治療子宮內膜異位癥的藥物的制作方法

專利名稱：治療子宮內膜異位癥的藥物的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種治療子宮內膜異位癥的藥物，所述藥物包括白細胞介素-5(下文簡稱為IL-5)拮抗劑作為活性成分。
背景技術：
治療子宮內膜異位癥的方法主要分為藥物治療和手術治療。對于藥物治療，對癥治療例如鎮痛藥以及藥丸和激素治療例如給予藥物治療子宮內膜異位癥也包括在內。手術治療包括姑息性手術和根治性手術等(非專利文獻1)。但是，在某些情況下這些手術治療也還是不夠的，因此到目前為止，尚未開發出完全治愈子宮內膜異位癥的藥物。
作為與人IL-5特異反應的抗體，已知有SB-240563(Smithkline-Beecham)、Sch-55700(CDP-835；Schering-Plough/Celltech)等。SB-240563顯示出減少輕度哮喘患者周圍血中嗜酸性粒細胞數目的活性(10thAnnual Meeting of the America Society for ClinicalPharmacology and Therapeutics，March，1999)。已知Sch-55700抑制過敏性疾病猿猴模型中預激引起的肺內嗜酸性粒細胞增加(非專利文獻2)。
而且，作為與IL-5受體α鏈反應的抗體，已知有人源化抗體KM8399(專利文獻1)。預期KM8399可以用作治療過敏性疾病例如慢性支氣管哮喘的藥物。同樣已知KM8399具有人IgG1亞型的Fc區，該區特異性地誘導人嗜酸性粒細胞的凋亡，凋亡是通過抗體依賴性細胞毒性活性誘導的(專利文獻2)。
但是，上述與人IL-5特異性結合的抗體或與人IL-5受體特異性結合的抗體與子宮內膜異位癥之間的關系還不知道。
非專利文獻1Tsutomu Douchi等人，Selection of Treatment ofEndometriosis，Gynecologic Therapy，78，179-182(1999)非專利文獻2Arzneimittel-Forschung，49，779(1999)專利文獻1WO97/10354專利文獻2WO01/60405

發明內容
因此需要一種用于治療子宮內膜異位癥的藥物。
本發明涉及下列(1)到(13)(1)一種治療子宮內膜異位癥的藥物，其包括白細胞介素-5拮抗劑作為活性成分。
(2)根據(1)所述的藥物，其中白細胞介素-5拮抗劑是抑制白細胞介素-5與白細胞介素-5受體結合的抗體或其抗體片段。
(3)根據(2)所述的藥物，其中抑制白細胞介素-5與白細胞介素-5受體結合的抗體是與白細胞介素-5結合的抗體。
(4)根據(3)所述的藥物，其中白細胞介素-5是人白細胞介素-5。
(5)根據(2)所述的藥物，其中抑制白細胞介素-5與白細胞介素-5受體結合的抗體是與白細胞介素-5受體結合的抗體。
(6)根據(5)所述的藥物，其中白細胞介素-5受體是白細胞介素-5受體α鏈。
(7)根據(5)或(6)所述的藥物，其中白細胞介素-5受體是人白細胞介素-5受體。
(8)根據(2)到(7)任意一項所述的藥物，其中抗體是單克隆抗體。
(9)根據(8)所述的藥物，其中單克隆抗體是基因重組抗體。
(10)根據(9)所述的藥物，其中基因重組抗體是選自人嵌合抗體、人源化抗體和人抗體的基因重組抗體。
(11)根據(2)到(10)任意一項所述的藥物，其中抗體片段是選自Fab、Fab’、F(ab’)2、單鏈抗體(scFv)、二聚可變區(雙特異抗體)、二硫化物穩定可變區(dsFv)以及包括CDR的肽的抗體片段。
(12)根據(1)到(11)任意一項所述的白細胞介素-5拮抗劑在制備治療子宮內膜異位癥的藥物中的應用。
(13)一種治療子宮內膜異位癥的方法，其包括給予(1)到(11)任意一項所述的白細胞介素-5拮抗劑。
本發明提供了一種包括白細胞介素-5拮抗劑作為活性成分的治療子宮內膜異位癥的藥物。


圖1顯示了抗鼠IL-5受體抗體抑制子宮內膜異位癥小鼠模型中的子宮內膜異位病變形成的活性。縱座標顯示病變大小(mm2)。
圖2顯示了抗鼠IL-5抗體抑制子宮內膜異位癥小鼠模型中的子宮內膜異位病變形成的活性。縱座標顯示病變大小(mm2)。
具體實施例方式
本發明所使用的IL-5拮抗劑可以是任意拮抗劑，只要它能阻斷IL-5與IL-5受體之間的信號轉導和抑制IL-5的生物活性，并且它可以具有低分子量或者高分子量。例如，它包括抑制IL-5與IL-5受體結合的抗體或其抗體片段。
抑制IL-5與IL-5受體結合的抗體包括與IL-5結合并抑制IL-5與IL-5受體結合的抗體、與IL-5受體結合并抑制IL-5與IL-5受體結合的抗體等。對于IL-5受體，可包括IL-5受體α鏈、IL-5受體β鏈等。
本發明所使用的上述抗體或其抗體片段可以是任意一種多克隆抗體或者單克隆抗體，優選單克隆抗體。
單克隆抗體包括雜交瘤細胞產生的抗體、基因重組抗體等。
雜交瘤細胞是一種通過用抗原免疫非人哺乳動物得到的B細胞與骨髓瘤細胞之間進行細胞融合得到的細胞，它能產生具有所期望的抗原特異性的單克隆抗體。
基因重組抗體的例子包括人嵌合抗體、人源化抗體和人抗體等。
人嵌合抗體指包括非人動物抗體的VH和VL以及人抗體的CH和CL的抗體。對于人嵌合抗體的CH，可以使用任意的CH，只要它屬于人免疫球蛋白(下文稱作hIg)，優選其中的hIgG型。也可以使用屬于hIgG型的任意亞型hIgG1、hIgG2、hIgG3和hIgG4。對于人嵌合抗體的CL，可以使用任意CL，只要它屬于hIg并且可以使用任意的κ型或者λ型。
非人類動物包括小鼠、大鼠、倉鼠、兔等。
人源化抗體是其中非人類動物抗體的VH和VL的CDR被移植到人抗體的VH和VL的適當位置的抗體，也被稱作人CDR移植抗體。
本發明的人源化抗體如下進行制備設計和構建編碼V區的cDNA，其中非人類動物抗體的VH和VL的CDR被連接到任意人抗體的VH和VL的框架結構(下文稱為FR(s))上，并將它們分別插入到用于具有編碼人抗體的CH和CL的cDNA的動物細胞的表達載體中，從而構建人源化抗體表達載體，然后將該表達載體導入到動物細胞內以表達人源化抗體。
對于人源化抗體的CH，可以使用任意CH，只要它屬于hIg，但是，優選屬于hIgG型的抗體，并且還可以使用屬于hIgG型的任意亞型例如hIgG1、hIgG2、hIgG3和hIgG4。進一步，對于人源化抗體的CL，可以使用任意CL，只要它屬于hIg，并且可以使用屬于κ型或者λ型的抗體。
盡管人抗體原先是在人體內自然存在的抗體，但是它也包括從人抗體噬菌體文庫中獲得的抗體，以及從通過基因工程、細胞工程和發育工程技術的新進展而制備的產生人抗體的轉基因動物中獲得的抗體。對于存在于人體內的抗體，例如，通過分離人周圍血淋巴細胞，通過用EB病毒或類似物感染使其永生化，然后將其克隆以獲得能產生抗體的淋巴細胞，培養由此獲得的這些淋巴細胞，從培養上清液中純化這些抗體。人抗體噬菌體文庫是其中通過將由人B細胞制備而成的抗體編碼基因插入到噬菌體基因內從而使抗體片段例如Fab和scFv在噬菌體表面上表達的一種文庫。在其表面上具有所需要的抗原結合活性的表達抗體片段的噬菌體可以通過使用與固定抗原的底物的結合活性來作為指標從文庫中收集。通過基因工程技術，抗體片段可以進一步轉變成包括兩條全長H鏈和兩條全長L鏈的人抗體分子。產生人抗體的轉基因動物是指其中人抗體基因整合到其細胞中的動物。例如，產生人抗體的轉基因小鼠可以通過將人抗體基因導入小鼠ES細胞中，然后將該ES細胞移植到小鼠的早期胚胎并發育而獲得。對于從產生人抗體的轉基因動物制備人抗體的方法，可以通過培養由通常在非人類動物上進行的雜交瘤制備方法獲得的產生人抗體的雜交瘤細胞，在培養上清液中形成和積累人抗體。
優選用于本發明中的抗體或者抗體片段包括由雜交瘤細胞ATCCHB10959(日本公開的未經審查的專利申請第2000-210097號)制備的單克隆抗體，該抗體與IL-5結合并抑制IL-5與IL-5受體的結合；由雜交瘤細胞KM1259(FERM BP-5134，WO97/10354)和雜交瘤細胞KM1486(FERM BP-5651，WO97/10354)等制備的單克隆抗體，它與IL-5受體α鏈結合并抑制IL-5與IL-5受體的結合；以及由雜交瘤細胞BION-1(ATCC HB-12525，WO00/09561)制備的單克隆抗體，該抗體特異性結合IL-5受體β鏈并抑制IL-5與IL-5受體的結合；以及這些抗體的抗體片段。
與人IL-5受體結合并抑制IL-5與IL-5受體結合的人嵌合抗體的具體實例包括抗人IL-5R α鏈嵌合抗體，其包括包括SEQ ID NO1、2和3分別所示的氨基酸序列的VH的CDR1、CDR2和CDR3，和/或包括SEQ ID NO4、5和6分別所示的氨基酸序列的VL的CDR1、CDR2和CDR3；具有包括SEQ ID NO7所示的氨基酸序列的抗體的VH和/或包括SEQ ID NO8所示的氨基酸序列的抗體的VL的抗人IL-5α鏈嵌合抗體；具有包括SEQ ID NO7所示的氨基酸序列的抗體的VH和包括hIgG1亞型氨基酸序列的人抗體的CH以及包括SEQ ID NO8所示的氨基酸序列的抗體的VL和包括κ型氨基酸序列的人抗體的CL的抗人IL-5R α鏈嵌合抗體。實例包括KM1399(WO97/10354)等。
與人IL-5受體α鏈結合并抑制IL-5與IL-5受體結合的人源化抗體的實例包括這樣的抗體其包括SEQ ID NO24、25和26分別所示的氨基酸序列的VH的CDR1、CDR2和CDR3，和/或包括SEQ ID NO27、28和29分別所示的氨基酸序列的VL的CDR1、CDR2和CDR3；更優選這樣的抗體其包括SEQ ID NO18、19和20分別所示的氨基酸序列的VH的CDR1、CDR2和CDR3，和/或包括SEQ ID NO21、22和23分別所示的氨基酸序列的VL的CDR1、CDR2和CDR3；仍然更優選這樣的抗體其包括SEQ ID NO1、2和3分別所示的氨基酸序列的VH的CDR1、CDR2和CDR3，和/或包括SEQ ID NO4、5和6分別所示的氨基酸序列的VL的CDR1、CDR2和CDR3，以及這些抗體的抗體片段。
