專利名稱：一種經冰凍處理的低抗原的異種角膜基質及制備方法
技術領域：
本發明屬醫用材料，涉及一種角膜基質，尤其涉及一種經冰凍處理的低抗原的異種角膜基質及制備方法，這種異種角膜基質可作為醫用材料應用于角膜移植及角膜屈光手術。
背景技術：
角膜病是全球范圍內引起致盲的第二大疾病。對于角膜病致盲的患者，只有通過角膜移植才能使患者恢復視力。在我國，因角膜病致盲的患者每年大約有25萬例，而接受角膜移植的患者每年僅數千例。制約角膜移植開展的根本原因是供體角膜來源的極端匱乏。因此，研究和開發出能替代人角膜的角膜替代物是解決此供需矛盾的關鍵。
人工角膜的研究已有數十年的歷史，過去的研究主要集中在材料學方面。因為人角膜是眼球壁的一部分，對移植替代物來說不僅僅要求有嚴格的光學特性，同時還必須具備與人眼組織良好的生物相容性。近年來，組織工程技術的發展為人工角膜的構建提供了新的思路和方法。Minami等在1993年以膠原凝膠為基質實現了人工角膜的體外重建，但由于凝膠的透明性差和強度低而未能用于移植手術。1999年Griffith等將轉基因的內皮和上皮細胞培養在以膠原-硫酸軟骨素為基礎的基質上，重建了功能、結構都與正常角膜相似的生物角膜，但是也因為基質強度不夠而未能進入動物實驗階段，離臨床應用就相差更遠。因此，人工合成的角膜生物材料至今還很不理想。至今為止有關人工角膜生物材料研究最主要的局限在于，無法制備出與人角膜具有相似的透明性、強度及生物學特性的基質架構。
異種角膜基質如豬角膜基質具有與人角膜基質類似的組織結構、生物物理特性和光學特性。但是異種移植后強烈的排斥反應阻礙了異種角膜在臨床上的應用。近年來的研究發現，角膜基質內的基質細胞是引起基質型排斥反應的主要抗原。而作為角膜基質架構的膠原纖維在種系間高度保守，組織結構和生物物理特性的差異不大，并且抗原性很低。
通過冰凍保存和凍融處理能使角膜基質細胞死亡，使其細胞表而不能表達組織相容性抗原等參與免疫排斥反應的分子，從而使異種角膜基質的抗原性顯著降低，而通過γ射線照射能殺滅異種角膜中可能存在的病原微生物。
因此，使用冰凍處理等物理方法使異種角膜的基質細胞死亡，從而使其抗原性減低，可能是人角膜基質的理想替代物。
發明內容
本發明的一個目的是提供一種低抗原的異種角膜基質。
本發明的另一個目的是提供這種低抗原的異種角膜基質的制備方法，通過以下技術方案實現(1)獲取新鮮動物眼球摘取動物眼球，修剪眼球表面附屬組織后浸泡于5％聚維酮碘溶液中3分鐘，然后用500毫升平衡鹽溶液沖洗，所用動物主要包括豬、牛、狗。然后將動物眼球置于-70℃中冰凍保存。
(2)γ射線照射處理將冰凍保存狀態下的異種眼球進行劑量為25kGy的γ射線照射，殺滅可能存在的病原微生物。
(3)獲取與保存γ射線照射后保存于-20℃-70℃中備用，使用時常溫下解凍，手術顯微鏡下沿角膜緣剪下全角膜，撕去角膜上皮和角膜內皮層，得到低抗原的異種角膜基質。
本發明的又一個目的是這種經冰凍處理的異種角膜基質在作為制備角膜移植及屈光手術用的醫用材料中的應用。
本發明的主要特點是經過本發明所采用的冰凍和γ射線照射方法既可以殺死角膜基質內所有的細胞，又可以保存角膜膠原纖維的基本架構，從而保留了角膜的韌性和透明性。處理后的異種角膜基質具有很低的免疫原性和良好的生物相容性。它可以直接用于治療性角膜移植和光學性板層角膜移植手術，移植后受體的角膜上皮很快使該異種角膜基質植片的表面上皮化，受體的角膜基質細胞和神經可以重新長入異種角膜基質植片內，植片長期存活，完全達到角膜移植的目的。
圖1為冰凍角膜EthD-1和5-CMFDA雙重熒光染色照片。
圖2為以冰凍保存豬角膜為供體的異種板層角膜移植術后3天。
圖3為以冰凍保存豬角膜為供體的異種板層角膜移植術后1年。
具體實施例方式
下面將通過實施例對本發明作進一步的說明。
實施例1 冰凍處理豬角膜基質的制備在合格的飼養場中選擇健康供體豬，用硫噴妥鈉針肌注麻醉后，摘取豬眼球，修剪眼球表面附屬組織后將眼球浸泡于5％聚維酮碘中3分鐘，然后用500毫升磷酸平衡鹽溶液沖洗，將其置于-70℃冰凍保存。將冰凍保存狀態下的異種眼球進行劑量為25kGy的γ射線照射，殺滅可能存在的病原微生物。然后將其保存于-70℃中備用。
眼球常溫下解凍后，手術顯微鏡下沿角膜緣剪下全角膜，刮去角膜上皮層和撕去后彈力膜，得到低抗原的豬角膜基質。該角膜基質內細胞全部死亡，熒光染色可見活細胞熒光染色劑5-CMFDA無著色，死細胞熒光染色劑EthD-1使角膜基質細胞染成紅色，參見圖1。
