280nm，收集圖1中的P3餾分，將P3餾分放置于截留分子量為6000Da的透析袋中對抗凍蛋白提取液透析，透析后，使用聚乙二醇10000對透析袋進行濃縮，當濃縮到本次復溶液原體積的1/15時，停止濃縮，進行冷凍干燥，得到P3餾分凍干粉；(6)凝膠過濾色譜純化將P3餾分的凍干粉復溶于抗凍蛋白提取液中，使用Sephadex G75，Φ20×800mm，進一步進行分離，洗脫液為抗凍蛋白提取液，流速為0.8ml/min，收集圖2中的P2餾分，將P2餾分放置于截留分子量為6000Da的透析袋中對抗凍蛋白提取液透析，透析后，使用聚乙二醇10000對透析袋進行濃縮，當濃縮到本次復溶液原體積的1/15時，停止濃縮，進行冷凍干燥，標記為P32，即為小麥麩皮抗凍蛋白凍干粉產品。
2.根據權利要求1所述的制備方法，其特征是所用抗凍蛋白提取液的組成為含1mM蛋白酶抑制劑的20mM磷酸鹽緩沖液，pH8.0。
3.一種用權利要求1所述方法制備得到的小麥麩皮抗凍蛋白的應用，其特征是用于農業、食品、醫學、生物技術行業。
全文摘要
一種小麥麩皮抗凍蛋白的制備方法，屬于小麥加工副產物的綜合利用技術領域。本發明以小麥麩皮為原料，經水提取、硫酸氨沉淀、離子交換色譜、凝膠過濾色譜和冷凍干燥等步驟，分離得到小麥麩皮抗凍蛋白。本發明首次介紹了從小麥麩皮中分離純化抗凍蛋白的方法。所得小麥麩皮抗凍蛋白產品可用于農業、食品、醫學等行業，從而實現小麥麩皮的有效增值和利用。
文檔編號A23J1/00GK1995062SQ20061016642
公開日2007年7月11日 申請日期2006年12月15日 優先權日2006年12月15日
發明者張暉, 張超, 姚惠源, 郭曉娜, 王立 申請人:江南大學
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