切割型dance、dance復合體及其使用方法

專利名稱：：切割型dance、dance復合體及其使用方法
技術領域：
：本發明涉及一種通過切割DANCE所得的多肽以及編碼該多肽的多核苷酸；切割DANCE的方法；通過切割DANCE所得的抗多核苷酸的抗體；DANCE切割量的測定方法·試劑盒；DANCE突變體以及編碼該突變體的多核苷酸；各種DANCE復合體及其制備方法；調節DANCE的活性得到的物質或DANCE特異的蛋白酶的篩選方法，以及由此得到的物質；彈性纖維形成調節劑；以及至少含有DANCE和編碼DANCE的多核苷酸的試劑盒等。
背景技術：
：彈性纖維是在肺·動脈·皮膚等彈性組織中富含的，并決定組織彈性的細胞外纖維。人體老化的重要特征是組織彈性的喪失，從而產生肺氣腫、動脈硬化及皺紋、皮膚松弛等。這是在老齡化社會中重要性日益增加的課題，其大多是由彈性纖維劣化·斷裂引起的。盡管彈性纖維很重要，但關于彈性纖維形成以及劣化的分子機制的詳細情況仍然不明確。彈性纖維形成時，彈性蛋白沿著稱為微原纖維的纖維沉積，并且彈性蛋白通過賴氨酰氧化酶家族的酶[賴氨酰氧化酶(lysyloxidaseLOX)、賴氨酰氧化酶樣(lysyloxidase-likeLOXL)1-4]進行交聯是很重要的(Molnar，J等人，BiochimBiophysActa1647220-4(2003)、Rosenbloom，J等人，FasebJ.71208-18.(1993))。但是關于該過程基于何種分子機制在生物體內進行，仍知之甚少。又，據認為微原纖維主要是指肌原纖蛋白1、肌原纖蛋白2、LTBP2(潛在的TGFb-結合蛋白，latentTGFb-bindingprotein2)這樣的細長的高分子量蛋白質，但因肌原纖蛋白1、肌原纖蛋白2基因敲除小鼠的任何一種均未發現彈性纖維的異常，所以難以認為這些蛋白質對彈性纖維形成有貢獻(Pereira，L.等，Nat.Genet.17218-22(1997)、Putnam，E.A.等人，Nat.Genet.11456-8(1995)、Chardhry，S.S等人，Mol.genet.10835-43(2001))，由于LTBP2基因敲除小鼠胎生早期致死，所以不明確LTBP2是否對彈性纖維形成有貢獻(Shipley，J.M.等人，Mol，CellBiol.204879-87(2000))。本發明人等，采用信號序列誘捕(SignalSequenceTrap)法克隆稱為DANCE(發育動脈以及神經嵴表皮生長因子(EGF)樣(developmentalarteriesandneuralcrestepidermalgrowthfactor(EGF)-like)；也稱為纖蛋白-5)的分泌蛋白質(Nakamura，T.等人，J，Biol.Chem.27422476-83(1999))，發現其敲除小鼠制成時，全身的彈性纖維擴散(Nakamura，T等人，Nature415171-5(2002))。因此，DANCE基因缺失小鼠的表型與人體的老化非常相似，皮膚松弛沒有彈性、引起重度肺氣腫、動脈扭曲且硬化。即，DANCE是彈性纖維形成中必須的蛋白質。又，本發明人等，標明DANCE與整聯蛋白的結合在生物體內起重要作用(Nakamura，T.等，J，Biol.Chem.27422476-83(1999))。最近，報道彈性蛋白交聯酶之一，LOXL1的敲除小鼠與DANCE敲除小鼠非常相似均引起彈性纖維的形成異常(Liu，X.等，Nat.Genet.36178-82(2004))。LOXL1與DANCE結合，且在DANCE敲除小鼠中LOXL1不再定位于彈性纖維上，因此推測DANCE作為銜接頭起到使LOXL1酶錨定于適當位置的作用。LOXL1敲除小鼠的表型比DANCE敲除小鼠的表型弱，且出現稍晚，因此認為DANCE的作用不僅是錨定LOXL1，而且DANCE規定彈性蛋白交聯酶的定位，該見解對理解DANCE有助于彈性纖維形成的分子機制是很重要的。但是，如果考慮彈性纖維是沿著微原纖維形成的，則認為DANCE僅與彈性蛋白交聯酶結合是不充分的，DANCE還需與微原纖維的構成蛋白質結合。但是，DANCE與微原纖維的何種蛋白質結合仍不明確。據認為如果能明確DANCE的詳細機能，則可以開發具有可調節彈性纖維形成的新型作用機制的藥物，所以亟待闡明這一機制。
發明內容因此，本發明的目的是提供一種篩選方法，其借助于闡明DANCE機能的一部分，進而利用所闡明的機能開發可調節彈性纖維形成的藥物的篩選方法，關于彈性纖維形成的狀態的診斷方法，該篩選方法以及診斷方法中必要的各種手段等。本發明人等，為解決上述技術問題潛心研究，結果發現在生物體內切割DANCE的一部分即引起機能變化。切割型DANCE喪失與細胞表面整聯蛋白的結合能力，及DANCE之間的結合能力，而獲得對微原纖維的構成蛋白質LTBP2更強的結合能力。又，本發明人等發現DANCE與LTBP2結合，DANCE之間結合，DANCE與賴氨酰氧化酶結合等。認為DANCE與這些蛋白質的結合對于彈性纖維形成的調節是很重要的。本發明人等基于以上的見解完成本發明。即，本發明提供了下述內容<1>一種多肽，其包含與序列號6表示的氨基酸序列基本上同一的氨基酸序列，且由DANCE特異的蛋白酶切割DANCE而得到。<2>一種多肽，其包含序列號6表示的氨基酸序列。<3>一種多核苷酸，其具有編碼上述<1>中所述多肽的堿基序列。<4>一種多核苷酸，其包含序列號5表示的堿基序列。<5>一種多肽，其包含與序列號8表示的氨基酸序列基本上同一的氨基酸序列，且由DANCE特異的蛋白酶切割DANCE而得到。<6>一種多肽，其包含序列號8表示的氨基酸序列。<7>一種多核苷酸，其具有編碼上述<5>中所述多肽的堿基序列。<8>一種多核苷酸，其包含序列號7表示的堿基序列。<9>一種DANCE的切割方法，其特征在于將DANCE與DANCE特異的蛋白酶接觸。<10>一種抗體，其對上述<1>或<2>中所述的多肽具有特異的親和性。<11>一種單克隆抗體，其對上述<5>或<6>中所述的多肽具有特異的親和性。<12>一種方法，其特征在于在來自動物的生物材料中測定DANCE的切割量。<13>一種DANCE的切割量測定用試劑盒，其特征在于含有抗DANCE抗體。<14>一種DANCE突變體，其在DANCE中DANCE特異的蛋白酶對DANCE的切割位點處引入氨基酸突變以使DANCE顯示出對該DANCE特異的蛋白酶的抗性。<15>一種多核苷酸，其具有編碼上述<14>中所述的多肽的堿基序列。<16>一種DANCE復合體，其至少含有2個DANCE。<17>根據<16>中所述的復合體，其至少含有可識別形態的2種DANCE。<18>根據<16>或<17>中所述的復合體，其進一步含有賴氨酰氧化酶和/或LTBP2。<19>一種DANCE復合體，其含有至少1個DANCE，以及賴氨酰氧化酶和/或LTBP2。<20>一種至少含有2個DANCE的DANCE復合體的制備方法，其特征在于使至少2個DANCE接觸而形成復合體。<21>一種含有至少1個DANCE，以及賴氨酰氧化酶和/或LTBP2的DANCE復合體的制備方法，其特征在于將至少1個DANCE與賴氨酰氧化酶和/或LTBP2接觸。<22>一種篩選可調節DANCE特異的蛋白酶活性的物質的方法，其包含以下步驟(a)、(b)以及(c)(a)將被檢物質與DANCE特異的蛋白酶接觸的步驟；(b)測定由于上述(a)步驟產生的DANCE特異的蛋白酶的活性，將該活性與未接觸被檢物質時的DANCE特異的蛋白酶的活性進行比較的步驟；(c)基于上述(b)的比較結果，對調節DANCE特異的蛋白酶活性的被檢物質進行選擇的步驟。<23>根據上述<22>中所述的方法，其為鑒定彈性纖維形成調節劑的方法。<24>一種篩選可調節DANCE特異的蛋白酶活性的物質的方法，其包含以下步驟(a)、(b)以及(c)(a)向動物給予被檢物質的步驟；(b)測定由于上述(a)步驟產生的DANCE特異的蛋白酶的活性，將該活性與未給予被檢物質時的DANCE特異的蛋白酶的活性進行比較的步驟；(c)基于上述(b)的比較結果，對調節DANCE特異的蛋白酶活性的被檢物質進行選擇的步驟。<25>一種篩選下述物質的方法，該物質可調節含有至少2個DANCE的DANCE復合體的形成，該方法包含以下步驟(a)、(b)以及(c)(a)被檢物質存在下，使至少2個DANCE相接觸的步驟；(b)測定由于上述(a)步驟產生的DANCE復合體的量，將該量與不存在被檢物質的情況下DANCE復合體的量進行比較的步驟；(c)基于上述(b)的比較結果，對調節DANCE復合體的形成的被檢物質進行選擇的步驟。<26>根據上述<25>中所述的方法，其中使用可識別形態的至少2種DANCE。<27>一種篩選下述物質的方法，該物質可調節含有至少1個DANCE，以及賴氨酰氧化酶和/或LTBP2的DANCE復合體的形成，該方法包含以下步驟(a)、(b)以及(c)(a)被檢物質存在下，將至少1個DANCE與賴氨酰氧化酶和/或LTBP2接觸的步驟；(b)測定由于上述(a)步驟產生的DANCE復合體的量，將該量與不存在被檢物質的情況下DANCE復合體的量進行比較的步驟；(c)基于上述(b)的比較結果，對調節DANCE復合體的形成的被檢物質進行選擇的步驟。<28>一種彈性纖維形成調節劑，其由上述<23>～<27>中所述的任一種方法得到。<29>一種DANCE特異的蛋白酶的篩選方法，其以DANCE的切割活性為指標。<30>一種DANCE特異的蛋白酶，其由上述<29>中所述的方法得到。<31>一種多核苷酸，其具有編碼由上述<29>中所述的方法得到的DANCE特異的蛋白酶的堿基序列。<32>一種彈性纖維形成調節劑，其含有上述<30>中所述的DANCE特異的蛋白酶，或上述<31>中所述的的多核苷酸。<33>一種試劑盒，其含有以下(a)以及(b)(a)DANCE或具有編碼DANCE的堿基序列的多核苷酸；(b)以下(i)～(vi)的至少1種成分；(i)(a)中DANCE的可識別的形態的DANCE；(ii)具有編碼(a)的DANCE可識別的形態的DANCE的堿基序列的多核苷酸；(iii)賴氨酰氧化酶；(iv)具有編碼賴氨酰氧化酶的堿基序列的多核苷酸；(v)LTBP2；(vi)具有編碼LTBP2的堿基序列的多核苷酸。<34>一種DANCE特異的蛋白酶表達細胞的鑒定方法，其含有以下步驟(a)以及(b)(a)特定的動物細胞與DANCE接觸的步驟；(b)評價DANCE是否被切割的步驟。本發明的篩選方法，使可調節彈性纖維形成的新型作用機制的醫藥開發或DANCE特異的蛋白酶的鑒定成為可能，故是有用的。又，本發明的測定方法，使彈性纖維形成的狀態的診斷成為可能，故是有用的。進一步，本發明的多肽、復合體以及試劑盒，可適用于實施本發明的方法，預防、治療或改善需要對彈性纖維形成進行調節的狀況，或者作為研究·診斷用試劑等。圖1表示DANCE缺失突變體的結構。橫線框信號序列；白色框鈣結合性EGF樣(cbEGF)模體；黑色框RGD模體；豎線框C末端結構域；斜線框FLAG標記物。圖2表示293T細胞中的人、小鼠DANCE的強制表達。圖3表示小鼠皮膚成纖維細胞的培養上清液中DANCE的表達。圖4表示小鼠肺組織的蛋白質印跡。圖5表示全長DANCE、N末端切割DANCE的純化。圖6表示由絲氨酸蛋白酶抑制劑引起的DANCE的切割抑制。圖7表示體外培養物中人DANCE的切割位點、以及突變型DANCE的氨基酸突變位點。圖8表示突變型DANCE(R77A)的DANCE切割量的降低。圖9表示平滑肌細胞培養物中的DANCE結合蛋白質。圖10表示使用DANCE缺失突變體分析DANCE之間的結合、DANCE與LTBP2的結合必需區域。圖11表示DANCE與賴氨酰氧化酶的結合。圖12表示各種年齡的人的皮膚中DANCE蛋白質的表達。Ba背部；F臉部；N頸部；Bu臀部；T嘴唇·腫瘤摘除時的剩余皮膚(有炎癥)圖13表示DANCE突變蛋白質對血管內皮細胞的細胞黏著試驗的結果。發明詳細的說明1.切割型DANCE，以及編碼該切割型DANCE的多核苷酸本發明提供一種由DANCE特異的蛋白酶對DANCE進行切割所得的多肽，以及編碼該多肽的多核苷酸。“DANCE”包含由序列號2表示的氨基酸序列，或序列號4表示的氨基酸序列(去除從序列號2表示的氨基酸序列推定的信號序列的氨基酸序列)組成的多肽，或其等同物(例如含SNP、單元型的變體、哺乳動物直向同源物等)。具體而言，包含序列號2或序列號4表示的氨基酸序列的多肽的同等物是具有與序列號2或序列號4表示的氨基酸序列基本上同一的氨基酸序列，且由DANCE特異的蛋白酶切割的多肽。本發明中，發現這樣的DANCE由DANCE特異的蛋白酶切割。