專利名稱：羽扇豆球蛋白用于治療Ⅱ型糖尿病的用途的制作方法
技術領域：
本發明涉及羽扇豆球蛋白用于治療II型糖尿病的用途。
背景技術：
羽扇豆(Lupinus albus)是豆科一年生草本植物，自古以來它就生長在地中海和中東地區，它的種子既可以用于營養目的(由于它們不同尋常的蛋白質含量)又可以在傳統醫學中用作驅蟲藥和抗寄生物藥。
羽扇豆的種子含有毒性喹諾里西啶環(quinolizidine)類生物堿如白羽扇豆堿、13-氧-白羽扇豆堿、薔薇苷及其衍生物以及甲基-白羽扇豆賓(albin)，已知它們可以對中樞神經系統產生致抑郁和致麻痹的作用。所述生物堿可通過在水中浸漬而除去，它們是羽扇豆種子苦味的來源，在野生的羽扇豆種子中大量存在，但是在所謂的甜羽扇豆(Lupinus albus)中含量卻很少。
羽扇豆種子中含量最高的蛋白質成分是球蛋白，占總蛋白含量的87％。所述成分包括可溶于稀生理鹽水的水溶性蛋白質(Duranti等，Phytochemistry，20，2071-2075，1981)。羽扇豆球蛋白γ約占總球蛋白的6％。由凝膠濾過法測定的蛋白質表觀分子量約為199,000Da(Duranti等，凝集素生物學、生物化學、臨床-生物化學-第十一卷(Van Driesche E，Rouge P，Beeckams S，Bog-Hahsen TC編)1997，Textop Publ.，Hellerup，Denmark，pp.881-85，1997中)。羽扇豆球蛋白γ由表觀分子量為47,000Da的單體組成。將該單體還原的結果表明它由兩條通過一個二硫鍵橋相連的多肽鏈組成，表觀分子量分別為30,000Da和17,000Da(Restani等，Phytochemistry，20，2077-2083，1981)。
在天然條件下和變性條件下獲得的分子質量值已表明羽扇豆球蛋白γ具有四聚體結構。已發現羽扇豆球蛋白γ的輕亞基不含有共價鍵合的碳水化合物，而重鏈則是糖基化的。
它的氨基酸組成與大多數羽扇豆儲備蛋白顯著不同(Restani等，1981，同上)。實際上，羽扇豆球蛋白γ含有許多硫酸化的氨基酸和相當數量的賴氨酸、蘇氨酸和色氨酸，已證明它對內源性和外源性蛋白酶的蛋白水解作用具有很強的抵抗力(Duranti，Narhung，30，271-274，1986)。
對于該蛋白氨基酸序列的認識(Scarafoni等，Biochim.Biophys.Acta1519，147-151，2001)使得我們可以排除它與儲備蛋白、催化蛋白或結構蛋白以及其它來源的蛋白的任何序列同源性。羽扇豆球蛋白γ顯示出與其它蛋白如大豆BG7S(70％同源性)(Kagawa等，Febs Letters，226，145-149，1987；Komatsu等，Biosci.Biotech.Biochem.58，1705-1706，1994)和功能尚待澄清的胡蘿卜種子中的糖蛋白EDGP(58％同源性)(Satoh等，Planta，188，432-438，1992)具有同源性或相似性。
Horvath描述了羽扇豆全提取物用于降血糖的用途(J.Pharmacol.(Amer.)，38，303，1930)，并提出在輕度至中度糖尿病中用它來代替胰島素。隨后Clementi和Torrisi(Boll.Soc.It.Biol.Sper.，9，1004，1935e Arch.Fisiol.，34，290，1935)鑒定了生物堿白羽扇豆堿中的降血糖活性成分，但是它的作用卻很短暫。
最近Mario Villaroel等在Archivos Latinoamericanos de Nutrición，Vol.46，N.3，1996，pp.234-237中也描述了羽扇豆粉的降血糖作用，該文表明含有羽扇豆粉的李子醬可以用于糖尿病患者的食物療法中。