在上述的人源化抗體組合物中，優選包括抗體VH的人源化抗體組合物(其中SEQ ID NO9所示的氨基酸序列或者至少一個選自SEQID NOo9所示的氨基酸序列中位點40的丙氨酸(Ala)、位點46的谷氨酸(Glu)、位點67的精氨酸(Arg)、位點72的丙氨酸(Ala)、位點74的蘇氨酸(Thr)、位點79的丙氨酸(Ala)、位點95的酪氨酸(Tyr)和位點97的丙氨酸(Ala)的氨基酸殘基被另一個氨基酸殘基所取代)，以及包括抗體VL的人源化抗體(其中SEQ ID NO10所示的氨基酸序列或者至少一個選自SEQ ID NO10所示的氨基酸序列中位點7的絲氨酸(Ser)、位點8的脯氨酸(Pro)、位點22的蘇氨酸(Thr)、位點37的谷氨酰胺(Gln)、位點38的谷氨酰胺(Gln)、位點44的脯氨酸(Pro)、位點45的賴氨酸(Lys)、位點71的苯丙氨酸(Phe)、位點77的絲氨酸(Ser)、位點87的酪氨酸(Tyr)和位點98的苯丙氨酸(Phe)的氨基酸殘基被另一個氨基酸殘基所取代)；更優選包括抗體VH和抗體VL的人源化抗體，在抗體的VH中，至少一個選自SEQ ID NO9所示的氨基酸序列中位點40的丙氨酸(Ala)、位點46的谷氨酸(Glu)、位點67的精氨酸(Arg)、位點72的丙氨酸(Ala)、位點74的蘇氨酸(Thr)、位點79的丙氨酸(Ala)、位點95的酪氨酸(Tyr)和位點97的丙氨酸(Ala)的氨基酸殘基被另一個氨基酸殘基所取代，在抗體的VL中，至少一個選自SEQ ID NO10所示的氨基酸序列中位點7的絲氨酸(Ser)、位點8的脯氨酸(Pro)、位點22的蘇氨酸(Thr)、位點37的谷氨酰胺(Gln)、位點38的谷氨酰胺(Gln)、位點44的脯氨酸(Pro)、位點45的賴氨酸(Lys)、位點71的苯丙氨酸(Phe)、位點77的絲氨酸(Ser)、位點87的酪氨酸(Tyr)和位點98的苯丙氨酸(Phe)的氨基酸殘基被另一個氨基酸殘基所取代。
實例包括人源化抗體，其包括其中抗體的VH分別由SEQ ID NO9、11、12和13所示，或者其中至少一個選自SEQ ID NO9所表示的氨基酸序列中位點40的丙氨酸(Ala)、位點46的谷氨酸(Glu)、位點67的精氨酸(Arg)、位點72的丙氨酸(Ala)、位點74的蘇氨酸(Thr)、位點79的丙氨酸(Ala)、位點95的酪氨酸(Tyr)和位點97的丙氨酸(Ala)的氨基酸殘基被另一個氨基酸殘基取代的氨基酸序列，和/或其中抗體的VL分別由SEQ ID NO10、14、15、16和17所示的氨基酸序列；或者其中至少一個選自SEQ ID NO10所示的氨基酸序列中位點7的絲氨酸(Ser)、位點8的脯氨酸(Pro)、位點22的蘇氨酸(Thr)、位點37的谷氨酰胺(Gln)、位點38的谷氨酰胺(Gln)、位點44的脯氨酸(Pro)、位點45的賴氨酸(Lys)、位點71的苯丙氨酸(Phe)、位點77的絲氨酸(Ser)、位點87的酪氨酸(Tyr)和位點98的苯丙氨酸(Phe)的氨基酸殘基被另一個氨基酸殘基取代的氨基酸的氨基酸序列。更具體的是包括其中VH為SEQ ID NO13所示和VL為SEQ ID NO10所示的氨基酸序列的人源化抗體，例如，KM8399(WO97/10354)、KM7399(WO97/10354)等也包括在內。
進一步，與IL-5結合并抑制IL-5與IL-5受體結合的人化抗體包括美泊利單抗(mepolizumab)[SB-240563，GlaxoSmithKline制造]、reslizumab[Sch-55700，Schering-Plough/Celltech制造]等。
在構建上述抗體或者抗體片段的氨基酸序列中，其中的一個或者多個氨基酸殘基被刪除、增加、取代或者插入并且活性與上述的抗體或者抗體片段基本相當的抗體或者抗體片段包括在本發明所使用的抗體之內。
要被刪除、插入、取代或者增加的氨基酸數目可以是一個或者多個，該數目沒有特別的限制，但其是一個能通過已知的技術例如位點定向誘變而被刪除、取代或者增加的數目，該技術在Molecular Cloning，A Laboratory Manual，第二版；Current Protocols in Molecular Biology；Nucleic Acids Research，10，6487(1982)；Proc.Natl.Acad.Sci.USA，79，6409(1982)；Gene，34，315(1985)；Nucleic Acids Research，13，4431(1985)；Proc.Natl.Acad.Sci.USA，82，488(1985)等中有所描述。例如，它可以是1到數十，優選1到20，更優選1到10，進一步優選1到5。
在上述的抗體的氨基酸序列中刪除、取代、插入或者增加一個或者多個氨基酸是指一個或者多個氨基酸被刪除、取代、插入或者增加到氨基酸序列中的一個或者多個任意的位置上。刪除、取代、插入或者增加可以在同一個氨基酸序列中同時進行。同樣，被取代、插入或者增加的氨基酸殘基可以是天然的或者人工的。天然的氨基酸殘基包括L-丙氨酸、L-天門冬酰胺、L-天門冬氨酸、L-谷氨酰胺、L-谷氨酸、甘氨酸、L-組氨酸、L-異亮氨酸、L-亮氨酸、L-賴氨酸、L-蛋氨酸、L-苯丙氨酸、L-脯氨酸、L-絲氨酸、L-蘇氨酸、L-色氨酸、L-酪氨酸、L-纈氨酸、L-半胱氨酸等。
在下文中，顯示了能互相取代的氨基酸殘基的優選實例。在同一組內的氨基酸殘基可以相互取代。
A組亮氨酸、異亮氨酸、正亮氨酸、纈氨酸、正纈氨酸、丙氨酸、2-氨基丁酸、蛋氨酸、O-甲基絲氨酸、t-丁基甘氨酸、丙氨酸環己酯；B組天門冬氨酸、谷氨酸、異天門冬氨酸、異谷氨酸、2-氨基己二酸、2-氨基辛二酸；C組天門冬酰胺、谷氨酰胺D組賴氨酸、精氨酸、鳥氨酸、2，4-二氨基丁酸、2，3-二氨基丙酸E組脯氨酸、3-羥脯氨酸、4-羥脯氨酸；F組絲氨酸、蘇氨酸、同型絲氨酸；G組苯丙氨酸、酪氨酸。
本發明所使用的抗體片段包括Fab、Fab’、F(ab’)2、scFv、雙特異抗體、dsFv以及包括CDR的肽等。
Fab是分子量約為50,000并且具有抗原結合活性的抗體片段，其中在用蛋白酶、木瓜蛋白酶(在H鏈的位點224切斷氨基酸殘基)處理IgG型抗體分子而得到的片段中，其H鏈的N末端約一半和L鏈的全長通過二硫鍵連接在一起。
本發明所使用的Fab可以通過用蛋白酶、木瓜蛋白酶處理抗體而制成。可供選擇的是，編碼抗體Fab的DNA被插入到原核生物的表達載體或者真核生物的表達載體，然后將載體導入原核生物或者真核生物來誘發表達。
F(ab’)2是分子量約為100,000并具有抗原結合活性的抗體片段，其中在用蛋白酶、木瓜蛋白酶處理IgG型抗體分子而得到的片段中，其抗原結合活性比經由鉸鏈區的二硫鍵連接的Fab稍大。
本發明所使用的F(ab’)2可以通過用蛋白酶、木瓜蛋白酶處理抗體而制成。可供選擇的，它可以經由硫醚鍵或者二硫鍵來連接下述Fab’而制成。
Fab’是分子量約為50000并具有抗原結合活性的抗體片段，其中上述的F(ab’)2鉸鏈區的二硫鍵被劈開。
本發明所使用的Fab’可以通過用還原劑二硫蘇糖醇處理F(ab’)2而制成。可供選擇的，編碼抗體Fab’片段的DNA被插入到原核生物的表達載體或者真核生物的表達載體，然后將載體導入原核生物或者真核生物來誘發表達。
scFv是具有抗原結合活性的抗體片段并且是VH-P-VL或者VL-P-VH多肽，其中一個VH和一個VL使用適當的肽連接子(下文稱為P)連接在一起。
本發明所使用的scFv可以這樣的方式制備，獲得編碼抗體VH和VL的cDNA，構建編碼scFV的DNA，將該DNA插入到原核生物的表達載體或者真核生物的表達載體，然后將該表達載體導入原核生物或者真核生物來誘發表達。
雙特異抗體是其中scFv被二聚化的抗體片段并且具有二價抗原結合活性的抗體片段。二價抗原結合活性可以是相同的或者其中之一可以用作不同的抗原結合活性。
本發明所使用的雙特異抗體可以以這樣的方式制備，獲得編碼抗體VH和VL的cDNA，構建編碼scFv的DNA從而使連接子的氨基酸序列的長度不超過8個殘基，將該DNA插入到原核生物的表達載體或者真核生物的表達載體，然后將該表達載體導入原核生物或者真核生物來誘發表達。
dsFV是其中VH和VL每個中的一個氨基酸殘基被半胱氨酸殘基取代的多肽經半胱氨酸殘基之間的二硫鍵連接在一起的抗體片段。用半胱氨酸取代的氨基酸殘基根據Reiter等人所示的方法，基于抗體的三維結構的估計進行選擇(Protein Engineering，7，697-704(1994))。
本發明所使用的dsFv可以以這樣的方式制備，獲得編碼抗體VH和VL的cDNA，構建編碼dsFv的DNA，將該DNA插入到原核生物的表達載體或者真核生物的表達載體，然后將該表達載體導入原核生物或者真核生物來誘發表達。
包括CDR的肽通過包括VH或VL的CDR的至少一個區域來構建。包括多個CDR的肽可以直接連接或經由適當的肽連接子來連接。本發明中所使用的包括CDR的肽可以這樣的方式制備，構建編碼VH和VL的DNA，將該DNA插入到原核生物的表達載體或者真核生物的表達載體，然后將該表達載體導入原核生物或者真核生物來誘發表達。包括CDR的肽還可以通過化學合成方法，例如Fmoc法(芴基甲基氧基羰基法)和tBoc法(叔丁基氧基羰基法)來制備。
下面描述制備本發明所使用的抗體或者抗體片段的方法及其活性的評價1.單克隆抗體的制備(1)抗原的制備包括編碼多肽的cDNA的表達載體作為抗原被導入大腸桿菌、酵母菌、昆蟲細胞、動物細胞等內并在其中表達，從而獲得重組蛋白，所得的蛋白質可以用作抗原。可選的是，具有抗原多肽的部分氨基酸序列的合成多肽也可以用作抗原。
對于抗原的部分肽，選擇約5到30個殘基的部分蛋白質序列。為了獲得識別處于具有未變性的自然結構狀態的蛋白質的抗體，鑒于三維結構，必須選擇存在于蛋白質表面的部分氨基酸序列作為抗原肽。分析蛋白質的三維結構的方法的實例包括這樣的方法，該方法用市售的分析蛋白質序列的軟件如Genetyx Mac等預測高度親水的部分序列。鑒于三維結構有許多低親水區域存在于蛋白質的內部的情況以及還有許多高親水區域存在于蛋白質表面的情況。另外，有許多蛋白質的N-末端和C-末端存在于蛋白質的表面的情況。