基于該見解成功地提供一種由DANCE的切割而得到的新型多肽。DANCE的哺乳動物直向同源物沒有特別的限制，例如優選牛、羊、豬、山羊、猴子、家兔、大鼠、倉鼠、豚鼠以及小鼠的直向同源物，更優選人、猴子、大鼠或小鼠的直向同源物。本說明書中，“DANCE特異的蛋白酶”是指在序列號2表示的氨基酸序列的DANCE中的第77位氨基酸和第78位氨基酸之間切割的蛋白酶。DANCE特異的蛋白酶的特征在于，被作為絲氨酸蛋白酶抑制劑的抑酶肽抑制，不被作為半胱氨酸蛋白酶抑制劑的E64抑制。又，確認DANCE特異的蛋白酶在皮膚成纖維細胞、293T細胞、肺組織等中的表達。進一步確認DANCE特異的蛋白酶，對第77位的精氨酸被丙氨酸取代的突變型DANCE的切割能力降低。因此，關于由DANCE特異的蛋白酶對DANCE的切割而得到的本發明的多肽之一，是包含相當于序列號2表示的氨基酸序列中第24位到第77位的氨基酸序列(即，序列號6表示的氨基酸序列)的多肽，或其同等物。具體而言，包含序列號6表示的氨基酸序列的多肽的同等物，是具有與序列號6表示的氨基酸序列基本上同一的氨基酸序列的多肽。又，本發明提供的由DANCE的切割生成的其他多肽，是包含相當于序列號2表示的氨基酸序列中第78位到第448位的氨基酸序列(即，序列號8表示的氨基酸序列)的多肽，或其同等物。具體而言，包含序列號8表示的氨基酸序列的多肽的同等物，是具有與序列號8表示的氨基酸序列基本上同一的氨基酸序列的多肽。與序列號6或序列號8表示的氨基酸序列基本上同一的氨基酸序列，是指在序列號6或序列號8中所示的氨基酸序列中取代、缺失、插入或附加1或2個以上(例如1～30個，優選1～20個，更優選1～10個，最優選1～5個)的氨基酸的氨基酸序列。又，作為與序列號6或序列號8表示的氨基酸序列基本上同一的氨基酸序列，可使用與序列號6或8所示的氨基酸序列具有約70％以上，優選約80％以上，更優選約90％以上，進一步優選約95％以上，更進一步優選約97％以上，最優選99％以上的同一性的氨基酸序列。同一性(％)可使用該領域中常用的程序(例如，BLAST、FASTA等)在默認設置狀態下確定。又，另一方面，同一性(％)可使用該領域中眾所周知的任意的算法，例如Needleman等(1970)(J.Mol.Biol.48444-453)、Myers以及Miller(CABIOS，1988，411-17)的算法等確定。Needleman等的算法，是代入GCG軟件包(可從www.gcg.com得到)的GAP程序中，同一性(％)，例如可使用BLOSUM62matrix或PAM250matrix，以及gapweight16、14、12、10、8、6或4，以及lengthweight1、2、3、4、5或6中的任一種確定。又，Myers以及Miller的算法，是代入GCG序列比對軟件包的一部分即ALIGN程序中。為了比較氨基酸序列，利用ALIGN程序時，例如可使用PAM120weightresiduetable、gaplengthpenalty12、gappenalty4。又，包含與序列號6或序列號8表示的氨基酸序列基本上同一的氨基酸序列的多肽，優選分別保持與包含序列號6或序列號8表示的氨基酸序列的多肽同質的活性(這里“活性”與功能意思相同)。“同質的活性”是指活性定性的等同，優選定量的也等同，也可在容許的范圍內(例如，約0.5～約2倍)不同。作為與包含序列號6表示的氨基酸序列的多肽同質的活性，例如可列舉出整聯蛋白結合活性、同型復合體形成活性(換言之，DANCE之間的結合活性)。因此，與包含序列號6表示的氨基酸序列基本上同一的氨基酸序列的多肽，優選保持整聯蛋白結合位點即共有序列Arg-Gly-Asp(RGD)模體(相當于序列號6表示的氨基酸序列中第31位～第33位的氨基酸序列)，和/或同型復合體形成位點。同型復合體形成位點的正確位置，可由缺失解析等已公知的方法鑒定。作為包含與序列號6表示的氨基酸序列基本上同一的氨基酸序列的多肽的優選例，可列舉出包含序列號10表示的氨基酸序列的多肽(小鼠直向同源物)、包含序列號14表示的氨基酸序列的多肽(大鼠直向同源物)。作為與包含序列號8表示的氨基酸序列的多肽同質的活性，例如可列舉出賴氨酰氧化酶結合活性、賴氨酰氧化酶樣-1結合活性、LTBP2結合活性等。因此，與包含序列號8表示的氨基酸序列基本上同一的氨基酸序列的多肽，優選保持賴氨酰氧化酶結合位點、賴氨酰氧化酶樣-1(lysyloxidase-like1)結合位點、LTBP2(LatentTGF-β-bindingprotein2)結合位點中的至少1個以上，優選2個以上，更優選全部。例如，認為LTBP2結合位點存在于DANCE中央的鈣結合性EGF(cbEGF)樣模體[代表性的，如(D/N)X(D/N)(E/Q)Xm(D/N)*Xn(Y/F)其中，m、n為變量，星號表示β羥基化]連續的結構域中(例如，參照實施例6)，但賴氨酰氧化酶結合位點、賴氨酰氧化酶樣-1結合位點、LTBP2結合位點的更準確的位置，可由缺失解析等已公知的方法鑒定。作為包含與序列號8表示的氨基酸基本上同一的氨基酸序列的多肽的優選例，可列舉出包含序列號12表示的氨基酸序列的多肽(小鼠直向同源物)、包含序列號16表示的氨基酸序列的多肽(大鼠直向同源物)。本發明還提供一種編碼包含序列號6或序列號8表示的氨基酸序列的多肽或其等同物的多核苷酸。本發明的多核苷酸，可為DNA或RNA中的任一種。作為編碼包含序列號6或序列號8表示的氨基酸序列的多肽的多核苷酸的優選例，可列舉出包含序列號5或序列號7表示的堿基序列的多核苷酸。另一方面，編碼包含序列號6表示的氨基酸序列的多肽的等同物的多核苷酸，是與序列號5表示的堿基序列的互補序列在嚴格性強的(highstringent)條件下雜交，但與序列號7表示的堿基序列的互補序列在嚴格性強的條件(優選中等程度(moderate)的嚴格條件)下不雜交的多核苷酸。又，編碼包含序列號8表示的氨基酸序列的多肽的等同物的多核苷酸，是與序列號7表示的堿基序列的互補序列在嚴格性強的條件下雜交，但與序列號5表示的堿基序列的互補序列在嚴格性強的條件(優選中等程度的嚴格條件)下不雜交的多核苷酸。上述嚴格性強的條件可參考已報道的條件設定(CurrentProtocolsinMolecularBiology，JohnWiley&Sons，6.3.1-6.3.6，1999)。例如作為嚴格性強的條件下的雜交條件，可列舉出6×SSC(氯化鈉/檸檬酸鈉)/45℃之后，以0.2×SSC/0.1％SDS/50～65℃清洗一次以上。又，作為中等程度的嚴格條件下的雜交條件，例如可列舉出2×SSC/30℃之后，以1×SSC/0.1％SDS/30～50℃清洗一次以上。作為編碼包含序列號6表示的氨基酸序列的多肽的等同物的多核苷酸的優選例，可列舉出包含序列號9表示的堿基序列的多核苷酸(小鼠直向同源物)、包含序列號13表示的堿基序列的多核苷酸(大鼠直向同源物)。作為編碼包含序列號8表示的氨基酸序列的多肽的等同物的多核苷酸的優選例，可列舉出包含序列號11表示的堿基序列的多核苷酸(小鼠直向同源物)、包含序列號15表示的堿基序列的多核苷酸(大鼠直向同源物)。2.切割型DANCE，以及編碼該切割型DANCE的多核苷酸的制備方法2.1.非切割方法本發明的多核苷酸，可由已公知的方法制備。例如，編碼包含序列號6或序列號8表示的氨基酸序列的多肽的多核苷酸，可由從其表達部位(例如心臟、卵巢、結腸等)提取總RNA，從mRNA制備cDNA之后，使用適當的引物進行PCR而克隆。又，編碼包含序列號6或序列號8表示的氨基酸序列的多肽的等同物的多核苷酸，可由于如上述克隆的多核苷酸中引入突變而制備。作為誘變法，例如合成寡核苷酸定點誘變法(帶缺口的雙鏈體(gappedduplex))法、隨機引入點突變的方法(例如以亞硝酸或亞硫酸處理)、盒式誘變法、接頭掃描法、錯配引物法等方法。又，本發明的多肽也可由已公知的方法制備。例如，于表達載體中插入如上述制備的本發明的多核苷酸，將得到的重組載體導入適當的宿主細胞中、得到轉化體之后，培養轉化體，產生本發明的多肽，然后可回收本發明的多肽。本發明還提供一種重組載體，以及導入該載體的轉化體。作為表達載體沒有特別的限制，可在原核細胞和/或真核細胞的各種宿主細胞中表達編碼本發明的多肽的基因，且產生這些多肽即可。例如，可列舉出質粒載體、病毒載體(如腺病毒、反轉錄病毒)等。使用細菌，特別是大腸桿菌作為宿主細胞時，表達載體一般至少由啟動子-操縱基因、起始密碼子、編碼本發明多肽的DNA、終止密碼子、終止子區域以及可復制單位構成。使用酵母、動物細胞或昆蟲細胞作為宿主時，表達載體優選至少含有啟動子、起始密碼子、編碼本發明多肽的DNA、終止密碼子。又，還可含有增強子序列、編碼本發明多肽的基因的5’端以及3’端的非翻譯區、剪接接合區、聚腺苷酸化位點、選擇標記區或可復制單位等。又，根據需要還可含有常用的基因擴增基因(標記)。細菌中用以表達本發明的多肽的啟動子-操縱基因，含有啟動子、操縱基因以及Shine-Dalgarno(SD)序列(如AAGG等)。例如宿主為大腸桿菌屬細菌時，可示例優選含有Trp啟動子、lac啟動子、recA啟動子、λPL啟動子、lpp啟動子、tac啟動子等的大腸桿菌。作為酵母中用以表達本發明的多肽的啟動子，可列舉出PH05啟動子、PGK啟動子、GAP啟動子、ADH啟動子；宿主為芽孢桿菌屬細菌時，可列舉出SL01啟動子、SP02啟動子、penP啟動子等。又，宿主為哺乳動物細胞等的真核細胞時，可列舉出來自SV40的啟動子、反轉錄病毒的啟動子、熱激啟動子等。關于終止子區域、可復制單位、增強子序列、聚腺苷酸化位點以及剪接接合位點，可使用已公知的物質。作為選擇標記，可使用已公知的物質。例如可示例四環素、氨芐青霉素或卡那霉素等抗生素抗性基因等。作為基因擴增基因，例如二氫葉酸還原酶(DHFR)基因、胸苷激酶基因、新霉素抗性基因、谷氨酸合成酶基因、腺苷脫氨酶基因、鳥氨酸脫羧酶基因、潮霉素B磷酸轉移酶基因、天冬氨酸轉氨甲酰酶基因等。本發明的重組載體，可通過將至少上述的啟動子、起始密碼子、編碼本發明的多肽的DNA、終止密碼子以及終止子區域連續且環狀地連接于適當的可復制單位而制備。此時，根據需要可使用由限制酶的消化或使用T4DNA連接酶連接等常用方法產生的適當的DNA片段(例如，連接體、其他的限制酶酶切位點等)。本發明的轉化體，可通過于宿主細胞中引入上述的重組載體而制備。作為轉化體的制備中使用的宿主細胞，只要適合上述的表達載體，且可轉化則無特別的限制，可示例本發明的
背景技術：
中通常使用的天然細胞或人工建立的重組細胞等各種細胞(例如，細菌(埃希氏桿菌屬細菌、芽孢桿菌屬細菌))、酵母(酵母菌屬、畢赤氏酵母菌屬等)、動物細胞或昆蟲細胞(優選Sf9)等。表達載體向宿主細胞的引入可使用已公知的方法進行。例如，對于動物細胞，如可根據Graham的方法(Virology，Vol.52，p.456，1973)進行轉化；對于昆蟲細胞，如可根據Summers等的方法(Mol.Cell.Biol.，Vio.3，p.2156-2165，1983)進行轉化。本發明的多肽，可通過用營養培養基培養含有如上述制備的表達載體的轉化體而制備。營養培養基優選含有轉化體生長所必需的碳源、無機氮源或有機氮源。作為碳源，例如葡萄糖、葡聚糖、可溶性淀粉、蔗糖等；作為無機氮源或有機氮源，例如銨鹽類、硝酸鹽類、氨基酸、玉米漿、蛋白胨、酪蛋白、肉膏、豆餅、馬鈴薯提取液等。根據需要也可含有其他的營養素(例如，無機鹽(如氯化鈣、磷酸二氫鈉、氯化鎂)、維生素類、抗生素(如四環素、新霉素、氨芐青霉素、卡那霉素等)等)。轉化體的培養可由已公知的方法進行。培養條件，如溫度、培養基的pH值以及培養時間，可適宜選擇以便可大量生產本發明的多肽。再者，下面示例對應于宿主細胞使用的具體的培養基以及培養條件，但并不限定于此。宿主為動物細胞時，作為培養基例如可使用含約5～20％的胎牛血清的MEM培養基(Science，Vol.122，p.501，1952)、DMEM培養基(Virology，Vol.8，p.396，1959)、RPMI1640培養基(J.Am.Med.Assoc.，Vol.199，p.519，1967)、199培養基(proc.Soc.Exp.Biol.Med.，Vol.73，p.1，1950)等。培養基的pH值優選約6～8，培養在通常約30～40℃下進行約15～72小時，根據需要可進行通氣或攪拌。宿主為昆蟲細胞時，例如可列舉含胎牛血清的Grace’s培養基(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，Vol.82，p.8404.1985)等，其pH值優選約5～8。