就羽扇豆球蛋白γ而言，Duranti等(Phytochem.56(6)，529-533，2001)描述了它與不同金屬的相互作用能力。在中性pH中，羽扇豆球蛋白γ與Zn2+離子的親和力最強。而且，羽扇豆球蛋白γ還與復合了Zn2+和Ni2+的親和色譜柱相結合；結合的蛋白可以使用pH低于6或含有EDTA或咪唑的緩沖試劑洗脫。羽扇豆球蛋白γ在金屬親和柱中的保留曲線與組氨酸側基(pKa＝6)的滴定曲線一致。
然而迄今為止，尚未見羽扇豆球蛋白γ用于治療II型糖尿病的報道。
根據本發明，已發現羽扇豆球蛋白γ以及與羽扇豆球蛋白γ具有50％以上同源性的蛋白質可產生顯著的降血糖作用。
與羽扇豆球蛋白γ具有50％以上同源性的已知蛋白質的實例有大豆BG7S(70％同源性)(Kagawa等，Febs Letters，226，145-149，1987；Komatsu等，Biosci.Biotech.Biochem.58，1705-1706，1994)和EDGP(58％同源性)(Satoh等，Planta，188，432-438，1992)。
還證明對大鼠施用葡萄糖后，羽扇豆球蛋白γ和同源蛋白具有很強的降低血漿曲線作用。
因此本發明涉及羽扇豆球蛋白γ以及與羽扇豆球蛋白γ具有50％以上同源性的蛋白質用于制備治療II型糖尿病的藥物、食品補充劑或食品的用途。
本發明還涉及含有羽扇豆球蛋白γ或與羽扇豆球蛋白γ具有50％以上同源性的蛋白質的藥物組合物或營養組合物。
羽扇豆球蛋白γ優選基本上純凈的蛋白質或含有所述羽扇豆球蛋白γ的羽扇豆蛋白的混合物或提取物。基本上純凈是指濃度通常應高于80重量％，優選高于90％。
羽扇豆球蛋白γ可通過圖3所示的工藝獲得。
根據所述方法，將羽扇豆壓碎，將核仁去皮并制成薄片，用溶劑提取去油。然后將已去油的薄片在酸性條件下通過提取步驟A獲得提余物A和酸性提取物A，再進行進一步處理。
從提余物A開始，進行以下步驟B)在輕度堿性條件下對提余物A連續進行兩次提取，獲得提余物B和提取物B，棄去提余物B；C)用酸處理提取物B以沉降蛋白質；D)將蛋白質分離，除去固體蛋白質，澄清上清液(SP)待用于后續步驟。
同時從酸提取步驟A得到的酸性提取物A開始，進行以下步驟
E)凈化提取物A，獲得澄清的提取物(AEP)；F1)對AEP進行超濾，獲得F1-滲余物；F2)對合并SP和F1-滲余物所得的混合物進行透析過濾，獲得滲余物DFP和F2-滲透物(棄去)；G)將DFP進行巴斯德滅菌和噴霧干燥后獲得NCGP(天然羽扇豆球蛋白γ)。
以下報告了羽扇豆球蛋白γ的藥理學實驗結果。
在大鼠中與二甲雙胍(對照標準品)相比較測試了羽扇豆球蛋白γ的降血糖活性。
實施例1使用起始體重為275-300g的雄性CD種大鼠。將動物飼養于模克隆籠中，環境中具有自動控制的燈光(12小時光照/12小時黑暗)，溫度(21±1℃)，濕度(60±5％)。
羽扇豆球蛋白γ通過實施例2中報告的方法制備。向100只大鼠(分為5組，每組20只)預先施用(時間-30分鐘)以下物質第1組載體(1％羧甲基纖維素[CMC]；2ml/kg口服)第2組羽扇豆球蛋白γ(50mg/kg口服，在1％CMC中的溶液)第3組羽扇豆球蛋白γ(100mg/kg口服，在1％CMC中的溶液)第4組羽扇豆球蛋白γ(200mg/kg口服，在1％CMC中的溶液)第5組二甲雙胍(50mg/kg口服，在1％CMC中的溶液)隨后以口服途徑給予(時間0分鐘)全部大鼠葡萄糖(2g/kg)以升高血糖水平。
在臨施用葡萄糖之前(時間0分鐘)和施用葡萄糖之后30、60和90分鐘處，用戊硫巴比妥鈉(50mg/kg腹膜內注射)將全部動物(每個時間點n＝5只大鼠)麻醉并從腔靜脈取5ml血。將血樣收集于含有抗凝血劑EDTA(7.5mM)的注射器中，立即離心(在4℃下，2000g×10min)以獲得葡萄糖酶定量所需要的血漿。
大鼠血漿中葡萄糖的定量通過酶測定法(505nm處的吸光度)一式三份地進行，葡萄糖濃度表達為mg/dl。
更精確地講，使用含有Trinder反應(葡萄糖氧化酶法)所必需的全部試劑的酶試劑盒(來自Sigma Aldrich的Glucose-Trinder，目錄號315-500)。