為了與蛋白質交聯，將半胱氨酸加入到部分肽的末端。當蛋白質的內在序列被選作部分肽時，如果需要的話，該肽的N-末端和C-末端分別被乙酰化和酰胺化。部分肽可以通過普通的液相或者固相肽合成方法、將其適當組合而成的方法或者其改良的方法(The Peptides，Analysis，Synthesis，Biology，Vol.1(1979)；Vol.2(1980)；Vol.3，(1981)，Academic Press；Fundamentals and Experiments for Peptide Synthesis，Maruzen(1985)；Development of Drugs，Second Series，Vol.14，PeptideSynthesis，Hirokawa Shoten(1991)；International Journal of Protein &Protein Research，35，161-214(1990))而合成。也可能使用自動化肽合成儀。用肽合成儀來合成肽可以在市售的肽合成儀如Shimadzu制造的肽合成儀、Applied Biosystems，Inc.(下文稱為ABI)制造的肽合成儀、Advanced ChemTech Inc.(下文稱為ACT)制造的肽合成儀上，使用側鏈被適當保護的Nα-Fmoc-氨基酸或Nα-Boc氨基酸，根據各自的合成程序來進行。
用作原料的受保護的氨基酸和載體樹脂可從ABI、Shimadzu、Kokusan Kagaku、Nova Biochem、Watanabe Kagaku、ACT、PeptideLaboratory等獲得。用作起始原料的受保護的氨基酸、受保護的有機酸和受保護的有機胺可以通過已報道的合成方法或其改良方法(ThePeptides，Analysis，Synthesis，Biology，Vol.1(1979)；Vol.2(1980)；Vol.3，(1981)，Academic Press；Fundamentals and Experiments for PeptideSynthesis，Maruzen(1985)；Development of Drugs，Second Series，Vol.14，Peptide Synthesis，Hirokawa Shoten(1991)；International Journal ofProtein & Protein Research，35，161-214(1990))來合成。
(2)動物的免疫和抗體生成細胞的制備對于用于免疫的動物，可以使用任何動物只要它能制備雜交瘤細胞，如小鼠、大鼠、倉鼠、兔。使用小鼠和大鼠的實施例將闡述如下。
將3到20周齡的小鼠或大鼠用上述1(1)制備的抗原免疫并從動物的脾臟、淋巴結和周圍血中收集抗體生成細胞。免疫是通過將抗原與適當的佐劑一起經皮下、靜脈內或腹腔內給予動物數次而進行的。佐劑的實例包括完全福氏佐劑或者氫氧化鋁凝膠、百日咳疫苗等。與載體蛋白如牛血清蛋白(下文稱為BSA)或者鑰孔血蘭素(下文稱為KLH)制備共軛物，得到的共軛物可用作免疫原。給予每種抗原后的3到7天，從免疫的動物的眼底靜脈叢或者尾靜脈采血，通過ELISA等方法來證實抗原的反應性，當小鼠或者大鼠的血清顯示出足夠的抗體值時就用作抗體生成細胞的來源。在最后一次給予抗原后的3到7天，將脾臟等通過已知的方法(Antibodies-A Laboratory Manual，Cold SpringHarbor Laboratory(1988))從免疫的小鼠或者大鼠上切除，將抗體生成細胞和骨髓瘤細胞融合。
(3)骨髓瘤細胞的制備對于骨髓瘤細胞，可以使用任何骨髓瘤細胞只要它能在體外增殖，例如8-氮鳥嘌呤-抗性骨髓瘤細胞系P3-X63Ag8-U1(P3-U1)(EuropeanJournal ofImmunology，6，511-519(1976))、SP2/0-Ag 14(SP-2)(Nature，276，269-270(1978))、P3-X63-Ag8653(653)(Journal of Immunology，123，1548-1550(1979))、P3-X63-Ag8(X63)(Nature，256，495-497(1975))等。這些細胞系的培養和傳代培養可以根據已知的方法(Antibodies-ALaboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory(1988))進行，從而到細胞融合階段保證不少于2×107個細胞。
(4)細胞融合洗滌上述制備的抗體生成細胞和骨髓瘤細胞并向其中加入細胞凝集培養基例如聚乙二醇-1000(下文稱為PEG-1000)，細胞在培養基內融合和懸浮。用伊格爾氏培養基(下文稱為MEM)、磷酸鹽緩沖鹽水(下文稱為PBS)等來洗滌細胞。對于其中懸浮融合細胞的培養基，使用HAT培養基{將0.1mM次黃嘌呤、15μM胸腺嘧啶和0.4μM氨基蝶呤加入到普通培養基[將1.5mM谷氨酰胺、50μM 2-巰基乙醇、10μg/mL慶大霉素和10％胎牛血清(下文稱為FBS)加入到RPMI-1640培養基中所形成的培養基]中所形成的培養基}，來選擇性地得到所需要的融合細胞。
培養之后，取出部分培養上清液，通過ELISA來選擇與抗原蛋白質反應并且不與非抗原蛋白反應的樣品。然后，進行有限稀釋法使其形成單個細胞，將通過ELISA顯示穩定和高抗體滴度的樣品選作單克隆抗體生成雜交瘤。
(5)雜交瘤的選擇對產生抗原反應性抗體的雜交瘤的選擇通過下文描述的ELISA，根據已知的方法(Antibodies-A Laboratory Manual，Cold Spring HarborLaboratory(1988))進行。根據這一方法，現在有可能測定轉化細胞株(該轉化細胞株產生人嵌合抗體、CDR移植抗體或者其抗體片段或者從下文將要描述的培養上清液中純化的抗體)的培養上清夜中含有的抗體的抗原結合活性。
ELTSA將抗原放置于96孔ELISA板內，用如雜交瘤的培養上清液或者純化抗體作為一抗進行反應。當一抗反應完成后，洗滌該板，加入二抗。對于二抗，使用能識別一抗的標有生物素、酶、化學發光物質、放射性同位素等的抗體。具體地說，當在雜交瘤的制備中使用小鼠時，將能夠識別小鼠抗體的抗體用作二抗。反應后，進行與二抗的標記物質相對應的反應來選擇能產生與抗原特異性反應的單克隆抗體的雜交瘤。
(6)單克隆抗體的純化將在1(4)中獲得的單克隆抗體生成雜交瘤細胞以5×106到2×107細胞/鼠的量腹腔內注射到已經腹腔內給予0.5mL的姥鮫烷(2，6，10，14-四甲基十五烷)的8到10周齡的小鼠或者裸鼠中，隨后飼養2周。在10到21天，雜交瘤變成腹水瘤。收集小鼠或者裸鼠的腹水，離心，用40到50％的飽和硫酸銨鹽析，用辛酸沉淀法進行沉淀，用DEAE-Sepharose柱、蛋白A柱、Cellulofine GSL 2000柱(Seikagaku Kogyo制造)等回收IgG或者IgM片段來制備純化的單克隆抗體。
純化的單克隆抗體的亞型可通過使用小鼠單克隆抗體分型試劑盒、大鼠單克隆抗體分型試劑盒等進行鑒定。蛋白質的濃度可以用羅氏蛋白質定量法或者在280nm處的吸光度來計算。
抗體的亞型指在一種類型中的同種型，包括小鼠中的IgG1、IgG2a、IgG2b和IgG3以及人類的IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。
(7)單克隆抗體的活性評價(7-1)抗原結合活性的評價在培養上清液中的或者從培養上清液中純化的單克隆抗體的抗原結合活性可以用上述1(5)中提到的ELISA方法、表面等離子體共振(Journal of Immunological Methods，145，229-240(1991))等方法檢測。與抗原和抗原決定簇的反應性也可以使用抗原肽和其部分肽通過競爭性ELISA進行分析。通過通常采用的三維結構分析方法或者各種免疫方法的聯合應用可以推測抗體是否識別作為抗原的蛋白質的三維結構。三維結構分析方法的實例包括X-線結晶學和核磁共振方法。各種免疫方法聯合應用的實例包括對未變性抗原的ELISA和對變性抗原的ELISA的聯合應用。在那種情況下，僅對未變性抗原具有反應性的抗體被高度推測能識別抗原的三維結構。對未變性抗原的ELISA的實例包括使未變性抗原與抗體在液相中反應的ELISA。對于對變性抗原的ELISA，可以使用任何方法，只要在ELISA中抗體在抗原不具有其天然三維結構的狀態下進行反應，實例包括對直接固定在疏水反應板上的抗原的ELISA以及對被消化到適當長度的部分肽的ELISA。
2.制備抗原的非人類動物多克隆抗體多克隆抗體可以從動物血清中制備，其中在通過上述1(2)描述的方法免疫的動物中，該動物血清顯示了足夠的抗體滴度。
因此，將從動物收集的血離心分級出血清，通過傳統的方法從血清中純化免疫球蛋白餾分，從而可以制備多克隆抗體。對于多克隆抗體的活性，可以通過上述1(7)中提及的方法評價其抗原結合活性。
3.制備人嵌合抗體和人源化抗體(1)構建人嵌合抗體和人源化抗體的表達載體對于人嵌合抗體和人源化抗體的表達載體(下文兩者都稱為人源化抗體表達載體)，可以使用表達人源化抗體的任何載體，只要它是編碼人抗體CH和/或CL的基因插入其中的動物細胞表達載體。表達人源化抗體的表達載體可通過分別將編碼人抗體CH和CL的基因克隆到動物細胞表達載體內而構建。
人抗體的C區可以是任何人抗體的CH和CL，實例包括人抗體H鏈的IgG1亞型的C區(下文稱為hCγ1)、人抗體L鏈的κ型的C區(下文稱為hCκ)等。對于編碼人抗體CH和CL的基因，可以使用包括外顯子和內含子的染色體DNA，也可以使用cDNA。