培養在通常約20～40℃下進行15～100小時，根據需要可進行通氣或攪拌。宿主為細菌、放線菌、酵母、線狀菌時，例如含有上述營養源的液體培養基較合適。優選pH值為5～8的培養基。宿主為大腸桿菌時，作為優選培養基可示例LB培養基、M9培養基(Miller等，Exp.Mol.Genet，ColdSpringHarborLaboratory，p.431，1972)等。此時，培養根據需要進行通氣、攪拌，同時在通常14～43℃下進行約3～24小時。宿主為芽孢桿菌屬細菌時，根據需要進行通氣、攪拌，同時在通常30～40℃下進行約16～96小時。宿主為酵母時，作為培養基，例如可列舉Burkholder基本培養基(Bostian，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，Vol.77，p.4505，1980)，優選pH值為5～8。培養在通常約20～35℃下進行約14～144小時，根據需要可進行通氣或攪拌。本發明的多肽，可從經培養的如上述的轉化體回收，優選分離、純化。作為分離、純化方法，例如鹽析、溶劑沉淀法等利用溶解度的方法；透析、超濾、凝膠過濾、十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳等利用分子量的差異的方法；離子交換色譜法及羥基磷灰石色譜法等利用電荷的方法；親和色譜法等利用特異的親和性的方法；逆相高效液相色譜法等利用疏水性差異的方法；等電點電泳等利用等電點差異的方法等。又，通過在轉化體中產生附有標記物(例如，組氨酸標記物、Flag標記物)等的多肽，且使用對該標記物具有親和性的物質(例如，Ni2+樹脂、對標記物特異的抗體)，可更簡便地分離、純化本發明的多肽。進一步，本發明的多肽可在無細胞體系中合成。無細胞體系中的本發明的多肽的合成，例如可使用大腸桿菌、兔網織紅細胞、麥胚提取液等。又，本發明的多肽可由固相合成法、液相合成法等已公知的有機化學的方法制備。2.2.切割方法又，本發明的多肽，通過使DANCE與DANCE特異的蛋白酶接觸，切割DANCE而得到。本發明還進一步提供這種切割方法。本方法中DANCE與DANCE特異的蛋白酶的接觸，只要是在序列號2表示的氨基酸序列中第77位與第78位氨基酸之間切割，則可以為任何形式，作為達成該切割的接觸形式，例如可列舉培養表達DANCE以及DANCE特異的蛋白酶兩者的細胞。該細胞的培養，可基于上述轉化體的培養進行。表達DANCE以及DANCE特異的蛋白酶兩者的細胞，只要表達這兩種蛋白質即可并無特別的限制。這種細胞，例如可通過將DANCE特異的蛋白酶表達載體引入DANCE表達細胞(如，天然表達DANCE的細胞，或由于基因操作而可能表達DANCE的細胞)中、將DANCE表達載體引入DANCE特異的蛋白酶表達細胞中、將DANCE表達載體以及DANCE特異的蛋白酶表達載體引入任意的細胞中等而制備。又，以增強表達為目的，可在DANCE和/或DANCE特異的蛋白酶的表達細胞中分別引入DANCE和/或DANCE特異的蛋白酶的表達載體。DANCE表達細胞可以是原代培養細胞或細胞系。作為DANCE的主要表達部位，沒有特別的限制，例如已知心臟、腎臟、胰腺、睪丸、卵巢、小腸、結腸、動脈、肺、子宮、皮膚，所以來自這些表達部位相應的組織的細胞本身，或從其衍生的細胞可用作DANCE表達細胞使用。原代培養細胞、細胞系可由已公知的方法制備(如，參照CurrentProtocolsinCellBiology，JohnWiley&Sons，Inc.(2001)；機能細胞の分離と培養，丸善書店(1987))。關于DANCE特異的蛋白酶表達細胞，為原代培養細胞、細胞系均可。例如確認在皮膚成纖維細胞、293T細胞等細胞，以及肺、皮膚等組織中DANCE特異的蛋白酶的表達，所以這些細胞本身，或來自這些組織的細胞，或從該等衍生的細胞，可作為DANCE特異的蛋白酶表達細胞使用。又，在評價某細胞是否具有DANCE切割活性的結果表明，其是具有DANCE切割活性的細胞后，也可將其作為DANCE特異的蛋白酶表達細胞使用。本發明還提供一種使用動物細胞(如人細胞等哺乳動物細胞)鑒定這種DANCE特異的蛋白酶表達細胞的方法。作為本切割方法中使用的細胞種類，可使用與上述轉化體制備中使用的宿主相同種類的細胞，其中優選昆蟲細胞、動物細胞(如哺乳動物細胞)。DANCE表達載體，可由與表達本發明的多肽的載體相同的方法制備。DANCE特異的蛋白酶表達載體，可由后述DANCE特異的蛋白酶的篩選方法中所示的方法制備。再者，DANCE特異的蛋白酶表達載體，在后述的表達篩選中，可從DANCE特異的表達載體濃縮的轉化體得到，也可作為與除DANCE特異的蛋白酶以外的基因產物表達載體的混合物使用。作為本切割方法中接觸的其他形式，可列舉向含DANCE特異的蛋白酶的組分中添加DANCE。含DANCE特異的蛋白酶的的組分，只要具有DANCE的切割活性即可并無特別的限制，例如可列舉DANCE特異的蛋白酶表達細胞的培養上清液、該細胞的提取液、表達DANCE特異的蛋白酶的組織的提取液、該培養上清液或提取液的粗純化溶液等。又，DANCE特異的蛋白酶分離純化時，也可以通過含DANCE的組分或分離的DANCE與分離的DANCE特異的蛋白酶的混合，來進行DANCE的切割。DANCE特異的蛋白酶對DANCE的切割，可采用抗DANCE抗體的免疫學手法(如，免疫沉淀法、蛋白質印跡法)等確認。本切割方法，不僅用于本發明的多肽的制備，還可在本發明的篩選方法中作為指標應用。3.抗由DANCE的切割產生的N末端以及C末端多肽的抗體本發明還提供一種抗由DANCE特異的蛋白酶對DANCE的切割產生的N末端的多肽(即，包含序列號6表示的氨基酸序列的多肽或其同等物)的抗體，以及抗產生的C末端的多肽(即，包含序列號8表示的氨基酸序列的多肽或其同等物)的抗體。作為本發明的抗體的制備中使用的抗原，可使用包含序列號6或序列號8表示的氨基酸序列的多肽或其同等物，或者其部分肽。作為部分肽，只要具有抗原性即可并無特別限制，例如由選自序列號6或序列號8表示的氨基酸序列，或與序列號6或序列號8表示的氨基酸序列基本上同一的氨基酸序列中的至少6個，優選至少8個，更優選至少10個，進一步優選至少15個以上的連續的氨基酸組成的多肽。本發明的抗體，可為多克隆抗體或單克隆抗體，可由眾所周知的免疫學手法制備。該抗體，不僅可以是完整的抗體分子，而且可以是片段只要其具有對于本發明的蛋白質的抗原結合位點(CDR)，例如可列舉Fab、F(ab’)2、ScFv、minibody等。例如，多克隆抗體，可通過將上述抗原(根據需要，也可于牛血清蛋白、KLH(匙孔血藍蛋白，KeyholeLimpetHemocyanin)等載體蛋白上交聯形成復合體)，與市售的佐劑(例如，完全或不完全弗氏佐劑)一起，于動物皮下或腹腔內每隔2～3周給藥2～4次左右(由眾所周知的抗原抗體反應測定部分采血的血清的抗體效價，確認其上升)，自最終免疫約3～10天后取全血純化抗血清而得到。作為給予抗原的動物，可列舉大鼠、小鼠、家兔、山羊、豚鼠、倉鼠等哺乳動物。又，單克隆抗體，可由細胞融合法制得。例如將上述抗原與市售佐劑一起2～4次于小鼠皮下或腹腔內給藥，最終給藥的3天后摘取脾臟或淋巴結，取白細胞。將該白血球和骨髓瘤細胞(例如，NS-1、P3X63Ag8等)進行細胞融合得到對于該因子產生單克隆抗體的雜交瘤。細胞融合可為PEG法或電壓脈沖法。產生期望的單克隆抗體的雜交瘤，可通過使用眾所周知的EIA或RIA法等從培養液上清中檢測與抗原特異的結合的抗體而進行選擇。產生單克隆抗體的雜交瘤的培養，可在體外，或者小鼠或大鼠，優選小鼠腹水中等的體內進行，抗體可分別從雜交瘤的培養上清液以及動物的腹水中取得。進一步，本發明的抗體，可為嵌合抗體、人源化抗體、人抗體、嵌合抗體。嵌合抗體，可參考例如“實驗醫學(臨時增刊號)，Vol.6，No.10，1988”、日本專利特公平3-73280號公報等進行制備；人源化抗體，可參考例如特表平4-506458號公報、特開昭62-296890號公報等進行制備；人抗體，可參考例如“NatureGenetics，Vol.15，p.146-156，1997”、“NatureGenetics，Vol.7，p.13-21，1994”、日本專利特表平4-504365號公報、WO94/25585號公報、“日経サィェンス，6月號，第40～50頁，1995年”、“Nature，Vol.368，p.856-859，1994”、特表平6-500233號公報等進行制備。本發明的抗體，可特異的檢出或抑制本發明的多肽之一，所以例如用以實施本發明的篩選方法，以及作為彈性纖維形成調節劑及關于DANCE的研究·診斷用試劑有用。4.DANCE切割量以及切割活性的測定方法、試劑盒本發明提供一種以測定由DANCE特異的蛋白酶對DANCE的切割量和/或切割活性為特征的方法，其中提供一種在來自動物的生物樣品中測定由DANCE特異的蛋白酶對DANCE的切割量為特征的方法，以及該測定中所使用的試劑盒。本方法中，使用來自動物的生物樣品時，使用的動物為溫血動物即可，并無特別限制，例如可為哺乳動物。哺乳動物沒有特別的限制，例如可列舉人、牛、羊、豬、山羊、猴子、家兔、大鼠、倉鼠、豚鼠以及小鼠。生物樣品，為可從上述動物取得的樣品即可并無特別限制。作為生物樣品，例如可列舉從皮膚、動脈、肺、子宮等組織取得的樣品。DANCE切割量可由已公知的方法測定。例如DANCE切割量可通過使用抗DANCE抗體的免疫學方法(例如蛋白質印跡法)測定。該情形，不限于上述本發明的抗體，還可使用任意的抗DANCE抗體(例如，使用跨過DANCE的切割位點的部分肽作為抗原制備的抗體)。該抗體，可基于上述抗體的制備方法進行制備。DANCE切割量的測定中使用抗DANCE抗體時，例如可通過使用標記的抗DANCE抗體，或并用抗DANCE抗體和標記的2次抗體，測定DANCE切割量。作為抗DANCE抗體的標記，可列舉堿性磷酸酶、葡糖氧化酶、過氧化物酶、β-半乳糖苷酶等酶，熒光物質等。這些標記與抗DANCE抗體的結合可采用已公知的方法，例如戊二醛法、馬來酰亞胺法等進行。標記是酶時，作為底物，選擇與所選酶相對應的適當的底物。例如，作為酶選擇堿性磷酸酶時，可列舉使用對硝基苯磷酸(PNPP)等，作為此時的顯色劑，可使用鄰苯二胺(OPD)、四甲基聯苯胺(TMB)等。又，關于清洗液、反應終止液、底物溶解液，也沒有特別的限制，可根據所選的酶，適宜使用已公知的物質。又，DANCE的切割活性，例如，通過構建、使用具有DANCE切割位點的多肽的一端結合熒光分子，另一端結合猝滅劑，僅在產生切割時發出熒光的系統，進行測定。這種系統的構建，可采用已公知的方法進行。作為DANCE切割活性的測定中使用的熒光分子，只要可評價DANCE切割活性即可并無特別限制，例如可列舉FITC、6-FAM、HEX、TET、EDANS、Alexa(注冊商標)Fluor(Invitrogen)等。作為DANCE切割活性的測定中使用的猝滅劑，只要可評價DANCE切割活性即可并無特別限制，例如可列舉TAMRA、Dabcyl、Eclipse、QSY猝滅劑色素(Invitrogen)等。本發明的測定方法，例如實施本發明的篩選方法，以及使彈性纖維形成的狀態中的診斷，特別是使分子水平的解析變得可能，故是有用的。又，本發明涉及一種可用于測定DANCE切割量和/或切割活性的試劑盒。可用于測定DANCE切割量的本發明的試劑盒，除上述抗DANCE抗體之外，還可含有DANCE、2次抗體、標記酶的底物、生物樣品的處理中必要的試劑等。作為對照該試劑盒還可含有通過DANCE的切割產生的多肽(即，本發明的多肽)的一種，或兩種。該試劑盒，還可含有標明DANCE切割活性可作為彈性纖維形成的指標的觀點的說明書。本發明的測定用試劑盒，提供了可簡便地測定DANCE切割量和/或切割活性的方法，故是有用的。5.DANCE突變體，編碼該DANCE突變體的多核苷酸又，本發明提供一種在DANCE特異的蛋白酶對DANCE的切割位點誘發氨基酸突變，所形成的對該蛋白酶顯示出抗性的DANCE突變體，以及編碼該多肽的多核苷酸。本發明的DANCE突變體，其特征在于，為了顯示對DANCE特異的蛋白酶的抗性在序列號2或序列號4表示的氨基酸序列中，或在與序列號2或序列號4表示的氨基酸序列基本上同一的氨基酸序列中，蛋白酶酶切位點(Arg-Gly相當于序列號2表示的氨基酸序列中第77位～第78位的氨基酸，以及序列號4表示的氨基酸序列中第54位～第55位的氨基酸)或其附近的氨基酸(例如，序列號2表示的氨基酸序列中第70位～第85位，優選第72位～第83位，更優選第74位～第81位，進一步優選第76位～第79位的氨基酸；或者序列號4表示的氨基酸序列中第47位～第62位，優選第49位～第60位，更優選第51位～第59位，進一步優選第53位～第56位的氨基酸)發生突變(例如，缺失、附加、取代)。