此外，分光光度計的校正和對不同血漿樣品的讀取質量使用Sigma-Aldrich的標準試劑(Calibrator，目錄號A-2539；ACCUTROLNormal，目錄號A-2034；ACCUTROL Abnormal，目錄號A-3034)驗證。所使用的羽扇豆球蛋白γ來自于實施例2。二甲雙胍、羧甲基纖維素及用于葡萄糖定量、質量控制和儀器校正的各種試劑盒均購買于Sigma-Aldrich(意大利米蘭)。
表中報告的數值均表達為平均值±平均標準誤差(M.S.E)。使用曲線(圖2)下面積值進行第1組(接受載體的大鼠)與第2、3、4和5組(接受不同濃度羽扇豆球蛋白γ或二甲雙胍的動物)之間的統計學分析，首先進行方差分析(單向)，然后進行多重比較的Dunnett檢驗(雙側)。當P＜0.05時認為差異是顯著的。
結果
圖1和圖2概括了實驗的結果。
口服給予2g/kg葡萄糖使對照組大鼠(載體)的血漿葡萄糖水平升高了2.7倍(從85±6達到232±18mg/dl；P＜0.001)。所述的升高在給予葡萄糖后30分鐘達到峰值，在隨后的90分鐘內逐漸降低(圖1)。
在給予大鼠葡萄糖之前30分鐘，預先口服施用劑量為50、100和200mg/kg的羽扇豆球蛋白γ引起血漿葡萄糖水平顯著降低，而且這種降低作用具有劑量依賴性(圖1和圖2)。
更具體地講，從圖2中報告的曲線下面積(AUC)值中可以看出，口服200mg/kg的羽扇豆球蛋白γ的作用(AUC＝2090±238)與第5組(向動物預先口服施用50mg/kg的二甲雙胍)中觀察到的效果(AUC＝1565±201)沒有顯著差異。
所得結果表明向大鼠預先施用羽扇豆球蛋白γ可以顯著降低口服給予2g/kg葡萄糖后升高的血漿葡萄糖水平。
實施例2羽扇豆薄片的制備將約4500kg的羽扇豆壓碎，將核皮與核仁分離得到3440kg核仁和1060kg核皮。將核仁壓碎后用軋制機制成薄片，為防止蛋白質變性，將滾筒溫度保持在40℃以下。得黃色盤狀薄片，堆積密度為300至330kg/m3。
除去油分將步驟a)所得的薄片按每批500kg裝入直徑為900mm的直立管子中，填充高度不高于2m，用己烷浸濾去油。
將抽提操作重復4次，其包括以下步驟1)用純己烷(white hexane)浸濾直至接收罐中回收的混合物達500l為止，2)將混合物再循環15分鐘，3)在第1至3次，使液體部分排放15分鐘，在最后一次抽提步驟中，排放30分鐘。
將已去油的薄片在真空(250mbar)下攪拌150分鐘，以除去其中仍存在的己烷，至己烷終含量為250ppm后，吹入空氣使之降至50ppm。得到約430kg的白色薄片。
A)在酸性條件下提取蛋白質在13.5至15.2℃下，將185kg白色薄片懸浮于1800l pH4.5-4.8的冷的酸性水中，將機械攪拌速率調至55rpm提取1小時。整個提取過程中大約使用了23.6l 3M的HCl來保持酸性pH。離心后得到385kg提余物A和1600l酸性提取物A。
B)在輕度堿性條件下從提余物中分離蛋白質提取物第一步，在28.2至31.5℃下將385kg提余物A用900l pH7.2-7.4的水提取，以速度60rpm機械攪拌1小時。向溶液中加入50ml消泡劑Struktol SB 2010。整個提取過程中使用了大約19.6l 3M的NaOH來保持堿性pH。
離心后從提余物中獲得約945l蛋白提取物。
第二步，在29.0至32.0℃下，將離心后獲得的提余物用540l pH7.3-7.4的水提取15分鐘。整個提取過程中使用了0.3l 3M的NaOH來保持堿性pH。獲得約595l蛋白提取物II和242kg提余物B。
合并蛋白提取物I和II得到1450l蛋白提取物B。
C)在酸性條件下從蛋白提取物中沉淀蛋白質向蛋白提取物B(1540l)中加入16l 3M的HCl將pH調至4.6-4.5，加入50ml上述的消泡劑，機械攪拌速率為85rpm。蛋白質在等電點析出(pH4.5)。