對于動物細胞的表達載體，可以使用任何載體，只要編碼人抗體的C區的基因可被插入和表達。實例包括pAGE107(Cytotechnology，3，133-140(1990))、pAGE103(Journal of Biochemistry，101，1307-1310(1987))、pHSG274(Gene，27，223-232(1984))、pKCR(Proceedings of theNational Academy of Science of the United State of America，78，1527-1531(1981))、pSG1βd2-4(Cytoteehnology，4，173-180(1990))等。用作動物細胞表達載體的啟動子和增強子的實例包括SV40初始啟動子和增強子(Journal of Biochemistry，101，1307-1310(1987))、莫洛尼小鼠白血病病毒LTR啟動子和增強子(Biochemical & Biophysical ResearchCommunications，149，960-968(1987))、免疫球蛋白H鏈啟動子(Cell，41，479-487(1985))和增強子(Cell，33，717-728(1983))等。
對于表達人源化抗體的載體，可以使用抗體的H鏈和L鏈在不同的載體上的類型或者在同一載體上的(下文稱為串聯型)類型，但是，考慮到構建人嵌合抗體的表達載體和人源化抗體的表達載體的容易度、導入到動物細胞內的容易度以及動物細胞中抗體H鏈和L鏈的表達量的良好平衡，優選串聯型人源化抗體的表達載體(Journal ofImmunological Methods，167，271-278(1994))。串聯型人源化抗體的表達載體的實例包括pKANTEX93(WO97/10354)、pEE18(Hybridoma，17，559-567(1998))等。
構建的人源化抗體表達載體可以用于在動物細胞內表達人嵌合抗體和人源化抗體。
(2)編碼非人類動物的抗體V區的cDNA的獲得以及其氨基酸序列的分析編碼非人類動物的抗體如小鼠抗體的VH和VL的cDNA通過如下方法獲得。
從雜交瘤細胞提取mRNA并合成cDNA。合成的cDNA被克隆進入到載體，如質粒或者噬菌體內，從而制備cDNA文庫。用小鼠抗體的C區或者V區作為探針，將每個具有編碼VH的cDNA的重組噬菌體或者重組質粒以及具有編碼VL的cDNA的重組噬菌體或者重組質粒從文庫中分離出來。測定在重組噬菌體或者重組質粒上所需的小鼠VH和VL的全長核苷酸序列，并從核苷酸序列推定VH和VL的全長氨基酸序列。
對于非人類動物，可以使用任何動物，如小鼠、大鼠、倉鼠和兔，只要它能制備雜交瘤。
從雜交瘤制備完整的RNA的方法的實例包括硫氰酸胍-三氟醋酸銫法(Methods in Enzymology，154，3-28(1987))等，從完整的RNA制備mRNA的方法的實例包括低聚(dT)固定的纖維素吸附柱法(Molecular CloningA Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Lab.Press，New York，(1989))等。從雜交瘤制備mRNA的試劑盒的實例包括Fast Track mRNA Isolation Kit(Invitrogen制造)、Quick Prep mRNAPurification Kit(Pharmacia制造)等。
合成cDNA和制備cDNA文庫的方法的實例包括傳統的方法(Molecular CloningA Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Lab.Press，New York，(1989)；Current Protocols in Molecular Biology，Supplement 1-34)以及使用市售試劑盒的方法，所述試劑盒如SuperScriptTMPlasmid System for cDNA Synthesis and Plasmid Cloning(GibcoBRL制造)以及ZAP-cDNA合成試劑盒(Stratagene制造)。
對于其中插入了制備cDNA文庫時用從雜交瘤提取出來作為模板的mRNA合成的cDNA的載體，可以使用任何載體，只要cDNA可以插入其中。例如，可以使用噬菌體或者質粒載體如ZAP Express(Strategies，5，58-61(1992))、pBluescript II SK(+)(Nucleic Acid Research，17，9494(1989))、λZAP II(Stratagene制造)、λgt10和λgt11(DNACloningA Practical Approach，I，49(1985))、Lambda BlueMid(Clontech制造)、λExCell、pT7T3 18U(Pharmacia制造)、pcD2(Molecular & CelllilarBiology，3，280-289(1983))和pUC 18(Gene，33，103-119(1985))。
對于其中導入了通過噬菌體或者質粒載體構建的cDNA文庫的大腸桿菌，可以使用任何大腸桿菌，只要cDNA庫能夠被導入、表達和保留。實例包括XL1-Blue MRF’(Journal of Biotechnology，23，271-289(1992))、C600(Genetics，59，177-190(1968))、Y1088和Y1090(Science，222，778-782(1983))、NM522(Journal of Molecular Biology，166，1-19(1983))、K802(Journal of Molecular Biology，16，118-133(1966))、JM105(Gene，38，275-276(1985))等。
對于從cDNA文庫中選擇編碼非人類動物抗體的VH和VL的cDNA克隆的方法，可以通過菌落雜交法或者噬菌斑雜交法(MolecularCloningALaboratory Manual，Cold Spring Harbor Lab.Press，NewYork，(1989))使用放射性同位素或者免疫熒光標記探針進行選擇。另外，編碼的VH和VL的cDNA可通過聚合酶鏈式反應通過制備引物和從mRNA或者cDNA文庫作為模板合成的cDNA來制備(下文稱為PCR法；Molecular CloningA Laboratory Manual，Cold Spring HarborLab.Press，New York，(1989)；Current Protocols in Molecular Biology，Supplement 1-34)。
將通過上述方法選擇的cDNA用適當的限制性內切酶或類似物切斷、克隆到質粒載體如pBluescript SK(-)(Stratagene制造)、再進行通常用于分析核苷酸序列的方法如雙脫氧法(Proceeding of the NationalAcademy of Sciences of the United States of America，74，5463-5467(1977))并通過自動測序裝置(ABI PRISM 377(ABI制造))或類似裝置進行分析，從而可以測定cDNA的核苷酸序列。
從測定的核苷酸序列推定VH和VL的全長氨基酸序列并與已知的抗體的VH和VL的全長氨基酸序列進行比較(Sequences of Proteins ofImmunological Interest，U.S.Dept.Health and Human Services(1991))，從而可以證實所得的cDNA是否編碼含有分泌的信號序列的抗體的VH和VL的全長氨基酸序列。對于含有信號序列長度和信號序列的N-末端氨基酸序列的抗體的VH和VL的全長氨基酸序列可以通過與已知的抗體的VH和VL的全長氨基酸序列進行比較而推知(Sequences ofProteins of Immunological Interest，U.S.Dept.Health and HumanServices(1991))，進一步，也可以測定它們屬于哪種亞型。同樣，VH和VL的每個CDR的氨基酸序列也可以通過與已知的抗體的VH和VL的氨基酸序列進行比較而發現(Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest，U.S.Dept.Health and Human Services(1991))。
可采用序列的同源性檢索，如BLAST方法對任意數據庫例如SWISS-PROT或者PIR-Protein(Journal of Molecular Biology，215，403-410(1990))使用VH和VL的全長氨基酸序列來檢測序列的新穎性。
(3)構建人嵌合抗體表達載體編碼非人類動物抗體的VH和VL的cDNA被克隆在上述3(1)中提及的表達人源化抗體的載體的編碼人抗體VH和VL的基因上游，從而構建人嵌合抗體表達載體。例如，將編碼非人類動物抗體的VH和VL的每個cDNA連接到合成的DNA上，該DNA包括非人類動物抗體的VH和VL的3’-末端核苷酸序列和人類抗體的CH和CL的5’-末端核苷酸序列以及在兩端都具有適當的限制性內切酶的識別序列，然后克隆使得它們每個都以適當的形式表達在上述3(1)中提及的表達人源化抗體的載體的編碼人抗體的CH和CL的基因上游，從而構建人嵌合抗體表達載體。另外，編碼VH和VL的cDNA使用在5’-末端具有適當的限制性內切酶的識別序列的引物，使用含有編碼非人類動物抗體的VH和VL的cDNA作為模板的質粒通過PCR法進行擴增，然后將它們每個都進行克隆使其以適當的形式表達在上述3(1)中提及的表達人化抗體的載體的編碼人抗體的CH和CL的基因上游，從而構建人嵌合抗體表達載體。