這里的“基本上同一”與上文中所述的意思相同。“對DANCE特異的蛋白酶顯示出抗性”，是指DANCE特異的蛋白酶對DANCE的切割能力，在其發生突變后降低(例如降低75％以下，優選50％以下)，切割能力的降低程度沒有特別的限制。DANCE突變體是否對DANCE特異的蛋白酶顯示出抗性，可由上述切割方法進行正常DANCE、DANCE突變體的切割處理之后，測定·比較正常DANCE、DANCE突變體的切割量而確認。作為本發明的DANCE突變體，例如可列舉由序列號2表示的氨基酸序列中，或與序列號2表示的氨基酸序列基本上同一的氨基酸序列中，第77位的精氨酸被丙氨酸取代的氨基酸序列組成的多肽；以及由序列號4表示的氨基酸序列中，或與序列號4表示的氨基酸序列基本上同一的氨基酸序列中，第54位的精氨酸被丙氨酸取代的氨基酸序列組成的多肽。本發明還提供一種含本發明的DANCE突變體的重組載體，以及含該載體的轉化體。本發明的DANCE突變體以及編碼該突變體的多核苷酸，例如作為本發明的篩選方法中的負對照，以及作為彈性纖維形成調節劑(例如用于彈性纖維的形成)以及研究用試劑有用。6.DANCE復合體6.1含有至少2個DANCE的DANCE復合體(復合體I)本發明提供一種含有至少2個DANCE的DANCE復合體(復合體I)。本復合體I可進一步含有賴氨酰氧化酶和/或LTBP2。賴氨酰氧化酶和/或LTBP2可如后述制備。本復合體I還可進一步含有整聯蛋白和/或賴氨酰氧化酶樣-1。作為本發明中可使用的整聯蛋白，可列舉各種整聯蛋白，其中優選α5β1、αubβ3、全部的αvβ、α9β1。這些整聯蛋白以及賴氨酰氧化酶樣-1，及其表達部位是眾所周知的，基因的克隆、表達細胞的制備可由已公知的方法進行。優選復合體I含有可識別形態的至少2種類的DANCE。這里“可識別的形態”是指，至少2個DANCE存在差異，該差異可檢出。作為DANCE的可識別形態的組合，可示例標記DANCE與非標記DANCE的組合、2個不同的標記DANCE的組合。DANCE的標記，只要標記體與非標記體或不同種類標記體可識別即可并無特別的限制，例如可列舉由表位標記、由放射性同位素(例如，35S)標記。作為DANCE的標記中使用的表位，例如可列舉出谷胱甘肽S-轉移酶(GST)、麥芽糖結合蛋白(MBP)、流感血凝素(HA)、硫氧還蛋白(Trx)、組氨酸(His)標記物、FLAG標記物、Myc標記物等。本發明的復合體I可進一步含有選自賴氨酰氧化酶、LTBP2、整聯蛋白、以及賴氨酰氧化酶樣-1中的1個以上的情形，其可標記也可不標記。表位標記DANCE，可由已公知的方法制備。例如于編碼表位的核苷酸上適宜地連接編碼DANCE的多核苷酸，制備DNA構建物，通過在宿主細胞中表達該DNA構建物而制備表位標記DANCE。另一方面，放射性同位素(例如，35S)標記DANCE，可由含有放射性同位素的培養基培養DANCE表達細胞而制備。本發明還提供一種上述復合體I的制備方法。復合體I的制備方法的特征在于使至少2個DANCE接觸而形成復合體。又，制備復合體I時，也可進一步使之與賴氨酰氧化酶和/或LTBP2接觸。也可進一步與整聯蛋白和/或賴氨酰氧化酶樣-1接觸。復合體I的形成，可由DANCE的制備(即，伴隨著DANCE的制備的必然的結合)，或著由分別制備的至少2種的DANCE(標記DANCE-非標記DANCE、2個不同的標記DANCE)的接觸而完成。更具體的是，復合體I的形成，可由分離的DANCE(例如，可識別形態)與分離的DANCE的接觸，以及將DANCE表達載體引入DANCE表達細胞(含體外，體內)等而完成。復合體I，特別是含有可識別形態的至少2種DANCE的復合體，以及該復合體的制備方法，在可調節DANCE復合體的形成的物質的篩選方法中作為指標，以及作為彈性纖維形成調節劑及關于DANCE的研究用試劑有用。6.2.含至少1個DANCE以及賴氨酰氧化酶的DANCE復合體(復合體II)本發明提供一種含至少1個DANCE以及賴氨酰氧化酶的DANCE復合體(復合體II)。本復合體II可進一步含有DANCE(例如，可識別形態的DANCE)和/或LTBP2。本復合體II還可進一步含有整聯蛋白和/或賴氨酰氧化酶樣-1。再者，LTBP2、整聯蛋白、賴氨酰氧化酶樣-1可分別如上述標記，也可不標記。本發明還提供一種上述復合體II的制備方法。復合體II的制備方法的特征在于將至少1個DANCE與賴氨酰氧化酶接觸而形成復合體。又，制備復合體II時，也可進一步與DANCE(例如，可識別形態的DANCE)和/或LTBP2接觸。進一步，也可與整聯蛋白和/或賴氨酰氧化酶樣-1接觸。復合體II的形成，例如可由未標記DANCE與未標記賴氨酰氧化酶的接觸、未標記DANCE與標記賴氨酰氧化酶的接觸、標記DANCE與未標記賴氨酰氧化酶的接觸、具有同種的標記的DANCE與賴氨酰氧化酶的接觸、或者分別具有不同標記的DANCE與賴氨酰氧化酶的接觸而完成。更具體的是，復合體II的形成，可由分離的DANCE與分離的賴氨酰氧化酶的接觸、將賴氨酰氧化酶表達載體引入DANCE表達細胞，以及將DANCE表達載體導入賴氨酰氧化酶表達細胞(含體外，體內)等而完成。賴氨酰氧化酶，及其表達部位是眾所周知的。因此，賴氨酰氧化酶表達載體，以及賴氨酰氧化酶表達細胞(例如，原代培養細胞、細胞系)可由已公知的方法制備。例如，確認賴氨酰氧化酶在血管平滑肌、皮膚、成纖維細胞等細胞，以及動脈、皮膚、肺、子宮等組織中表達，所以從這些細胞、組織可克隆賴氨酰氧化酶基因，又，可制備賴氨酰氧化酶表達細胞。復合體II，以及該復合體的制備方法，在可調節DANCE復合體的形成的物質的篩選方法中作為指標，以及作為彈性纖維形成調節劑以及關于DANCE的研究用試劑有用。6.3.含至少1個DANCE以及LTBP2的DANCE復合體(復合體III)本發明提供一種含至少1個DANCE以及LTBP2的DANCE復合體(復合體III)。本復合體III可進一步含有DANCE(例如，可識別形態的DANCE)和/或賴氨酰氧化酶。本復合體III還可進一步含有整聯蛋白和/或賴氨酰氧化酶樣-1。再者，賴氨酰氧化酶、整聯蛋白、賴氨酰氧化酶樣-1可分別如上述標記，也可不標記。本發明還提供一種上述復合體III的制備方法。復合體III的制備方法的特征在于將至少1個DANCE與LTBP2接觸而形成復合體。又，制備復合體III時，也可進一步與DANCE(例如，可識別形態的DANCE)和/或賴氨酰氧化酶接觸。進一步，也可與整聯蛋白和/或賴氨酰氧化酶樣-1接觸。復合體III的形成，例如可由未標記DANCE與未標記LTBP2的接觸、未標記DANCE與標記LTBP2的接觸、標記DANCE與未標記LTBP2的接觸、具有同種的標記的DANCE與LTBP2的接觸、或者分別具有不同標記的DANCE與LTBP2的接觸而完成。更具體的是，復合體III的形成，可由分離的DANCE與分離的LTBP2的接觸，以及將LTBP2表達載體引入DANCE表達細胞，以及將DANCE表達載體導入LTBP2表達細胞(含體外，體內)等而完成。LTBP2及其表達部位是眾所周知的。因此，LTBP2表達載體，以及LTBP2表達細胞(例如，原代培養細胞、細胞系)可由已公知的方法制備。例如，確認LTBP2在血管平滑肌細胞、皮膚成纖維細胞等細胞，以及動脈、皮膚、肺、子宮等組織中表達，所以從這些細胞、組織可克隆LTBP2基因，又，可制備LTBP2表達細胞。復合體III以及該復合體的制備方法，在可調節DANCE復合體的形成的物質的篩選方法中作為指標，以及作為彈性纖維形成調節劑及關于DANCE的研究用試劑有用。7.篩選方法本發明提供各種篩選方法。本發明的篩選方法大致分為可調節DANCE特異的蛋白酶的活性的物質的篩選方法(篩選方法I、II)、可調節DANCE復合體的形成的物質的篩選方法(篩選方法III～V)、DANCE特異的蛋白酶的篩選方法(篩選方法VI)。以下詳述各種篩選方法。7.1.可調節DANCE特異的蛋白酶的活性的物質的篩選方法(體外)(篩選方法I)篩選方法I，只要不使用動物評價DANCE特異的蛋白酶的活性即可并無特別的限制，例如含有以下步驟(a)、(b)以及(c)(a)將被檢物質與DANCE特異的蛋白酶接觸的步驟；(b)測定由上述(a)步驟產生的DANCE特異的蛋白酶的活性，將該活性與未接觸被檢物質的情況下的DANCE特異的蛋白酶的活性進行比較的步驟；(c)基于上述(b)的比較結果，對調節DANCE特異的蛋白酶活性的被檢物質進行選擇的步驟。再者，可調節DANCE特異的蛋白酶的活性的物質，不僅包含稱為DANCE特異的蛋白酶的激動劑、拮抗劑，還包含就本篩選方法I的本質而言，可改變DANCE特異的蛋白酶的表達量的物質。步驟(a)中，作為被檢物質，可為任意眾所周知的化合物以及新型化合物，例如可列舉核酸、糖類、脂質、蛋白質、肽、有機低分子化合物、采用組合化學技術制備的化合物文庫、由固相合成或噬菌體展示法制備的隨機肽文庫、或者來自微生物、動植物、海洋生物等的天然成分等。被檢物質與DANCE特異的蛋白酶的接觸，與“2.2.切割方法”中所述的接觸相同。步驟(b)中，DANCE特異的蛋白酶的活性，可基于DANCE切割量和/或切割活性進行評價。例如，DANCE切割量以及切割活性，可由“4.DANCE切割量以及切割活性的測定方法、試劑盒”中所述的方法進行測定。DANCE切割量和/或切割活性的比較，可基于被檢物質的存在或不存在的情況下、DANCE切割量和/或切割活性有無顯著性差異而進行。再者，被檢物質不存在下DANCE切割量和/或切割活性，可在被檢物質存在下DANCE切割量和/或切割活性的測定之前測定，也可同時測定，但從實驗的精密度、重現性觀點考慮，優選兩者同時測定。然后，步驟(c)中，選擇可調節DANCE特異的蛋白酶的活性的被檢物質。這樣選擇的被檢物質，作為彈性纖維形成調節劑或研究用試劑有用。例如抑制DANCE特異的蛋白酶的活性的物質，對維持彈性纖維形成有用。7.2.可調節DANCE特異的蛋白酶的活性的物質的篩選方法(體內)(篩選方法II)篩選方法II，只要是使用動物評價DANCE特異的蛋白酶活性即可并無特別限制，例如，包含以下步驟(a)、(b)以及(c)(a)給予動物被檢物質的步驟；(b)測定由上述(a)步驟產生的DANCE特異的蛋白酶的活性，將該活性與未給予被檢物質的情形的DANCE特異的蛋白酶的活性進行比較的步驟；(c)基于上述(b)的結果，對調節DANCE特異的蛋白酶活性的被檢物質進行選擇的步驟。再者，可調節DANCE特異的蛋白酶的活性的物質，不僅包含稱為DANCE特異的蛋白酶的激動劑、拮抗劑，還包含就本篩選方法II的本質而言，可改變DANCE特異的蛋白酶的表達量的物質。步驟(a)中，作為被檢物質，可使用與篩選方法I中相同的物質。被檢物質對動物的給藥，可由已公知的方法進行。給藥量·頻率、給藥期間可任意設定。再者，本方法適用的動物，與“4.DANCE切割量的測定方法、試劑盒”中所述的動物相同。步驟(b)中，DANCE特異的蛋白酶的活性，例如可基于從對象動物采取生物樣品后，該生物樣品中的DANCE切割量進行評價。生物樣品、DANCE切割量的測定方法，與“4.DANCE切割量的測定方法、試劑盒”中所述的相同。DANCE切割量的比較，基于被檢物質給藥時、未給藥時，DANCE切割量有無顯著性差異而進行。再者，被檢物質未給藥時的DANCE切割量，可在被檢物質給藥時的DANCE切割量的測定之前測定，也可與之同時測定，但從實驗的精密度、再現性的觀點考慮，優選二者同時測定。然后，步驟(c)中，選擇可調節DANCE特異的蛋白酶的活性的被檢物質。這樣選擇的被檢物質，作為彈性纖維形成調節劑或研究用試劑有用。例如抑制DANCE特異的蛋白酶的活性的物質，對維持彈性纖維形成有用。7.3.可調節含有至少2個DANCE的DANCE復合體(復合體I)的形成的物質的篩選方法(篩選方法III)篩選方法III，只要可評價復合體I的形成即可并無特別的限制，例如，包含以下步驟(a)、(b)以及(c)(a)被檢物質存在下，至少2個DANCE相接觸的步驟；(b)測定由上述(a)步驟產生的DANCE復合體的量，將該量與不存在被檢物質的情形的DANCE復合體的量進行比較的步驟；(c)基于上述(b)的比較結果，對調節DANCE復合體的形成的被檢物質進行選擇的步驟。步驟(a)中，作為被檢物質，可使用與篩選方法I中相同的物質。至少2個DANCE的接觸，與“6.1.