實施例2 冰凍處理牛角膜基質的制備在合格的飼養場中選擇健康供體牛，用硫噴妥鈉針肌注麻醉后，摘取牛眼球，修剪眼球表面附屬組織后將眼球浸泡于5％聚維酮碘中3分鐘，然后用500毫升生理鹽水沖洗，4攝氏度下運送至實驗室，置于-70℃生理鹽水中冰凍保存。
將冰凍保存狀態下的異種眼球進行劑量為25kGy的γ射線照射，殺滅可能存在的病原微生物。然后將其保存于-20℃中備用。使用時，將眼球常溫下解凍后，手術顯微鏡下沿角膜緣剪下全角膜，撕去角膜上皮層和后彈力膜，得到低抗原的牛角膜基質。
實施例3 新西蘭兔治療性角膜移植實驗用實施例2方法制備的低抗原牛角膜基質為醫用供體材料(以下稱供體)，選健康新西蘭兔為受體行治療性穿透性角膜移植術，將兔用硫噴妥鈉肌注成功全麻后，術眼常規PVP碘消毒，鋪巾，開瞼器開瞼，做上下直肌固定縫線，供體角膜用生理鹽水沖洗后內基質面朝上置于角膜墊上，用7.5毫米環鉆在受體角膜中央鉆至前房后，前方內注入粘彈劑，用角膜剪沿鉆緣剪除受體角膜制備植床，取植片置于植床上，以10-0尼龍線(Alcon Laboratories，Fort Worth，TX)作16針間斷縫合。術畢除去直肌縫線和開瞼器，用泰利必妥眼膏(SantanPharmaceutics，Osaka，Japan)涂眼。術后給予每天一次泰利必妥眼膏涂眼。觀察結膜充血、上皮化完成和排斥反應發生等情況。移植后發現結膜充血5天后消退，上皮化術后3天完成，在3個月的觀察期內無排斥反應發生。
實施例4 新西蘭兔光學性板層角膜移植實驗以實施例1方法制備獲得的低抗原豬角膜基質為醫用供體材料(以下稱供體)，選健康新兩蘭兔為受體行板層角膜移植術，硫噴妥鈉肌注成功全麻后，術眼常規聚維酮碘消毒，鋪巾，開瞼器開瞼，做上下直肌固定縫線，供體角膜用生理鹽水沖洗10分鐘后內基質而朝上置于角膜墊上，用7.75毫米環鉆鉆取供體植片。用7.5毫米環鉆在受體角膜中央鉆至約2/3角膜深度后，用角膜板層刀分離板層。取植片置于植床，以10-0尼龍線(Alcon Laboratories，FortWorth，TX)作16針間斷縫合。術畢除去直肌縫線和開瞼器，泰利必妥眼膏涂眼。術后給予每天一次泰利必妥眼膏涂眼。觀察結膜充血、上皮化完成狀況和角度透明度改變等指標。移植后發現結膜充血3天后消退，上皮化3天完成，在12個月的觀察期內無排斥反應發生，角膜透明，參見圖2、圖3。
無需進一步詳細闡述，相信采用前面所公開的內容，本領域技術人員可最大限度地應用本發明。因此，前面的實施方案應理解為僅是舉例說明，而非以任何方式限制本發明的范圍。
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權利要求
1.一種經冰凍處理的低抗原的異種角膜基質，以動物角膜為材料，其特征是提供的是一種經冰凍處理的低抗原的異種角膜基質。
2.根據權利要求1所述的經冰凍處理的低抗原的異種角膜基質的制備方法，其特征是通過以下技術方案實現(1)獲取新鮮動物角膜基質摘取動物眼球，修剪眼球表面附屬組織后浸泡于5％聚維酮碘中3分鐘，然后用500毫升平衡鹽溶液沖洗，然后將動物眼球置于-70℃平衡鹽溶液中冰凍保存；(2)γ射線照射處理將冰凍保存狀態下的異種眼球進行劑量為25kGy的γ射線照射，殺滅可能存在的病原微生物。(3)獲取與保存γ射線照射后保存于-70℃中備用，使用時常溫下解凍，手術顯微鏡下沿角膜緣剪下全角膜，撕去角膜上皮和角膜內皮層，得到低抗原的異種角膜基質。
3.根據權利要求2所述的經冰凍處理的低抗原的異種角膜基質的制備方法，其特征是沖洗所用的平衡鹽溶液優選磷酸平衡鹽溶液或者生理鹽水。
4.根據權利要求1-3所述的經冰凍處理的低抗原的異種角膜基質，在制備角膜移植、角膜屈光手術用的醫用材料中的應用。
全文摘要
本發明提供一種低抗原的異種角膜基質，通過以下技術方案實現(1)摘取新鮮動物眼球，置于－70℃中冰凍保存；(2)將冰凍保存狀態下的異種眼球進行γ射線照射，并保存于－20℃－70℃中備用；(3)使用時常溫下解凍，沿角膜緣剪下全角膜，撕去角膜上皮和角膜內皮層，得到低抗原的異種角膜基質。用本發明方法獲得的異種角膜基質，既可以殺死角膜基質內所有的細胞，又可以保存角膜膠原纖維的基本架構，從而保留了角膜的韌性和透明性。同時具有很低的免疫原性和良好的生物相容性。作為醫用材料可以直接用于治療性角膜移植和光學性板層角膜移植手術，植片可長期存活，完全達到角膜移植的目的。
文檔編號A61F2/14GK1692891SQ20051005034
公開日2005年11月9日 申請日期2005年5月17日 優先權日2005年5月17日
發明者姚玉峰, 朱也飛, 裘文亞 申請人:浙江大學醫學院附屬邵逸夫醫院