(4)構建編碼人源化抗體V區的cDNA編碼人源化抗體VH和VL的cDNA可如下進行構建。首先，選擇移植了所需的非人類動物抗體VH和VL中的CDR氨基酸序列的人抗體VH和VL中的FR氨基酸序列。對于人抗體VH和VL中的FR氨基酸序列，可以使用人抗體VH和VL中的任何FR氨基酸序列，只要它來源于人抗體。其實例包括登記在數據庫例如Protein Data Bank中人抗體VH和VL中的FR氨基酸序列以及人抗體VH和VL中的FR每個亞組的共有氨基酸序列(Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest，U.S.Dept.Health and Human Services(1991))。為了制備具有足夠活性的人源化抗體，優選選擇上述序列中與所需的非人類動物抗體VH和VL的FR氨基酸序列具有盡可能高(至少60％或者更高)的同源性的氨基酸序列。然后，將所需的非人類動物抗體VH和VL的CDR氨基酸序列移植到所選的人抗體VH和VL的FR氨基酸序列中，來設計人源化抗體VH和VL的氨基酸序列。通過考慮在抗體基因的核苷酸序列中發現的密碼子選擇頻率，將被設計的氨基酸序列轉變為核苷酸序列(Sequences of Proteins of Immunological Interest，U.S.Dept.Healthand Human Services(1991))，從而設計編碼人源化抗體VH和VL的核苷酸序列。基于所設計的核苷酸序列，合成了數個長度為大約100個堿基的合成DNA，通過使用它們進行PCR。在此種情況下，考慮到在PCR中的反應效率和可合成的DNA的長度，對于VH和VL優選設計6個合成DNA。
進一步，通過將適當的限制性內切酶的識別序列引入到位于兩端的合成DNA的5’-末端，克隆到上述3(1)中構建的人源化抗體的表達載體將很容易進行。PCR后，擴增的產物克隆到質粒如pBluescriptSK(-)(Stratagene制造)中，通過在3(2)中提及的方法測定核苷酸序列，獲得的質粒具有編碼所需的人源化抗體VH和VL的氨基酸序列的核苷酸序列。
(5)修飾人源化抗體V區的氨基酸序列已經知道，當通過簡單的將所需的非人類動物抗體VH和VL中的CDR移植到人抗體VH和VL中的FR制備人源化抗體時，人CDR-移植抗體的抗原結合活性低于非人類動物的原始抗體(Bio/Technology，9，266-271(1991))。對于其原因，據認為，在非人類動物抗體的原始VH和VL中，不僅CDR而且FR的一些氨基酸殘基都直接或者間接的參與到抗原結合活性中，由于CDR移植的結果，這樣的氨基酸殘基變成了不同于人抗體VH和VL中的FR的氨基酸殘基。為了解決這個問題，在人源化抗體中進行如下的鑒定在人抗體VH和VL中的FR氨基酸序列中，鑒定了與結合到抗原直接相關的氨基酸殘基，或者通過與CDR上的氨基酸殘基相互作用或者通過維持抗體的三維結構而與結合到抗原間接相關的氨基酸殘基，并且氨基酸殘基被修飾成在非人類動物原始抗體中發現的氨基酸殘基，從而增加了已降低的抗原結合活性(Bio/Technology，9，266-271(1991))。在制備人源化抗體的過程中，如何有效地識別FR中的與抗原結合活性相關的氨基酸殘基最為重要，所以構建抗體的三維結構并通過X-線結晶學(Journal of MolecularBiology，112，535-542(1977))、計算機建模(Protein Engineering，7，1501-1507(1994))等進行分析。盡管抗體三維結構的信息已經為制備人源化抗體提供了許多有益的信息，但是迄今為止仍沒有建立制備可用于任何抗體的人源化抗體的方法。所以，目前需要進行各種嘗試，例如，為每個抗體制備幾種修飾的抗體并檢驗與每個抗原結合活性的相互關系。
通過使用用于修飾的合成DNA進行上述3(4)中提及的PCR法來完成對人抗體VH和VL中的FR氨基酸殘基的修飾。對于PCR后的擴增產物，其核苷酸序列通過上述3(2)提及的方法進行測定，從而證實已經進行了所需的修飾。
(6)構建人源化抗體表達載體將在上述3(4)和(5)中構建的編碼人源化抗體VH和VL的cDNA克隆到在上述3(1)中提及的表達人源化抗體的載體中編碼人抗體CH和CL的基因上游，從而構建人源化抗體表達載體。
例如，在用于構建上述3(4)和(5)中的人源化抗體VH和VL的合成DNA中，在位于兩端的合成DNA的5’-末端引入適當的限制性內切酶的識別序列，從而它們被克隆到在上述3(1)中提及的表達人源化抗體的載體中編碼人抗體CH和CL的基因上游，以此方式它們可以適當的形式進行表達。
(7)人嵌合抗體和人源化抗體的短暫表達為了有效評估制備的各種人嵌合抗體和人源化抗體的抗原結合活性，可以使用上述3(3)和(6)中提到的人嵌合抗體表達載體和人源化抗體表達載體或者其修飾的表達載體進行人嵌合抗體和人源化抗體的短暫表達。對于導入表達載體的宿主細胞，可以使用任何細胞，只要它是能表達人嵌合抗體和人源化抗體的宿主細胞。通常，考慮到其高表達量，使用COS-7細胞(ATCC CRL 1651)(Methods in Nucleic AcidsResearch，CRC Press，283(1991))。將表達載體導入COS-7細胞的方法是DEAE-葡聚糖法(Methods in Nucleic Acids Research，CRC Press，283(1991))、脂質轉染法(lipofection)(Proceedings of the NationalAcademy of Sciences of the United State of America，84，7413-7417(1987))等。
導入表達載體后，在培養上清液中表達的人嵌合抗體和人源化抗體的量以及抗原結合活性可以通過例如ELISA方法(AntibodiesALaboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，Chapter14(1988)；Monoclonal AntibodiesPrinciples and Practice，Academic PressLimited(1996))進行測定。
(8)人嵌合抗體和人源化抗體的穩定表達可以通過將上述3(3)和(6)中提到的人嵌合抗體表達載體和人源化抗體表達載體導入到適當的宿主細胞中獲得穩定表達人嵌合抗體和人源化抗體的轉化細胞。向宿主細胞導入表達載體的方法是電穿孔法(Cytotechnology，3，133-140(1990))等。對于導入人嵌合抗體表達載體和人源化抗體表達載體的宿主細胞，可以使用任何細胞，只要它是能表達人嵌合抗體和人源化抗體的宿主細胞。其實例包括小鼠SP2/0-Ag 14細胞(ATCC CRL 1581)、小鼠P3X63-Ag8.653細胞(ATCCCRL1580)、二氫葉酸還原酶基因(下文稱為dhfr)缺陷性CHO細胞(Proceedings of the National Academy of Sciences of the United State ofAmerica，77，4216-4220(1980))、大鼠YB2/3HL.P2.G11.16Ag.20細胞(ATCC CRL1662；下文稱為YB2/0細胞)。
導入表達載體后，能夠穩定表達人嵌合抗體和人源化抗體的轉化株可根據日本已公開未審查的專利申請第257891/90號中公開的方法，通過在用于動物細胞培養的含有如G418硫酸鹽(下文稱為G418)的試劑的培養基中培養而進行選擇。對于用于培養動物細胞的培養基，可以使用RPMI 1640培養基(Nissui Seiyaku制造)、GIT培養基(NipponSeiyaku制造)、EX-CELL 302培養基(JRH制造)、IMDM(Gibco BRL制造)、Hybridoma-SFM(Gibco BRL制造)、通過添加各種添加劑如FBS到其中而獲得的培養基等。當所得的轉化細胞在培養基中培養時，人嵌合抗體和人源化抗體可以表達并積蓄在培養上清液中。在培養上清液中表達的人嵌合抗體和人源化抗體的量以及抗原結合活性可以通過ELISA測定。而且，在轉化細胞中，表達的人嵌合抗體和人源化抗體的量可以根據日本已公開未審查的專利申請第257891/90號中公開的方法，通過使用dhfr系統或類似系統而得到增加。
可以通過使用蛋白A柱將人嵌合抗體和人源化抗體從轉化細胞的培養上清液中純化(AntibodiesA Laboratory Manual，Cold Spring HarborLaboratory，Chapter 8(1988)；Monoclonal AntibodiesPrinciples andPractice，Academic Press Limited(1996))。除此之外，還可以使用通常用于純化蛋白質的純化方法。例如，可以聯合使用凝膠過濾、離子交換色譜法以及超濾法進行純化。可以通過聚丙烯酰胺凝膠電泳(下文稱為PAGE；Nature，227，680-685(1970))、蛋白質印跡法(westernblotting)(AntibodiesA Laboratory Manual，Cold Spring HarborLaboratory，Chapter12(1988)；Monoclonal AntibodiesPrinciples andPractice，Academic Press Limited(1996))等方法測定純化的人嵌合抗體和人源化抗體的H鏈和L鏈的分子量或者整個抗體分子的分子量。
(9)人嵌合抗體和人源化抗體的抗原結合活性評價人嵌合抗體和人源化抗體的抗原結合活性可以通過上述ELISA方法進行測定。
4.抗體片段的制備抗體片段可以從上述1和3所述抗體，通過基因工程技術或蛋白質化學技術來進行制備。
基因工程技術的實例包括這樣的方法，其中構建了編碼所需抗體片段的基因，并且利用合適的宿主(如動物細胞、植物細胞、昆蟲細胞、大腸桿菌或類似宿主)進行表達和純化。
蛋白質化學技術的實例包括利用胃蛋白酶和木瓜蛋白酶等的蛋白酶的位點特異性切斷的方法或純化。
下面對生產作為抗體片段的Fab、F(ab’)2、Fab’、scFv、雙特異抗體、dsFv或包括CDR的肽的方法進行詳細描述。
(1)Fab的制備在蛋白質化學技術中通過用蛋白酶，木瓜蛋白酶處理IgG來制備Fab。如果原始抗體是與蛋白質A具有結合特性的IgG亞型，在用木瓜蛋白酶處理之后，將其通過蛋白質A柱有可能從IgG分子和Fc片段中分離回收到均一的Fab(Monoclonal AntibodiesPrinciples and Practice，third edition(1995))。在IgG亞型與蛋白質A沒有結合特性的情況下，通過離子交換色譜，在用低鹽濃度洗脫的餾分中可回收到Fab(Monoclonal AntibodiesPrinciples and Practice，third edition(1995))。