含有至少2個DANCE的DANCE復合體(復合體I)”中所述的接觸相同。再者，本篩選方法III中優選使用可識別形態的DANCE。步驟(b)中，復合體I的量，例如可由并用免疫沉淀法(例如參照實施例6)和光密度測定法；表面等離振子共振等相互作用解析法；基于ELISA的方法等進行測定。復合體I的量的比較，可基于被檢物質存在或不存在下，復合體I的量有無顯著性差異而進行。再者，被檢物質不存在下復合體I的量，可在被檢物質存在下復合體I的量的測定之前測定，也可與之同時測定，但從實驗的精密度、再現性的觀點考慮，優選二者同時測定。然后，步驟(c)中，選擇可調節復合體I的形成的被檢物質。這樣選擇的被檢物質，作為彈性纖維形成調節劑或研究用試劑有用。例如促進復合體I的形成的物質，在彈性纖維形成中有用。7.4.可調節含有至少1個DANCE以及賴氨酰氧化酶的DANCE復合體(復合體II)的形成的物質的篩選方法(篩選方法IV)篩選方法IV，只要可評價復合體II的形成即可并無特別的限制，例如，包含以下步驟(a)、(b)以及(c)(a)被檢物質存在下，使至少1個DANCE與賴氨酰氧化酶接觸的步驟；(b)測定由上述(a)步驟產生的DANCE復合體的量，將該量與不存在被檢物質的情形的DANCE復合體的量進行比較的步驟；(c)基于上述(b)的比較結果，對調節DANCE復合體的形成的被檢物質進行選擇的步驟。步驟(a)中，作為被檢物質，可使用與篩選方法I中相同的物質。至少1個DANCE與賴氨酰氧化酶的接觸，與“6.2.含有至少1個DANCE以及賴氨酰氧化酶的DANCE復合體(復合體I)”中所述的接觸相同。步驟(b)中，復合體II的量，例如可由并用免疫沉淀法(例如參照實施例7)和光密度測定法；表面等離振子共振等相互作用解析法；基于ELISA的方法等進行測定。復合體II的量的比較，可基于被檢物質存在或不存在下，復合體II的量有無顯著性差異而進行。再者，被檢物質不存在下復合體II的量，可在被檢物質存在下復合體II的量的測定之前測定，也可與之同時測定，但從實驗的精密度、再現性的觀點考慮，優選二者同時測定。然后，步驟(c)中，選擇可調節復合體II的形成的被檢物質。這樣選擇的被檢物質，作為彈性纖維形成調節劑或研究用試劑有用。7.5.可調節含有至少1個DANCE以及LTBP2的DANCE復合體(復合體III)的形成的物質的篩選方法(篩選方法V)篩選方法V，只要可評價復合體III的形成即可并無特別的限制，例如，包含以下步驟(a)、(b)以及(c)(a)被檢物質存在下，使至少1個DANCE與LTBP2接觸的步驟；(b)測定由上述(a)步驟產生的DANCE復合體的量，將該量與不存在被檢物質的情形的DANCE復合體的量進行比較的步驟；(c)基于上述(b)的比較結果，對調節DANCE復合體的形成的被檢物質進行選擇的步驟。步驟(a)中，作為被檢物質，可使用與篩選方法I中相同的物質。至少1個DANCE與LTBP2的接觸，與“6.3.含有至少1個DANCE以及LTBP2的DANCE復合體(復合體III)”中所述的接觸相同。步驟(b)中，復合體III的量，例如可由并用免疫沉淀法(例如參照實施例6)和光密度測定法；表面等離振子共振等相互作用解析法；基于ELISA的方法等進行測定。復合體III的量的比較，可基于被檢物質存在或不存在下，復合體III的量有無顯著性差異而進行。再者，被檢物質不存在下復合體III的量，可在被檢物質存在下復合體III的量的測定之前測定，也可與之同時測定，但從實驗的精密度、再現性的觀點考慮，優選二者同時測定。然后，步驟(c)中，選擇可調節復合體III的形成的被檢物質。這樣選擇的被檢物質，作為彈性纖維形成調節劑或研究用試劑有用。7.6.DANCE特異的蛋白酶的篩選方法(篩選方法VI)篩選方法VI的特征在于以DANCE的切割活性為指標篩選DANCE特異的蛋白酶。DANCE特異的蛋白酶，例如可從表達該蛋白酶的細胞得到。DANCE特異的蛋白酶表達細胞，與“2.2.切割方法”中所述的細胞相同。例如，作為篩選方法VI，可使用表達克隆的方法(例如，參照MolecularCloning(第二版)；CurrentprotocolsinMolecularBiology(第3版)，Acad.Press(1993)；AntibodyEngineeringAPracticalApproach，IRLPressatOxfordUniversityPress(1996))。具體的是，通過從DANCE特異的蛋白酶表達細胞制備cDNA，且將該cDNA插入適當的表達載體的啟動子的下游，制備重組表達載體，制備cDNA文庫。通過將該重組表達載體引入該載體適合的宿主細胞中，制備表達來自DANCE特異的蛋白酶表達細胞的基因產物的轉化體，從該轉化體中選擇產生DANCE特異的蛋白酶的轉化體。然后，通過確定引入產生DANCE特異的蛋白酶的轉化體中的cDNA編碼的基因序列，可得到DANCE特異的蛋白酶。作為本篩選方法VI中使用的宿主細胞，可使用任何不具有DANCE的切割活性，或DANCE的切割活性極低的細胞。某細胞是否具有DANCE的切割活性，可藉向該細胞中引入DANCE表達載體，確認有無對表達的DANCE的切割來評價。作為cDNA的制備中使用的細胞，可使用DANCE特異的蛋白酶表達細胞，例如，來自皮膚成纖維細胞、293T細胞、動脈平滑肌細胞等細胞，以及肺組織、子宮組織等組織的細胞。cDNA文庫的制備，可采用已公知的方法進行。首先，從DANCE特異的蛋白酶表達細胞，采用酸性硫氰酸胍·苯酚·氯仿(AGPC)法等方法制備總RNA。然后，采用oligo(dT)固定化纖維素柱法等方法，或者使用市售的試劑盒(例如，QuickPrepmRNAPurificationKit(Pharmacia制備))，制備mRNA。然后，從制備的mRNA制備cDNA文庫(例如參照MolecularCloning(第2版)、CurrentprotocolsinMolecularBiology(第3版))。作為cDNA文庫的制備中使用的表達載體，只要在使用的宿主細胞中可表達插入片段即可，并無特別的限定。可直接使用制備的cDNA文庫，但為了濃縮目標基因，也可使用采用不表達DANCE特異的蛋白酶的細胞的mRNA，實施消減法(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，85，5783(1988)。)而制備的cDNA文庫。又，選擇不表達DANCE的細胞作為宿主細胞時，除如上述制備cDNA以外，還將DANCE表達載體引入宿主細胞。作為將重組載體引入宿主細胞的方法，只要是向動物細胞內引入DNA的方法即可任意使用。例如可列舉出電穿孔法、磷酸鈣法、脂質轉染法。通過在培養基中培養如上述得到的轉化體，可表達被引入的cDNA編碼的基因產物。培養基培養轉化體的方法，可根據培養宿主時使用的通常的方法進行。例如，作為培養基，可使用一般使用的RPMIl640培養基、αMEM培養基、DMEM培養基、199培養基，或者在這些培養基中添加胎牛血清等的培養基等。培養通常在pH6～8，30～40℃，5％CO2存在下等條件下進行1～7天。又，培養中根據需要，還可在培養基中添加卡那霉素、青霉素等抗生素。本篩選方法VI中，培養上述轉化體之后，可由采用蛋白質印跡法等方法確認培養上清液中DANCE切割的有無或程度，從而選擇產生DANCE特異的蛋白酶的轉化體。根據需要，通過重復操作上述步驟，可得到DANCE特異的表達載體得以濃縮的轉化體。選擇的轉化體中引入的cDNA的分離，以及分離的cDNA的基因序列的確定，可采用已公知的方法進行。再者，本發明還提供編碼這樣得到的DANCE特異的蛋白酶的多核苷酸。篩選方法VI，還可以表達克隆的方法以外的方法進行。具體的是，通過制備DANCE特異的蛋白酶表達細胞的提取液或培養上清液，并以DANCE的切割活性作為指標分餾該提取液或培養上清液，可純化DANCE特異的蛋白酶。作為純化方法，例如可列舉出溶劑萃取法、利用硫酸銨等的鹽析法、脫鹽法、利用有機溶劑的沉淀法、陰離子交換層析法、陽離子交換層析法、疏水性層析法、使用分子篩的凝膠過濾法、親和層析法、層析聚焦法、等電點電泳等電泳法，或者這些方法的組合。又，現在人類等的基因組分析已經完成，也可通過基于記錄在數據庫中的序列，表達部位等信息，同源性檢索等手段克隆蛋白酶，并逐一評價各蛋白酶的DANCE切割活性，從而篩選DANCE特異的蛋白酶。再者，得到DANCE特異的蛋白酶，被作為絲氨酸蛋白酶抑制劑抑酶肽抑制的結論。因此，本篩選方法，從偏重效率的觀點考慮，優選篩選絲氨酸蛋白酶。本篩選方法VI，使DANCE特異的蛋白酶的篩選變得可能，故是有用的。又，由該篩選方法得到的DANCE特異的蛋白酶，作為彈性纖維形成調節劑(例如，用以破壞彈性纖維)，在DANCE的切割中，以及用以實施本發明的篩選方法，是有用的。8.試劑盒又，本發明，提供含有以下(a)以及(b)的試劑盒。(a)DANCE，或具有編碼DANCE的堿基序列的多核苷酸；(b)以下(i)～(vi)的至少1種成分；(i)(a)中DANCE的可識別的形態的DANCE；(ii)具有編碼(a)中DANCE的可識別的形態的DANCE的堿基序列的多核苷酸；(iii)賴氨酰氧化酶；(iv)具有編碼賴氨酰氧化酶的堿基序列的多核苷酸；(v)LTBP2；(vi)具有編碼LTBP2的堿基序列的多核苷酸。又，本發明的試劑盒，可含有標明可以使用本試劑盒以調節彈性纖維的形成，或進行篩選的說明書。本發明的試劑盒，除上述成分外，還可含有整聯蛋白、具有編碼整聯蛋白的堿基序列的多核苷酸、賴氨酰氧化酶樣-1、具有編碼賴氨酰氧化酶樣-1的堿基序列的多核苷酸。這些可采用已公知的方法制備。本發明的試劑盒，除上述成分外，還可進一步含有抗DANCE、賴氨酰氧化酶、LTBP2、整聯蛋白、賴氨酰氧化酶樣-1的抗體。這些抗體，可基于上述的抗體制備法制備。本發明的試劑盒，可以提供可進行上述篩選方法I～VI，以及關于DANCE的其他的研究等的簡單的方法，并且作為彈性纖維調節劑(例如用以形成或維持彈性纖維)有用。9.彈性纖維形成調節劑本發明的調節劑，含有本發明的多肽、抗體、DANCE突變體、復合體或構成該復合體的多種成分、DANCE特異的蛋白酶，或其編碼多核苷酸等。本發明的調節劑，可通過添加任意的載體，例如醫藥上容許的載體，以預防、治療或改善需要對彈性纖維形成進行調節的狀態。例如，本發明的調節劑，含有形成或再生彈性纖維的成分時，該調節劑，用以預防、治療或改善需要對彈性纖維形成進行調節的狀態，如肺氣腫、血管損傷、皮膚松弛、創傷、彈性纖維劣化(如，由衰老或紫外線所引起的)、肌膚龜裂、動脈硬化、大動脈瘤，或者用于美容的目的。另一方面，本發明的調節劑，含有抑制彈性纖維的形成的成分時，該調節劑，用以預防、治療或改善需要對彈性纖維形成進行抑制的狀態，例如心肌梗塞。作為醫藥上容許的載體，例如可列舉出蔗糖、淀粉、甘露醇、山梨醇、乳糖、葡萄糖、纖維素、滑石粉、磷酸鈣、碳酸鈣等賦形劑；纖維素、甲基纖維素、羥丙基纖維素、聚丙基吡咯烷酮、明膠、阿拉伯膠、聚乙二醇、蔗糖、淀粉等粘合劑；羧甲基纖維素、羥丙基淀粉、鈉-乙二醇-淀粉、碳酸氫鈉、磷酸鈣、檸檬酸鈣等崩解劑；硬脂酸鎂、二氧化硅、滑石粉、十二烷基硫酸鈉等潤滑劑；檸檬酸、薄荷醇、甘氨酰賴氨酸·銨鹽、甘氨酸、橘子粉末等芳香劑；苯甲酸鈉、亞硫酸氫鈉、羥苯甲脂、羥苯丙酯等防腐劑；檸檬酸、檸檬酸鈉、醋酸等穩定劑；甲基纖維素、聚乙烯吡咯烷酮、硬脂酸鋁等混懸劑；表面活性劑等分散劑；水、生理鹽水、橙汁等稀釋劑；可可油脂、聚乙二醇、精煉煤油等基質蠟等，但并不限定于此。口服給藥中優選的制劑是，在水、生理鹽水、橙汁等的稀釋劑中溶解有效量的配位體的溶液劑；作為固體或顆粒含有有效量的配位體的膠囊劑、散劑或片劑；在適當的分散溶劑中混懸有效量的配位體的混懸劑；溶解有效量配位體的溶液在適當的分散溶劑中分散乳化的乳劑等。作為非口服給藥(例如，皮下注射、肌肉注射、局部注射、腹腔內給藥等)中優選的制劑是，含水或非含水的等滲的無菌注射液制劑，其中還可含有抗氧劑、緩沖液、抑菌劑、等滲劑等。還可列舉含水或非含水的無菌混懸液制劑，其中還可含有混懸劑、增溶劑、增粘劑、穩定劑、防腐劑等。該制劑可封入如安瓿或小瓶等單位給藥量或多次給藥量的容器中。又，可將有效成分以及醫藥上容許的載體冷凍干燥，以在臨使用前于適當的無菌賦形劑中溶解或混懸的狀態保存。本發明的制劑的給藥量，根據有效成分的種類·活性、病情的嚴重度、作為給藥對象的動物種類、給藥對象的藥物可接受性、體重、年齡等而不同，通常作為成年人1天的有效成分量為約0.001～約100mg/kg。本說明書中列舉的全部的出版物中標明的內容，全部引入本說明書中作為參考。由以下的實施例更具體地說明本發明，但實施例僅為本發明簡單的示例，并不限定本發明的范圍。