D)使沉淀的蛋白與上清液分離步驟C)中的蛋白質分散體(約1550l)中的固體含量為11.0至11.5體積％，將其用盤式分離器以6830rpm的轉速進行分離。所得的澄清提取物中的固體含量為0.0至0.1體積％。分離出約1330l澄清上清液(SP)和213l的淤渣。澄清上清液中的干物質含量為0.4-0.5％，而干物質含有70％的總蛋白。
E)凈化酸性提取物A來自于酸性提取過程A的酸性提取物A(1600l)中的干物質含量在2至2.5體積％范圍內，用盤式分離器以7,500rpm的轉速進行分離。所得的澄清提取物中固體的含量在0.1至0.15體積％之間。分離得到約1500l澄清提取物(AEP)和100l淤渣。澄清提取物(AEP)中的固體含量為2.2-2.5體積％，干物質含有25％的總蛋白。
F1)超濾澄清提取物(AEP)將700l AEP由pH4.5調至pH6.0-7.0，在壓力3巴、40℃下，經膜超濾作用濃縮直至終體積減少為起始體積的十分之一。
F1-滲余物的干物質含量約為7％，干物質含有50％的總蛋白。棄去F1-滲透物。
F2)透析過濾SP和AEP將來自于步驟D)的233l澄清上清液(SP)逐步加入F1-滲余物中，將混合物在膜中再循環直至體積減少至與滲余物的起始體積相同。在最后的稀釋步驟之后，將混合物繼續再循環直至透析過濾的滲余物(DFP)中的干物質含量達到最高水平，即14.5至15.0％之間，干物質含有約84％的總蛋白。棄去F2-滲透物。
G)巴斯德滅菌和噴霧干燥，獲得NCGP將透析過濾的滲余物(DFP)從pH6.5調至pH約為5.2，在熱交換器中加熱至40-65℃然后進料至噴霧干燥器中，熱交換器含有一個加套的導管，導管的內徑為6mm。進氣口的溫度調至195℃，DFP的進料速率為每小時8至10l。使用旋風分離器將干燥粉末從氣流中分離出來。干物質的含量在94.0至95.2％之間。從40l的DFP中可得到大約4.5kg的天然羽扇豆球蛋白γ(NCGP)。
根據該工藝制備的羽扇豆球蛋白γ含有約84.7％的蛋白質、0.6％的油和6.4％的干物質。干物質中含有計算量的8.3％的不含氮的物質(NFE)。在pH7時，NCGP在1％水溶液中的氮可溶性指數為72.5％。
根據本發明，羽扇豆球蛋白γ將以口服途徑施用，可單獨施用或與其它具有有益活性或互補活性的物質一同施用，可制備成片劑、膠囊、顆粒劑、散劑、糖漿劑等。藥物制劑可以通過傳統方法制備，使用該技術中已知的成分，例如賦形劑、配體、崩解劑、潤滑劑、穩定劑等。劑量隨癥狀、患者體重、疾病嚴重程度等的不同而不同。在成年人類患者的情況下，羽扇豆球蛋白γ每天的總劑量將在150至750mg之間，優選50至250mg，單劑量或多劑量給藥，如每天一至三次。
權利要求
1.羽扇豆球蛋白γ或與羽扇豆球蛋白γ具有50％以上同源性的蛋白質用于制備治療II型糖尿病的藥物、食品補充劑或食品的用途。
2.根據權利要求1的羽扇豆球蛋白γ的用途。
3.權利要求1的用途，其中所述與羽扇豆球蛋白γ具有50％以上同源性的蛋白質選自大豆BG7S或胡蘿卜EDGP。
4.根據權利要求1或2的含有羽扇豆球蛋白γ的羽扇豆蛋白質混合物或提取物的用途。
5.含有羽扇豆球蛋白γ或與羽扇豆球蛋白γ具有50％以上同源性的蛋白質作為活性成分的藥物組合物或營養組合物。
6.權利要求5的藥物組合物或營養組合物，其包含含有羽扇豆球蛋白γ的羽扇豆蛋白質的混合物或提取物。
7.作為治療劑的羽扇豆球蛋白γ。
8.作為降血糖劑的羽扇豆球蛋白γ。
全文摘要
本發明公開了羽扇豆球蛋白γ或與羽扇豆球蛋白γ具有50％以上同源性的蛋白質用于制備治療II型糖尿病的藥物、食品補充劑或食品的用途，含有羽扇豆球蛋白γ的藥物組合物或營養組合物，羽扇豆球蛋白γ作為治療劑、特別是作為降血糖劑的用途。羽扇豆球蛋白γ可以以純凈的形式或以提取物、混合物或濃縮物的形式使用。
文檔編號A61K36/23GK1747739SQ200480003911
公開日2006年3月15日 申請日期2004年2月6日 優先權日2003年2月11日
發明者P·莫拉佐尼, M·杜蘭蒂 申請人:因德納有限公司