Fab還可以通過基因工程技術來進行制備，在許多情況下使用大腸桿菌或使用昆蟲細胞、動物細胞等。例如，在上述3(2)、3(4)和3(5)中所述的編碼抗體V區的DNA被克隆至用于表達Fab的載體上，從而可制成Fab表達載體。對于用于表達Fab的載體，可以使用任意載體，只要Fab的DNA可以插入和進行表達即可。實例包括pIT106(Science，240，1041-1043(1988))等。該Fab表達載體被導入進合適的大腸桿菌中，從而可形成Fab并且Fab積聚在包含體或周質中。從包含體中，通過通常用于蛋白質的重折疊方法可獲得活性Fab，并且當在周質中表達時，活性Fab泄漏至培養上清液中。在重折疊之后或從培養上清液中，使用與抗原結合的柱可純化得到均一的Fab(Antibody Engineering，APractical Guide，W.H.Freeman and Company(1992))。
(2)F(ab’)2的制備在蛋白質化學技術中，通過用蛋白酶，胃蛋白酶對IgG進行處理可以制備F(ab’)2。在用胃蛋白酶處理之后，通過與Fab相同的純化操作來回收均一的F(ab’)2(Monoclonal AntibodiesPrinciples and Practice，third edition，Academic Press(1995))。F(ab’)2還可以通過以下方法來制備將下列4(3)中所述的Fab’用馬來酰亞胺，例如o-PDM或雙馬來酰亞胺己烷處理以形成硫醚鍵的方法，或者用DTNB[5，5’-二硫基雙(2-硝基苯甲酸)]來處理以形成S-S鍵的方法(Antibody Engineering，APractical Approach，IRL Press(1996))。
(3)Fab’的制備Fab’可通過用如二硫蘇糖醇的還原劑處理上述4(2)所述的F(ab’)2來進行制備。在基因工程技術中Fab’可在多數情況下使用大腸桿菌或者使用昆蟲細胞、動物細胞等來進行制備。例如，在上面3(2)、3(4)和3(5)所述的編碼抗體V區的DNA被克隆至用于表達Fab’的載體中，從而制成Fab’表達載體。對于用于表達Fab’的載體，可以使用任意載體，只要Fab’的DNA可以被整合和表達。其實例包括pAK19(Bio/Technologhy，10，163-167(1992))等。Fab’表達載體被引入適當的大腸桿菌中，從而在包含體或周質中形成并積聚Fab’。從包含體中，通過通常用于蛋白質的重折疊方法可以獲得活性Fab’，并且當Fab’在周質中表達時，通過例如通過溶菌酶、滲透壓休克和聲裂法和類似方法的部分消化處理使細胞破裂，可對活性Fab’進行細胞外回收。在重折疊之后或從破裂細胞溶液中，使用蛋白質G柱等可以純化到均一的Fab’(Antibody Engineering，A Practical Approach，IRL Press(1996))。
(3)scFv的制備通過基因工程技術，可使用噬菌體或大腸桿菌或使用昆蟲細胞或動物細胞來制備scFv。例如，在上文3(2)、3(4)和3(5)所述的編碼抗體V區的DNA被克隆至用于表達scFv的載體，從而制成scFv表達載體。對于用于表達scFv的載體，可以使用任意載體，只要能夠插入和表達scFv的DNA。其實例包括pCANTAB5E(Pharmacia制造)、pHFA(HumanAntibodies & Hybridomas，5，48-56(1994))等。當scFv表達抗體被引入適當的大腸桿菌中，并且感染輔助噬菌體，可以獲得以與噬菌體表面蛋白融合的形式在噬菌體表面上表達scFv的噬菌體。同樣，scFv可以在被導入scFv表達載體的大腸桿菌的周質或包含體中形成并積聚。從包含體中，通過通常用于蛋白質的重折疊方法可以獲得活性Fab’，并且當Fab’在周質中表達時，通過例如通過溶菌酶、滲透壓休克和聲裂法和類似方法的部分消化處理使細胞破裂，可以對活性Fab’進行細胞外回收。在重折疊之后或從破裂細胞溶液中，使用蛋白質G柱等可以純化到均一的Fab’(Antibody Engineering，A Practical Approach，IRLPress(1996))。
(5)雙特異抗體的制備在基因工程技術中，雙特異抗體在許多情況下可以使用大腸桿菌制備或使用昆蟲細胞、動物細胞等來制備。例如，制備其中通過8個或以下的氨基酸殘基編碼的連接子將上面3(2)、3(4)和3(5)所述的抗體的VH和VL連接在一起的DNA，并將其可克隆至用于表達雙特異抗體的載體內，從而制成雙特異抗體表達載體。對于用于表達雙特異抗體的載體，可以使用任意載體，只要雙特異抗體的DNA能夠被整合和表達。其實例包括pCANTAB5E(Pharmacia制造)、pHFA(HumanAntibodies & Hybridomas，5，48-56(1994))等。雙特異抗體可以在導入了scFv表達載體的大腸桿菌的周質或包含體中形成并積聚。從包含體中，通過通常用于蛋白質的重折疊方法可以獲得活性雙特異抗體，并且當雙特異抗體在周質中表達時，通過例如通過溶菌酶、滲透壓休克和聲裂法等方法的部分消化處理使細胞破裂，可以對活性雙特異抗體進行細胞外回收。在重折疊之后或從破裂細胞溶液中，使用陰離子交換色譜等柱等可以純化到均一的雙特異抗體(Antibody Engineering，APractical Approach，IRL Press(1996))。
(6)dsFv的制備在基因工程技術中，dsFv在許多情況下可以使用大腸桿菌制備或使用昆蟲細胞、動物細胞等來制備。首先，將突變引入上文3(2)、3(4)和3(5)所述的編碼抗體VH和VL的DNA的適當位置中，制成其中被編碼的氨基酸殘基被半胱氨酸取代的DNA。每一種如此制備的DNA被克隆至用于表達dsFv的載體中，從而制成VH和VL的表達載體。對于用于表達dsFv的載體，可以使用任意載體，只要dsFv的DNA能夠被整合和表達。其實例包括pULI9(Protein Engineering，7，697-704(1994))等。VH和VL的表達載體被引入適當的大腸桿菌中，dsFv在包含體或周質中形成并聚集。VH和VL可以從包含體或周質中獲得，混合并進行通常用于蛋白質的重折疊方法，從而獲得活性dsFv。在重折疊之后，通過離子交換色譜、凝膠過濾法等進行進一步純化(Protein Engineering，7，697-704(1994))。
(7)包括CDR的肽的制備包括CDR的肽可以通過化學合成法，如Fmoc法或tBoc法來制備。而且，制備編碼包括CDR的肽的DNA，并將所得的DNA克隆至適當的載體中以進行表達，從而制成包括CDR的肽的表達載體。對于用于表達的載體，可以使用任意載體，只要編碼包括CDR的肽的DNA可以被插入和表達。其實例包括pLEX(Invitrogen制造)、pAX4a+(Invitrogen制造)等。該表達載體被引入適當的大腸桿菌中，并在包含體或周質中形成并積聚。包括CDR的肽可以從包含體或周質中獲得，并通過離子交換色譜、凝膠過濾法等進行純化(ProteinEngineering，7，697-704(1994))。
(8)抗體片段和抗原的結合活性的評價抗體片段和抗原的結合活性的評價使用上文1(7)所述的ELISA來進行。
5.本發明的治療藥物用于本發明的治療子宮內膜異位癥的藥物可以為任意藥劑，只要其包括IL-5拮抗劑作為活性成分，但通常優選將其與一種或多種藥學可接受的載體混合，根據制藥學領域內已知的任意方法制成藥物制劑的形式。優選，使用將其溶解在如水的水性載體中，或鹽、甘氨酸、葡萄糖或人白蛋白的水溶液中制成的無菌溶液。還可以添加藥學可接受的添加劑，如緩沖劑或等滲劑，使制劑溶液更加類似于生理條件，其實例包括乙酸鈉、氯化鈉、乳酸鈉、氯化鉀、檸檬酸鈉等。也可通過冷凍干燥來進行保存，并且在實際使用中，可以將其溶解在適當的溶劑中來使用。
對于本發明的治療藥物的給藥途徑，優選采用治療的最有效的途徑。其實例包括口服給藥和胃腸外給藥，如經口、氣管支氣管、直腸內、皮下、肌內內和靜脈內，其中，優選靜脈內給藥。
適于口服給藥的制劑的實例包括乳劑、糖漿劑、膠囊、片劑、稀釋粉末、顆粒等。液體制劑如乳劑和糖漿劑可以使用水，糖類如蔗糖、山梨醇和果糖，乙二醇類如聚乙二醇和丙二醇，油類如芝麻油、橄欖油和大豆油，防腐劑如p-羥基苯甲酸酯，香料例如草莓香料和薄荷香料等作為添加劑。膠囊、片劑、稀釋粉末、顆粒等可以使用以下物質來制備，賦形劑如乳糖、葡萄糖、蔗糖和甘露醇，崩解劑如淀粉和海藻酸鈉，潤滑劑如硬脂酸鎂和滑石、粘合劑如聚乙烯醇、羥丙基纖維素和明膠，表面活性劑如脂肪酸酯，增塑劑如甘油，作為添加劑。
適于胃腸外給藥的制劑的實例包括注射劑、栓劑、氣霧劑等。例如，注射劑使用包括鹽溶液、葡萄糖溶液或其兩者的混合物等的載體來制備。栓劑使用載體如可可脂、氫化脂或羧酸來制備。氣霧劑使用這樣的拮抗劑來制備，或者使用例如不會刺激要給藥的人體的口腔和氣管粘膜，并且將拮抗劑分散成為微細顆粒使其很容易被吸收的載體來進行制備。載體的具體實例包括乳糖、甘油等。根據拮抗劑和使用的載體的性質，可以制備氣霧劑、干粉等。此外，甚至在胃腸外制劑中，可以添加在口服制劑中作為添加劑所舉例的成分。
本發明的治療藥物的給藥劑量或次數根據所需的治療效果、給藥方法、治療周期、年齡、體重等進行變化，通常成人每天10μg/kg至10mg/kg/。
下面用實施例來描述本發明。
實施例1抗-IL-5受體抗體和抗-IL-5抗體對大鼠子宮內膜異位癥自體移植模型的抑制活性對于抗-IL-5受體抗體和抗-IL-5抗體對大鼠子宮內膜異位癥自體移植模型的抑制活性，進行下列的試驗。
關于此方法，對已知的方法[Fertility and Sterility，44，684-694(1985)]進行改進并使用。