實施例1.材料以及方法1.1.表達質粒的構建本發明中使用的表達質粒，如下述進行制備。再者，這些構建在確認全部堿基序列之后，用于表達實驗。pEF6/ssFLAG在pEF6/V5-A質粒(Invitrogen)的KpnI-PmeI位點，插入合成核苷酸ggtaccgctagcgaattcaccatgtctgcacttctgatcctagctcttgttggagctgcagttgctgactacaaagacgatgacgacaagactagtcatcatcaccatcaccattctagagaaggatccgatatccgcggccgcatcgattgactagctgaggccgcaaaccc(序列號17)及其互補鏈合成核苷酸。因此，KpnI-NheI-EcoRI-前原胰蛋白酶信號肽(MSALLILALVGAAVA(序列號18))-FLAG標記物(DYKDDDDK(序列號19))-SpeI-6xHis標記物(HHHHHH(序列號20))-XbaI-BamHI-EcoRV-NotI-ClaI位于延伸因子(ElonggationFactor)啟動子的下游，牛生長激素聚腺苷酸化序列的上游。pEF6/ssMyc在pEF6/ssFLAG質粒的EcoRI-SpeI位點，插入合成核苷酸gaattcaccatgtctgcacttctgatcctagctcttgttggagctgcagttgctgactacgaagaggacgaacaaaaactcatctcagaagaggatctgactagt(序列號21)及其互補鏈合成核苷酸。因此，KpnI-NheI-EcoRI-前原胰蛋白酶信號肽(MSALLILALVGAAVA(序列號18))-Myc標記物(EQKLISEEDL(序列號22))-SpeI-6xHis標記物(HHHHHH(序列號20))-XbaI-BamHI-EcoRV-NotI-ClaI位于延伸因子啟動子的下游、牛生長激素聚腺苷酸化序列的上游。pEF6/ssFLAG在pEF6/V5-A質粒(Invitrogen)的KpnI-PmeI位點，插入合成核苷酸tggtaccgagctcggatccactagtccagtgtggtggaattctgcagatatccagcacagtggcggccgtctagagactacaaagacgatgacgacaagagagggtctcatcatcaccatcaccattgagcggccgcaaaccc(序列號23)及其互補鏈合成核苷酸。因此，KpnI-BamHI-SpeI-EcoRI-EcoRV-XbaI-FLAG標記物(DYKDDDDK(序列號19))-6xHis標記物(HHHHHH(序列號20))-終止密碼子-NotI位于延伸因子啟動子的下游、牛生長激素聚腺苷酸化序列的上游。pEF6/ssFLAG-hDANCE將由序列號2表示的氨基酸序列組成的人DANCE的第25位氨基酸至終止密碼子使用引物tctagagcacagtgcacgaatggctttg(序列號24)以及gcggccggtcagaatgggtactgcgacacatatatccg(序列號25)采用PCR法進行擴增，且采用產品說明書中標明的方法克隆至pCR4-BluntTopo(Invitrogen)，確認序列之后用XbaI-NotI切割，并插入pEF6/ssFLAG的SpeI-NotI位點。pEF6/ssMyc-hLTBP2將人LTBP2的第36位氨基酸至終止密碼子使用引物tctagacaaagggaccccgtagggagatacgag(序列號26)以及gcggccgcctggtactccttggcagtgcagtggg(序列號27)采用PCR法進行擴增，與上述同樣插入pEF6/ssMyc的SpeI-NotI位點。pEF6-hDANCE-FLAG將包含序列號2表示的氨基酸序列的人DANCE的第1位氨基酸至最后的第448位氨基酸使用引物gaattcttcttctcgccttcgcatctcctcc(序列號28)以及tctagagaatgggtactgcgacacatatatccg(序列號29)采用PCR法進行擴增，與上述同樣克隆、測序后，用EcoRI-XbaI切割并插入pEF6/FLAG的EcoRI-XbaI位點(圖1)。pEF6-hDANCE(R77A)-FLAG使用QuickChangeinvitromutagenesisKit(Stratagene)將人DANCE的第77位氨基酸的精氨酸取代為丙氨酸。其他過程與pEF6-hDANCE-FLAG相同。pEF6-hDANCEΔND-FLAG將包含序列號2表示的氨基酸序列的人DANCE的第1位氨基酸至第26位氨基酸，第78位氨基酸至第448位氨基酸分別用PCR法擴增，該擴增片段在NheI位點連接后，插入pEF6/FLAG的EcoRI-XbaI位點(圖1)。pEF6-hDANCEΔN-FLAG將包含序列號2表示的氨基酸序列的人DANCE的第1位氨基酸至第26位氨基酸，第113位氨基酸至第448位氨基酸分別用PCR法擴增，該擴增片段在NheI位點連接后，插入pEF6/FLAG的EcoRL-XbaI位點(圖1)。pEF6-hDANCEΔM-FLAG將包含序列號2表示的氨基酸序列的人DANCE的第1位氨基酸至第112位氨基酸，第315位氨基酸至第448位氨基酸分別用PCR法擴增，該擴增片段在NheI位點連接后，插入pEF6/FLAG的EcoRI-XbaI位點(圖1)。pEF6-hDANCEΔC-FLAG將包含序列號2表示的氨基酸序列的人DANCE的第1位氨基酸至第315位氨基酸用PCR法擴增，插入pEF6/FLAG的EcoRI-XbaI位點(圖1)。將人賴氨酰氧化酶(GenBank檢索號AF039291.1)cDNA編碼的多肽(第417個氨基酸)的第22位氨基酸至第417位氨基酸用PCR法擴增，插入pEF6/ssMyc的XbaI/NotI位點。1.2.細胞、轉染表達試驗中使用293T細胞。轉染使用LipofectAMINEPlus試劑，以產品說明書中標明的方法進行。轉染后第24小時，將培養基換為無血清培養基，進一步培養48小時，將上清液或細胞溶解產物用于蛋白質印跡法，以及體外結合分析法。新生小鼠的皮膚成纖維細胞，用“CurrentProtocolsinCellBiology”中標明的方法提取、培養。牛大動脈平滑肌，購自Cambrex。1.3.重組DANCE使用293T細胞和pEF6-hDANCE-FLAG制備人DANCE穩定表達細胞系，使用Ni-NTA瓊脂糖(Qiagen)從其培養上清液純化重組DANCE后，使用脫鹽柱(Amersham)進行脫鹽。1.4.抗體抗小鼠DANCE抗體BSYN1923，由將對應于小鼠DANCE76-98氨基酸的合成肽對家兔免疫而制成，且使用固定抗原肽的柱子進行親和純化。購自Chemicon和ElastinProductsCompany(EPC)的抗彈性蛋白單克隆抗體，購自EPC的肌原纖蛋白1多克隆抗體及單克隆抗體、肌原纖蛋白2多克隆抗體、LTBP2單克隆抗體。購自Sigma的抗FLAGM2抗體和抗FLAGM2瓊脂糖，購自SantaCruz的抗Myc(9E10)抗體。從ElastinProductsCompany，INC購入多克隆抗彈性蛋白抗體(PR533)。從MolecularProbes購入抗家兔AlexaFluor488抗體、抗小鼠AlexaFluor546抗體。1.5.使用35S-Met，Cys的代謝標記(metabolabelling)、免疫沉淀、體外結合分析、蛋白質印跡以“MolecularCloning，3rdEd”中標明的方法進行。1.6.成纖維細胞培養人成纖維細胞由京都大學附屬醫院整形外科提供。在24孔平板的底部放置蓋玻片(CoverGlass)，在其上每1個孔接種7.5×104個人成纖維細胞，添加10％FBS在DMEM培養基中37℃，5％CO2下培養，第3天用PBS清洗后，換為不添加FBS的DMEM/F12培養基，添加純化的DANCE蛋白質、切割型DANCE蛋白質4μg/ml，或者FBS。繼續在37℃，5％CO2下培養，第14天進行固定、免疫染色。1.7.免疫染色培養第14天，用1ml的PBS清洗3次后，用100％甲醇，-20℃下固定30分鐘。用PBS清洗后，用含2％BSA的PBS，在室溫下阻斷30分鐘之后，與多克隆抗彈性蛋白抗體(稀釋率1/100)以及單克隆抗FLAG抗體(稀釋率1/100)在室溫下孵化1小時以上。用PBS清洗，進一步與抗家兔AlexaFluor488抗體(稀釋率1/100)、抗小鼠AlexaFluor546抗體(稀釋率1/100)在室溫下孵化1小時。用PBS清洗后，用4％多聚甲醛在室溫下固定10分鐘，再用PBS清洗后，用含有DAPI的Vectashield將樣品封固在載玻片上。用共焦顯微鏡進行觀察。實施例1DANCE的一部分在體外、在體內、的N末端切割1.1.人以及小鼠DANCE在293T細胞中的強制表達將緊鄰信號肽切割位點下游附有FLAG標記物的人以及小鼠DANCEcDNA轉染至293T細胞，換為無血清培養基之后繼續培養48小時，將15μl培養上清液用SDS-PAGE展開，進行蛋白質印跡。抗體使用將對應于小鼠DANCE第76-98位氨基酸的肽對家兔免疫而得到的BSYN，以及抗FLAGM2抗體。其結果，如圖2所示，BSYN不能識別人DANCE，且作為2條帶檢出小鼠DANCE。與此相反，抗FLAGM2抗體，作為1條帶檢出人·小鼠DANCE。1.2.來自小鼠成纖維細胞中的DANCE的表達培養來自新生兒期的DANCE敲除小鼠(參照Nature415171-175(2002))及其同胎的對照小鼠的皮膚的成纖維細胞，用35S-Met，Cys標記24小時之后，將培養上清液用BSYN抗體免疫沉淀。免疫沉淀物用SDS-PAGE展開，采用放射自顯影術進行檢測。其結果，來自DANCE+/+小鼠的皮膚成纖維細胞中檢出2條帶，來自DANCE-/-小鼠的皮膚成纖維細胞中未檢出帶(圖3)。1.3.小鼠肺組織的蛋白質印跡將12周齡的DANCE敲除小鼠及其同胎的對照小鼠的肺組織提取物用SDS-PAGE展開，用BSYN抗體進行蛋白質印跡。其結果，DANCE+/+小鼠的肺組織中DANCE作為2條帶檢出，DANCE-/-小鼠的肺組織中未檢出帶(圖4)。實施例2切割型DANCE的N末端，與DANCE的第78位以后的氨基酸一致將羧基末端附有FLAG標記物及6xHis標記物的人DANCEcDNA轉染至293T細胞，建立穩定表達系。由800ml無血清培養上清液使用Ni-NTA瓊脂糖(Qiagen)純化重組DANCE，用SDS-PAGE展開，用Coomasie-Blue染色。主要的2條帶中，切出對應于切割型DANCE的帶，采用Edman降解分析N末端氨基酸序列(圖5)。其結果，切割型DANCE的N末端氨基酸序列，與DANCE的第78位以后的氨基酸一致。因此，認為該低分子量蛋白質，通過在DANCE的第77位氨基酸與第78位氨基酸之間切割而生成。實施例3DANCE的切割被絲氨酸蛋白酶抑制劑抑制將羧基末端附有FLAG標記物及6xHis標記物的人DANCEcDNA轉染293T細胞，在含半胱氨酸蛋白酶抑制劑(E64)或絲氨酸蛋白酶抑制劑(抑酶肽)的無血清培養基中培養48小時，使用Ni-NTA瓊脂糖從該培養上清液沉淀重組蛋白質，用SDS-PAGE展開，用抗FLAGM2抗體進行蛋白質印跡。其結果，DANCE的切割未被E64抑制，但被抑酶肽抑制(圖6)。因此，表明DANCE由絲氨酸氧化酶切割。實施例4DANCE的Arg77置換為Ala則難以切割將DANCE的第77位精氨酸置換為丙氨酸的突變型DANCE(C末端附有FLAG、6xHis標記物)(圖7)的表達載體，以及正常型DANCE(C末端附有FLAG、6xHis標記物)的表達載體轉染293T細胞，無血清培養基中培養48小時，使用Ni-NTA瓊脂糖從該培養上清液沉淀重組蛋白質，用SDS-PAGE展開，用抗FLAGM2抗體進行蛋白質印跡。其結果，明確該突變型DANCE，對蛋白酶引起的切割顯示出抗性(圖8)。實施例5DANCE形成同型復合體，且也與LTBP2結合將在9cm平板上接種的牛大動脈平滑肌細胞，用35S-Met，Cys標記24小時之后，混合培養上清液和重組人DANCE(C末端附有FLAG、6xHis標記物)50μg，將用抗FLAG瓊脂糖(Sigma)沉淀后的物質用SDS-PAGE展開，進行放射自顯影。將相同的培養上清液用抗彈性纖維構成蛋白質(彈性蛋白、肌原纖蛋白1、肌原纖蛋白2、LTBP2)的市售抗體免疫沉淀，用相同的SDS-PAGE凝膠展開，進行放射自顯影。其結果，明確DANCE形成同型復合體，以及DANCE與LTBP2結合(圖9)。