購買不小于8周齡的雌性SD大鼠(Nippon Charles River)，這些大鼠被認為處于性成熟期，每天用大鼠陰道阻抗檢測器測定它們的性周期(Muromachi Kikaisha制造的MK-10B)。在觀察了兩次或者更多次的性周期為4到5天的大鼠中，選擇那些處于發情前期的大鼠進行如下所述的子宮內膜組織自體移植。
在靜脈給予大鼠試驗藥物之后，大鼠腹腔內給予戊巴比妥(TakedaSchering Plough Animal Health制造的Somnopentyl)全麻，腹部剃毛并沿中線切開約6cm。在子宮的兩角中，將距右側子宮根部約1cm的上方區域以及距卵巢約2cm的下方區域結扎，切開位于兩者之間的子宮。切開的子宮(管狀)縱向打開，用含有青霉素-鏈霉素(Invitrogen制造)的Dulbecco’s Modified Eagle培養基(Invitrogen制造)沖洗，露出一片粘膜。從該片上，制備約2mm見方的子宮內膜片。將這樣制成的子宮內膜片用帶有無菌縫線的縫合針(外科手術用的稍微彎曲的12號針-6-0號黑尼龍線，Natsume Seisakusho制造)自體移植到右側和左側腹膜。在那段時間，進行自體移植使子宮內膜表面與腹膜接觸。作為對照，同時從同一大鼠上切下與子宮內膜片同樣大小的脂肪組織自體移植到腹膜。最后，移植的部位和子宮切除的部位用含有小奴霉素(Sagamicin注射劑，Kyowa Hakko Kogyo制造)的生理鹽水沖洗，并立即將腹膜和皮膚用帶有無菌縫線的縫合針小心縫合。
在自體移植1周后，乙醚麻醉下放血處死大鼠，打開腹腔，肉眼評估子宮內膜病變(測量移植片的大小)。對于移植片的大小，使用模具千分卡尺(die micrometer caliper)(最小刻度0.5mm)測量縱向和橫向的直徑。5只大鼠組成一組進行試驗。如果需要，根據常規的方法制作移植部位的病理標本并進行組織病理學分析。
作為試驗藥物，使用1mg/kg的抗鼠IL-5受體抗體和抗鼠IL-5抗體(International Immunology，3(2)，135-9(1991))，同時使用1mg/kg的大鼠IgG抗體(ICN制造)作為對照抗體。所有抗體都用無菌磷酸鹽緩沖液(ICN制造)稀釋后使用。
移植片的大小的結果列于表1中。對于移植片的大小，使用縱向直接與橫向直接相乘計算而得到的值，并顯示了右側和左側移植片的平均大小。
如表1所示，通過給予抗-IL-5抗體和抗-IL-5受體抗體，移植1周后增加的移植片的大小被減小了(抑制率抗-IL-5抗體14％，抗-IL-5受體抗體15％)。
表1

實施例2抗-IL-5抗體對大鼠子宮內膜異位癥自體移植模型中粘連的抑制活性。
為了證實抗-IL-5受體抗體抑制子宮內膜粘連，使用大鼠子宮內膜異位癥自體移植模型進行下列試驗。根據實施例1中的方法進行實驗。
購買不小于8周齡的雌性SD大鼠(Nippon Charles River制造)，這些大鼠通常被認為處于性成熟期，每天用大鼠陰道阻抗測試器(Muromachi Kikaisha制造的MK-10B)測定它們的性周期。在觀察了兩次或者更多次的性周期為4到5天的大鼠中，選擇那些處于發情前期的大鼠進行如下所述的子宮內膜組織自體移植。
在靜脈給予大鼠試驗藥物之后，大鼠腹腔內給予戊巴比妥(TakedaSchering Plough Animal Health制造的SomNOpentyl)全麻，腹部剃毛并沿中線切開約6cm。在子宮的兩角中，將距右側子宮根部約1cm的上方區域以及距卵巢約2cm的下方區域結扎，切開位于兩者之間的子宮。切開的子宮(管狀)縱向打開，用含有青霉素-鏈霉素(Invitrogen制造)的Dulbecco’s Modified Eagle培養基(Invitrogen制造)沖洗，露出一片粘膜。從該片粘膜上，制備約2mm見方的子宮內膜片。將這樣制成的子宮內膜片用帶有無菌縫線的縫合針(外科手術用的稍微彎曲的12號針-6-0號黑尼龍線，Natsume Seisakusho制造)自體移植到右側和左側腹膜。在那段時間，進行自體移植使子宮內膜表面與腹膜接觸。作為對照，同時從同一大鼠上切下與子宮內膜片同樣大小的脂肪組織自體移植到腹膜。最后，移植的部位和子宮切除的部位用含有小奴霉素(Sagamicin注射劑，Kyowa Hakko Kogyo制造)的生理鹽水沖洗，并立即將腹膜和皮膚用帶有無菌縫線的縫合針小心縫合。
在自體移植1周后，乙醚麻醉下放血處死大鼠，打開腹腔，肉眼評估子宮內膜病變(粘連分數)。根據下列標準對病變進行評分。
沒有觀察到粘連；0分觀察到粘連，但很輕微；1分盡管觀察到明顯的粘連，但它是表皮脫落樣的；2分有明顯粘連并且不是表皮脫落樣的；3分由5只大鼠組成一組進行試驗。如果需要，根據常規的方法制作移植部位的病理標本并進行組織病理學分析。
作為試驗藥物，使用抗鼠IL-5受體抗體(International ImmuNOlogy，3(2)，135-9(1991))，同時使用大鼠IgG抗體(ICN制造)作為對照抗體。所有抗體都用無菌磷酸鹽緩沖液(ICN制造)稀釋后使用。
病變部位的粘連分數的結果列于表2。對于粘連分數，以點值表示，并顯示了右側和左側移植片的平均粘連分數。
表2


如表2所示，在大鼠子宮內膜異位癥自體移植模型上，在臨床上患子宮內膜異位癥的患者的病變部位中所觀察到的粘連可以清楚地觀察到。與這樣的粘連分數相反，給予抗-IL-5受體抗體的組中有抑制的趨勢(抑制率29％)。另外，當移植脂肪組織作為對照時，幾乎觀察不到粘連。
實施例3抗小鼠IL-5受體抗體對小鼠子宮內膜異位癥模型中子宮內膜病變形成的抑制活性為了檢測抗-IL-5受體抗體對子宮內膜異位癥的作用，進行了下列實驗。
對于此方法，對已知的方法[Human Reproduction，14，2944-2950(1999)]進行改進并使用。
購買不小于8周的雌性Balb/c小鼠(Nippon Charles River)用于本實驗，這些小鼠被認為處于性成熟期。在購買后適應1周后，將所有小鼠的右側和左側卵巢切除使得性激素水平一致，然后給予外源性的雌激素。腹腔內給予50mg戊巴比妥(Takeda Schering Plough Animal Health制造的Somnopentyl)全麻，沿中線切開小鼠背部皮膚約1cm并在右側和左側卵巢位置的腹膜上作切口(約3mm)。當從切口切除兩側卵巢之后，背部皮膚迅速縫合并放回飼養籠內。之后，將100μg/kg的雌激素(ProgyNOnDepot 10mg，Nippon Schering制造，戊酸雌二醇酯注射液)注入左后爪肌肉內。如此處理的結果是，證實子宮膨大到其重量幾乎與發情前期小鼠子宮的重量相同，發情前期是小鼠性周期中的高歌高雌激素周期，每天每4個小時就可觀察到。
然后，在卵巢切除1周后，將所有小鼠分為供體小鼠和受體小鼠，構成比為1∶2，將通過切除供體小鼠的子宮制備的子宮內膜片接種到受體小鼠的腹腔中。從而，從放血處死的供體小鼠切下的右側和左側子宮上去除周圍的脂肪組織和子宮頸，用外科手術小剪刀細心切下含有子宮內膜的子宮體制成片。將子宮內膜片懸浮在含有抗生素的無菌的HBSS(Hank’s平衡鹽溶液，Sigma制造)中并將所有供體小鼠的子宮內膜片集中在一起。將受體小鼠用帶有19G注射針頭的注射器(Thermo制造)以40mg/kg戊巴比妥全麻，將子宮內膜片懸浮液(0.8mL；相當于約50mg子宮內膜片)經腹腔內給予受體小鼠進行接種。向注射器內注入子宮內膜片懸浮液，通過充分地攪拌懸浮液使液體不會變得不均勻而進行給藥。然后，將100μg/kg的雌激素和作為雌激素溶劑的芝麻油通過肌肉給藥，每周一次分別給予陽性對照組和藥物評價組以及陰性對照組。
在接種子宮內膜片3周后，放血處死大鼠，打開腹腔，肉眼評估子宮內膜病變(測量成形的囊腫的大小)。對于病變的大小，使用模具千分卡尺(最小刻度0.5mm)測量縱向和橫向的直徑，通過橫徑乘以縱徑計算得到的面積進行評估。當大量病變形成時，它們的總和當作總面積，由10只小鼠組成一組進行試驗。如果需要，根據常規的方法制作移植部位的病理標本并進行組織病理學分析。
作為試驗藥物，使用抗小鼠IL-5受體抗體(InternationalImmunology，3(2)，135-9(1991)；10mg/kg，每周給藥1次)。在陽性對照組，大鼠IgG抗體(ICN制造；10mg/kg，每周給藥1次)作為對照抗體。所有抗體都用無菌的生理鹽水溶液(Otsuka Pharmaceutical制造)稀釋后使用。
病變大小的結果如圖1所示。
在子宮內膜片接種三周后，在陽性對照組中病變發生率為100％，但在陰性對照組，僅在一個小鼠上出現。所有成形的病變為沿著子宮內膜上皮細胞排列的囊腫，并通過組織病理學證實為子宮內膜病變。因此，本實驗模型被認為是可使用的模型，能反映以雌激素依賴方式生長的子宮內膜炎。
在本模型中，抗小鼠IL-5受體抗體與如圖1所示陽性對照組相比表現出顯著的抑制活性。另外，當同樣重量的小腸粘膜片代替子宮內膜片接種時，即使給予雌激素也根本形成不了病變。
實施例4抗小鼠IL-5受體抗體對小鼠子宮內膜異位癥模型中子宮內膜病變形成的抑制活性根據實施例3的方法測定抗-IL-5受體抗體對子宮內膜異位癥的效應。
實驗方法與實施例3中的相同，除了用抗小鼠IL-5抗體(International Immunology，3(2)，135-9(1991)；1和10mg/kg，每周給藥1次)作為試驗藥物來替換抗小鼠IL-5受體抗體。
病變大小的結果如圖2所示。
與陽性對照組相比，給予10mg/kg的組中抗小鼠IL-5抗體顯示出了明顯的抑制活性。
工業應用性本發明提供了一種包括白細胞介素-5拮抗劑作為活性成分的治療子宮內膜異位癥的藥物。