實施例6人DANCE與DANCE或LTBP2的結合區域的分析由實施例5的結果，分析DANCE之間的結合區域，DANCE對LTBP2的結合區域。將附有FLAG標記物的人DANCE構建體(圖8)、附有Myc標記物的人DANCE構建體以及人LTBP2構建體分別轉染293T細胞。無血清培養基中培養48小時后，混合各自的培養上清液和細胞提取液，作為蛋白質溶液。將來自附有FLAG標記物的DANCE構建體的蛋白質溶液，與來自附有Myc標記物的DANCE或LTBP2的蛋白質溶液在冰上混合1小時，用抗FLAG抗體沉淀，沉淀后的物質用SDS-PAGE展開，用抗Myc抗體或抗FLAG抗體檢測。其結果，明確DANCE之間的結合中，N末端結構域是必需的；DANCE與LTBP2的結合中DANCE的中央結構域是必需的(圖10)。又，明確當DANCE的N末端或C末端結構域缺失時，DANCE與LTBP2的結合更強。實施例7DANCE可與賴氨酰氧化酶結合本發明人等發現賴氨酰氧化酶的基因缺失小鼠的表型(J.Biol.Chem.278(16)14387-93(2003)；Circulation106(19)2503-9(2002))，與本發明人等以前報道的DANCE基因缺失小鼠的表型(Nature415171-175(2002))非常類似。因此，本發明人等認為DANCE與賴氨酰氧化酶的復合體的形成可能對其機能的發揮很重要，并評價DANCE是否與賴氨酰氧化酶結合。再者，試驗除將用抗FLAG抗體沉淀的物質用SDS-PAGE展開，用抗Myc抗體檢測以外，其他與實施例6同樣進行。其結果，表明DANCE與賴氨酰氧化酶結合(圖11)。考察1.DANCE與LTBP2的結合本發明人等，發現DANCE與LTBP2特異的結合。該結合通過在DANCE的中央的鈣結合性EGF樣模體連續的結構域發生。至今，本發明人等報道DANCE的氨基酸末端結構域與細胞表面整聯蛋白結合，Liu等報道DANCE的羧基末端側的一半與LOXL1結合。但是已知彈性蛋白未在細胞表面上密集沉淀，而是沿著微原纖維沉淀，從而形成成熟的彈性纖維(MatrixBiol.19455-6(2000))。因此，DANCE與LOXL1的結合若促進彈性蛋白在微原纖維的沉淀·交聯，則DANCE應該與微原纖維結合。微原纖維是較長的細胞外纖維，認為是由肌原纖蛋白1、肌原纖蛋白2、LTBP2等細長的蛋白質分子構成。肌原纖蛋白的1，2的任一種的敲除小鼠都不會產生彈性纖維的形成異常，則否定了肌原纖蛋白與DANCE的結合。LTBP2屬于LTBP家族，但是不與LatentTGFβ結合，是彈性纖維中存在的蛋白質，因LTBP2敲除小鼠早期胎生致死，所以其在生物體內的作用仍不明確(Mol.CellBiol.204879-87(2000))。此次本發明人等的發現，表明通過LTBP2將DANCE固定在微原纖維，使彈性蛋白交聯酶存在于微原蛋白上，從而幫助彈性蛋白沿著微原纖維沉淀·交聯。2.DANCE之間的結合至今仍不明確DANCE是否以單體的形式作用，是否形成二聚體或多聚體，此次，作為在平滑肌培養上清液中存在的主要的DANCE結合蛋白質識別出DANCE。這表明DANCE形成同型復合體(二聚體或多聚體)。DANCE之間的結合通過氨基酸末端的結構域進行。以前，本發明人等標明DANCE的氨基酸末端結構域在細胞表面整聯蛋白上結合(J.Biol.Chem.274(32)22476-22483(1999))，此次的數據暗示作為氨基酸末端結構域的新的機能，其促進DANCE之間的結合。3.DANCE氨基酸末端結構域的切割本發明人等，發現在體內，體外DANCE的一部分在氨基酸末端結構域切割。該切割由未鑒定的絲氨酸蛋白酶引起，若切割位點的精氨酸置換為丙氨酸則切割難以進行。從DANCE氨基酸末端結構域的機能推測，切割型DANCE，(1)未與細胞表面整聯蛋白結合，(2)DANCE之間不結合，且(3)與全長DANCE相比，切割型DANCE與LTBP2的結合更強。(1)～(3)的新發現表明生物體內由蛋白酶對DANCE的切斷控制DANCE的機能變化，從而成為彈性纖維形成的控制機制而起作用。基于該觀點，藥劑引起的DANCE切割蛋白酶的抑制或促進，可用于彈性纖維劣化的預防·再生促進。4.DANCE與賴氨酰氧化酶的結合LOX1基因缺失小鼠顯示出彈性纖維形成異常。認為LOX1與DANCE直接結合，通過DANCE而在彈性纖維形成部位固定，進行彈性蛋白的交聯。但是，LOXL1基因缺失小鼠的表型比DANCE基因缺失小鼠的表型弱，所以不能說明與LOXL1的結合是DANCE的全部作用。賴氨酰氧化酶基因缺失小鼠也表現出彈性纖維形成異常，此次本發明人發現的DANCE與賴氨酰氧化酶的結合，表明DANCE通過固定賴氨酰氧化酶而有效地進行彈性蛋白的交聯。實施例8調節DANCE的切割的物質的篩選將羧基末端附有FLAG標記物及6xHis標記物的人DANCEcDNA轉染293T細胞，在被檢物質的存在與不存在的情況下的無血清培養基中培養48小時，將培養上清液使用Ni-NTA瓊脂糖沉淀的人DANCE，用SDS-PAGE展開，用抗FLAGM2抗體進行蛋白質印跡。被檢物質的存在或不存在的情況下，定量分析各自的2條帶，從而評價被檢物質是否可調節DANCE的切割。實施例9各種年齡的人的皮膚上全長型以及切割型DANCE的表達為了考察整形外科手術中切除的皮膚組織中DANCE的表達，使用抗人DANCE抗體進行蛋白質印跡(圖12)。從任何一個檢體均可檢出全長型以及切割型DANCE蛋白質，但是發現根據年齡以及皮膚的摘取部位不同表達水平有較大的差異。首先臉部皮膚中，0歲兒童全長型、切割型DANCE表達水平均較高，特別是全長型DANCE表達水平很高，而成年人的全長型、切割型的表達水平較低，特別是全長型有降低的傾向。發現在不被光照射的其他部位的皮膚中，即使是成年人，全長型、切割型均有保持著適當的DANCE表達水平的傾向。參考例1切割型DANCE不具有通過整聯蛋白的細胞黏著促進活性全長型DANCE通過細胞表面整聯蛋白促進血管內皮細胞的黏著和伸展。至今本發明人報道全長型DANCE作為整聯蛋白αvβ3、αvβ5、α9β1的配體。據認為作為配體的結構域，在DANCE氨基酸末端結構域的RGD模體周圍，所以分別將通過1個氨基酸發生置換的來自RGD的RGEDANCE突變體(RGEDANCE)，以及氨基酸末端切割型DANCE(ΔNDDANCE)的重組蛋白進行純化，與全長型DANCE一起進行血管內皮細胞的細胞黏著試驗(圖13)。全長型DANCE，依靠用于包被的蛋白質濃度促進細胞黏著，而RGEDANCE幾乎沒有細胞黏附活性，ΔNDDANCE完全沒有細胞黏附活性。參考例2DANCE的氨基酸末端結構域在彈性纖維形成中是必需的繼而，驗證了蛋白酶引起的DANCE的氨基酸末端結構域切割對彈性纖維形成是否有影響。接種人皮膚成纖維細胞使其融合，換為無血清培養基或含10％胎牛血清的培養基培養2周，用由抗彈性蛋白抗體的免疫染色分析彈性纖維的形成。其結果，發現含10％胎牛血清的培養基中形成彈性纖維。無血清培養基中細胞雖生存，但幾乎沒有形成彈性纖維。但是若于無血清培養基中加入重組DANCE至4μg/ml，則形成多于或等于含血清培養基中的彈性纖維。用抗FLAG抗體發現此時加入的重組DANCE的存在，其與形成的彈性纖維共存。另一方面，加入ΔND-DANCE的培養基中彈性纖維形成非常少，認為ΔND-DANCE幾乎沒有彈性纖維形成活性，或非常弱的活性。因此，由于蛋白酶對DANCE氨基酸末端結構域的切割，使DANCE失活，所以DANCE切割蛋白酶的抑制劑可用作通過增加全長型DANCE來促使彈性纖維的形成或維持的藥劑。工業實用性本發明的篩選方法，可用于通過調節彈性纖維形成的新型作用機制來開發藥物，或鑒定DANCE特異的蛋白酶。又，本發明的測定方法可用于彈性纖維形成的狀態的診斷。進一步，本發明的多肽、抗體、復合體以及試劑盒可用于實施本發明的方法，也可用于預防、治療或改善需要對彈性纖維形成進行調節的狀態，或作為研究·診斷用試劑等。本申請，以2004年3月29日在日本申請的專利2004-096685為基礎，其內容并入本說明書中。序列表<110>KyotoUniversity<120>切割型DANCE、DANCE復合體及其使用方法<130><150>JP2004-096685<151>2004-3-29<160>29<170>PatentInversion3.2<210>1<211>1347<212>DNA<213>智人(Homosapiens)<220><221>CDS<222>(1)..(1347)<400>1atgccaggaataaaaaggatactcactgttaccattctggctctctgt48MetProGlyIleLysArgIleLeuThrValThrIleLeuAlaLeuCys151015cttccaagccctgggaatgcacaggcacagtgcacgaatggctttgac96LeuProSerProGlyAsnAlaGlnAlaGlnCysThrAshGlyPheAsp202530ctggatcgccagtcaggacagtgtttagatattgatgaatgccgaacc144LeuAspArgGlnSerGlyGlnCysLeuAspIleAspGluCysArgThr354045atccccgaggcctgccgaggagacatgatgtgtgttaaccaaaatggc192IleProGluAlaCysArgGlyAspMetMetCysValAsnGlnAsnGly505560gggtatttatgcattccccggacaaaccctgtgtatcgagggccctac240GlyTyrLeuCysIleProArgThrAsnProValTyrArgGlyProTyr65707580tcgaacccctactcgaccccctactcaggtccgtacccagcagctgcc288SerAsnProTyrSerThrProTyrSerGlyProTyrProAlaAlaAla859095ccaccactctcagctccaaactatcccacgatctccaggcctcttata336ProProLeuSerAlaProAsnTyrProThrIleSerArgProLeuIle100105110tgccgctttggataccagatggatgaaagcaaccaatgtgtggatgtg384CysArgPheGlyTyrGlnMetAspGluSerAsnGlnCysValAspVal115120125gacgagtgtgcaacagattcccaccagtgcaaccccacccagatctgc432AspGluCysAlaThrAspSerHisGlnCysAsnProThrGlnIleCys130135140atcaatactgaaggcgggtacacctgctcctgcaccgacggatattgg480IleAsnThrGluGlyGlyTyrThrCysSerCysThrAspGlyTyrTrp145150155160cttctggaaggccagtgcttagacattgatgaatgtcgctatggttac528LeuLeuGluGlyGlnCysLeuAspIleAspGluCysArgTyrGlyTyr165170175tgccagcagctctgtgcgaatgttcctggatcctattcttgtacatgc576CysGlnGlnLeuCysAlaAsnValProGlySerTyrSerCysThrCys180185190aaccctggttttaccctcaatgaggatggaaggtcttgccaagatgtg624AsnProGlyPheThrLeuAsnGluAspGlyArgSerCysGlnAspVal195200205aacgagtgtgccaccgagaacccctgcgtgcaaacctgcgtcaacacc672AsnGluCysAlaThrGluAsnProCysValGlnThrCysValAsnThr210215220tacggctctttcatctgccgctgtgacccaggatatgaacttgaggaa720TyrGlySerPheIleCysArgCysAspProGlyTyrGluLeuGluGlu225230235240gatggcgttcattgcagtgatatggacgagtgcagcttctctgagttc768AspGlyValHisCysSerAspMetAspGluCysSerPheSerGluPhe245250255ctctgccaacatgagtgtgtgaaccagcccggcacatacttctgctcc816LeuCysGlnHisGluCysValAsnGlnProGlyThrTyrPheCysSer260265270tgccctccaggctacatcctgctggatgacaaccgaagctgccaagac864CysProProGlyTyrIleLeuLeuAspAspAsnArgSerCysGlnAsp275280285atcaacgaatgtgagcacaggaaccacacgtgcaacctgcagcagacg912IleAsnGluCysGluHisArgAsnHisThrCysAsnLeuGlnGlnThr290295300tgctacaatttacaagggggcttcaaatgcatcgaccccatccgctgt960CysTyrAsnLeuGlnGlyGlyPheLysCysIleAspProIleArgCys305310315320gaggagccttatctgaggatcagtgataaccgctgtatgtgtcctgct1008GluGluProTyrLeuArgIleSerAspAsnArgCysMetCysProAla325330335gagaaccctggctgcagagaccagccctttaccatcttgtaccgggac1056GluAsnProGlyCysArgAspGlnProPheThrIleLeuTyrArgAsp340345350atggacgtggtgtcaggacgctccgttcccgctgacatcttccaaatg1104MetAspValValSerGlyArgSerValProAlaAspIlePheGlnMet355360365caagccacgacccgctaccctggggcctattacattttccagatcaaa1152GlnAlaThrThrArgTyrProGlyAlaTyrTyrIlePheGlnIleLys370375380tctgggaatgagggcagagaattttacatgcggcaaacgggccccatc1200SerGlyAsnGluGlyArgGluPheTyrMetArgGlnThrGlyProIle385390395400agtgccaccctggtgatgacacgccccatcaaagggccccgggaaatc1248SerAlaThrLeuValMetThrArgProIleLysGlyProArgGluIle405410415cagctggacttggaaatgatcactgtcaacactgtcatcaacttcaga1296GlnLeuAspLeuGluMetIleThrValAsnThrValIleAsnPheArg420425430ggcagctccgtgatccgactgcggatatatgtgtcgcagtacccattc1344GlySerSerValIleArgLeuArgIleTyrValSerGlnTyrProPhe435440445tga1347<210>2<211>448<212>PRT<213>智人<400>2MetProGlyIleLysArgIleLeuThrValThrIleLeuAlaLeuCys151015LeuProSerProGlyAsnAlaGlnAlaGlnCysThrAsnGlyPheAsp202530LeuAspArgGlnSerGlyGlnCysLeuAspIleAspGluCysArgThr354045IleProGluAlaCysArgGlyAspMetMetCysValAsnGlnAsnGly505560GlyTyrLeuCysIleProArgThrAsnProValTyrArgGlyProTyr65707580SerAsnProTyrSerThrProTyrSerGlyProTyrProAlaAlaAla859095ProProLeuSerAlaProAsnTyrProThrIleSerArgProLeuIle100105110CysArgPheGlyTyrGlnMetAspGluSerAsnGlnCysValAspVal115120125AspGluCysAlaThrAspSerHisGlnCysAsnProThrGlnIleCys130135140IleAsnThrGluGlyGlyTyrThrCysSerCysThrAspGlyTyrTrp145150155160LeuLeuGluGlyGlnCysLeuAspIleAspGluCysArgTyrGlyTyr165170175CysGlnGlnLeuCysAlaAsnValProGlySerTyrSerCysThrCys180185190AsnProGlyPheThrLeuAsnGluAspGlyArgSerCysGlnAspVal195200205AsnGluCysAlaThrGluAsnProCysValGlnThrCysValAsnThr210215220TyrGlySerPheIleCysArgCysAspProGlyTyrGluLeuGluGlu225230235240AspGlyValHisCysSerAspMetAspGluCysSerPheSerGluPhe245250255LeuCysGlnHisGluCysValAsnGlnProGlyThrTyrPheCysSer260265270CysProProGlyTyrIleLeuLeuAspAspAsnArgSerCysGlnAsp275280285IleAsnGluCysGluHisArgAsnHisThrCysAsnLeuGlnGlnT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aaagggaccccgtagggagatacgag33<210>27<211>34<212>DNA<213>人工的<220><223>擴增人LTBP2的PCR引物<400>27gcggccgcctggtactccttggcagtgcagtggg34<210>28<211>31<212>DNA<213>人工的<220><223>擴增人DANCE的PCR引物<400>28gaattcttcttctcgccttcgcatctcctcc31<210>29<211>33<212>DNA<213>人工的<220><223>擴增人DANCE的PCR引物<400>29tctagagaatgggtactgcgacacatatatccg3權利要求1.一種多肽，其包含與序列號6表示的氨基酸序列基本上同一的氨基酸序列，且由DANCE特異的蛋白酶切割DANCE而得到。2.一種多肽，其包含序列號6表示的氨基酸序列。3.一種多核苷酸，其具有編碼權利要求1中所述多肽的堿基序列。4.一種多核苷酸，其包含序列號5表示的堿基序列。5.一種多肽，其包含與序列號8表示的氨基酸序列基本上同一的氨基酸序列，且由DANCE特異的蛋白酶切割DANCE而得到。6.一種多肽，其包含序列號8表示的氨基酸序列。7.一種多核苷酸，其具有編碼權利要求5中所述多肽的堿基序列。8.一種多核苷酸，其包含序列號7表示的堿基序列。9.一種DANCE的切割方法，其特征在于將DANCE與DANCE特異的蛋白酶接觸。10.一種抗體，其對權利要求1或2中所述的多肽具有特異的親和性。11.一種單克隆抗體，其對權利要求5或6中所述的多肽具有特異的親和性。12.一種方法，其特征在于在來自動物的生物材料中測定DANCE的切割量。13.一種DANCE的切割量測定用試劑盒，其特征在于含有抗DANCE抗體。14.一種DANCE突變體，其在DANCE中DANCE特異的蛋白酶對DANCE的切割位點處引入氨基酸突變以使DANCE顯示出對該DANCE特異的蛋白酶的抗性。15.一種多核苷酸，其具有編碼權利要求14中所述的多肽的堿基序列。16.一種DANCE復合體，其至少含有2個DANCE。17.根據權利要求16中所述的復合體，其至少含有可識別形態的2種DANCE。18.根據權利要求16或17中所述的復合體，其進一步含有賴氨酰氧化酶和/或LTBP2。19.一種DANCE復合體，其含有至少1個DANCE，以及賴氨酰氧化酶和/或LTBP2。20.一種至少含有2個DANCE的DANCE復合體的制備方法，其特征在于使至少2個DANCE接觸而形成復合體。21.一種含有至少1個DANCE，以及賴氨酰氧化酶和/或LTBP2的DANCE復合體的制備方法，其特征在于將至少1個DANCE與賴氨酰氧化酶和/或LTBP2接觸。22.一種篩選可調節DANCE特異的蛋白酶活性的物質的方法，其包含以下步驟(a)、(b)以及(c)(a)將被檢物質與DANCE特異的蛋白酶接觸的步驟；(b)測定由于上述(a)步驟產生的DANCE特異的蛋白酶的活性，將該活性與未接觸被檢物質時的DANCE特異的蛋白酶的活性進行比較的步驟；(c)基于上述(b)的比較結果，對調節DANCE特異的蛋白酶活性的被檢物質進行選擇的步驟。23.根據權利要求22中所述的方法，其為鑒定彈性纖維形成調節劑的方法。24.一種篩選可調節DANCE特異的蛋白酶活性的物質的方法，其包含以下步驟(a)、(b)以及(c)(a)向動物給予被檢物質的步驟；(b)測定由于上述(a)步驟產生的DANCE特異的蛋白酶的活性，將該活性與未給予被檢物質時的DANCE特異的蛋白酶的活性進行比較的步驟；(c)基于上述(b)的比較結果，對調節DANCE特異的蛋白酶活性的被檢物質進行選擇的步驟。25.一種篩選下述物質的方法，該物質可調節含有至少2個DANCE的DANCE復合體的形成，該方法包含以下步驟(a)、(b)以及(c)(a)被檢物質存在下，使至少2個DANCE相接觸的步驟；(b)測定由于上述(a)步驟產生的DANCE復合體的量，將該量與不存在被檢物質的情況下DANCE復合體的量進行比較的步驟；(c)基于上述(b)的比較結果，對調節DANCE復合體的形成的被檢物質進行選擇的步驟。26.根據權利要求25中所述的方法，其中使用可識別形態的至少2種DANCE。27.一種篩選下述物質的方法，該物質可調節含有至少1個DANCE，以及賴氨酰氧化酶和/或LTBP2的DANCE復合體的形成，該方法包含以下步驟(a)、(b)以及(c)(a)被檢物質存在下，將至少1個DANCE與賴氨酰氧化酶和/或LTBP2接觸的步驟；(b)測定由于上述(a)步驟產生的DANCE復合體的量，將該量與不存在被檢物質的情況下DANCE復合體的量進行比較的步驟；(c)基于上述(b)的比較結果，對調節DANCE復合體的形成的被檢物質進行選擇的步驟。28.一種彈性纖維形成調節劑，其由權利要求23～27所述的任一種方法得到。29.一種DANCE特異的蛋白酶的篩選方法，其以DANCE的切割活性為指標。30.一種DANCE特異的蛋白酶，其由權利要求29中所述的方法得到。31.一種多核苷酸，其具有編碼由權利要求29所述的方法得到的DANCE特異的蛋白酶的堿基序列。32.一種彈性纖維形成調節劑，其含有權利要求30所述的DANCE特異的蛋白酶，或權利要求31中所述的的多核苷酸。33.一種試劑盒，其含有以下(a)以及(b)(a)DANCE或具有編碼DANCE的堿基序列的多核苷酸；(b)以下(i)～(vi)的至少1種成分；(i)(a)中DANCE的可識別的形態的DANCE；(ii)具有編碼(a)的DANCE可識別的形態的DANCE的堿基序列的多核苷酸；(iii)賴氨酰氧化酶；(iv)具有編碼賴氨酰氧化酶的堿基序列的多核苷酸；(v)LTBP2；(vi)具有編碼LTBP2的堿基序列的多核苷酸。34.一種DANCE特異的蛋白酶表達細胞的鑒定方法，其含有以下步驟(a)以及(b)(a)特定的動物細胞與DANCE接觸的步驟；(b)評價DANCE是否被切割的步驟。全文摘要本發明提供一種開發具有可調節彈性纖維形成的新型作用機制的藥物的篩選方法，及該方法中必要的各種手段。更具體的是，本發明提供一種由DANCE的切割得到的多肽以及編碼該多肽的多核苷酸；DANCE的切割方法；由DANCE的切割得到的抗多肽的抗體；DANCE切割量的測定方法·試劑盒；DANCE突變體以及編碼該突變體的多核苷酸；各種DANCE復合體及其制備方法；可調節DANCE的活性的物質或DANCE特異的蛋白酶的篩選方法，以及由此得到的物質；彈性纖維形成調節劑；以及至少含有DANCE和編碼該DANCE的多核苷酸的試劑盒等。文檔編號A61K48/00GK1961073SQ200580017559公開日2007年5月9日申請日期2005年3月4日優先權日2004年3月29日發明者中邨智之,平井希俊申請人:國立大學法人京都大學