序列列表的自由正文SEQ ID NO9-用于說明合成序列抗體重鏈可變區域氨基酸序列SEQ ID NO10-用于說明合成序列抗體重鏈可變區域氨基酸序列SEQ ID NO11-用于說明合成序列抗體重鏈可變區域氨基酸序列SEQ ID NO12-用于說明合成序列抗體重鏈可變區域氨基酸序列SEQ ID NO13-用于說明合成序列抗體重鏈可變區域氨基酸序列SEQ ID NO14-用于說明合成序列抗體重鏈可變區域氨基酸序列SEQ ID NO15-用于說明合成序列抗體重鏈可變區域氨基酸序列SEQ ID NO16-用于說明合成序列抗體重鏈可變區域氨基酸序列SEQ ID NO17-用于說明合成序列抗體重鏈可變區域氨基酸序列序列表<110>協和發酵工業株式會社<120>治療子宮內膜異位癥的藥物<130>1726<150>JP2004-314031<151>2004-10-28<150>JP2005-169027<151>2005-06-09<160>29<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>5<212>蛋白質<213>小家鼠<400>1Ser Tyr Val Ile His1 5<210>2<211>17<212>PRT<213>小家鼠<400>2Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Thr Lys Tyr Asn Glu Arg Phe Lys1 5 10 15Gly<210>3<211>12<212>蛋白質<213>小家鼠<400>3Glu Gly Ile Arg Tyr Tyr Gly Leu Leu Gly Asp Tyr1 5 10<210>4<211>11<212>蛋白質<213>小家鼠<400>4Gly Thr Ser Glu Asp Ile Ile Asn Tyr Leu Asn1 5 10<210>5<211>7<212>蛋白質<213>小家鼠<400>5His Thr Ser Arg Leu Gln Ser1 5<210>6<211>9<212>蛋白質
<213>小家鼠<400>6Gln Gln Gly Tyr Thr Leu Pro Tyr Thr1 5<210>7<211>140<212>蛋白質<213>小家鼠<400>7Met Glu Trp Ser Trp Ile Phe Leu Phe Leu Leu Ser Gly Thr Ala Gly1 5 10 15Val His Ser Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys20 25 30Pro Gly Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe35 40 45Thr Ser Tyr Val Ile His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu50 55 60Ala Trp Ile Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Thr Lys Tyr Asn65 70 75 80Glu Arg Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ser Asp Arg Ser Ser Ser85 90 95Thr Val Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu ThrSer Glu Asp Ser Ala Val100 105110Tyr Leu Cys Gly Arg Glu Gly Ile Arg Tyr Tyr Gly Leu Leu Gly Asp115 120 125Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser130 135<210>8<211>127<212>蛋白質<213>小家鼠<400>8Met Met Ser Ser Ala Gln Phe Leu Gly Leu Leu Leu Leu Cys Phe Gln1 5 10 15Asp Ile Arg Cys Asp Ile Gln Met Thr Gln Ala Thr Ser Ser Leu Ser20 25 30Ala Ser Leu Gly Asp Arg Val Thr Ile Gly Cys Gly Thr Ser Glu Asp35 40 45Ile Ile Asn Tyr Leu Asn Trp Tyr Arg Lys Lys Pro Asp Gly Thr Mal50 55 60Glu Leu Leu Ile Tyr His Thr Ser Arg Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser65 70 75 80Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser85 90 95Asp Leu Glu Gln Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Tyr100 105 110Thr Leu Pro Tyr Thr Val Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys115 120 125<210>9<211>121<212>蛋白質<213>人工序列
<220>
<223>合成肽<400>9Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala1 5 10 15Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr20 25 30Val Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met35 40 45Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Thr Lys Tyr Asn Glu Arg Phe50 55 60Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr65 70 75 80Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp ThrAla Val Tyr Tyr Cys85 90 95Ala Arg Glu Gly Ile Arg Tyr Tyr Gly Leu Leu Gly Asp Tyr Trp Gly100 105 110Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser115 120<210>10<211>107<212>蛋白質<213>人工序列<220>
<223>合成肽<400>10Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly1 5 10 15Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gly Thr Ser Glu Asp Ile Ile Asn Tyr20 25 30Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile35 40 45Tyr His Thr Ser Arg Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly50 55 60Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro65 70 75 80Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Tyr Thr Leu Pro Tyr85 90 95Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys100 105<210>11<211>121<212>蛋白質<213>人工序列<220>
<223>合成肽<400>11Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala1 5 10 15Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr20 25 30
Val Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro GlyGln Gly Leu Glu Trp Met35 40 45Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Thr Lys Tyr Asn Glu Arg Phe50 55 60Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr65 70 75 80Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Leu Cys85 90 95Gly Arg Glu Gly Ile Arg Tyr Tyr Gly Leu Leu Gly Asp Tyr Trp Gly100 105 110Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser115 120<210>12<211>121<212>蛋白質<213>人工序列<220>
<223>合成肽<400>12Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala1 5 10 15Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr20 25 30Val Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Ala Trp Met35 40 45Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Thr Lys Tyr Asn Glu Arg Phe50 55 60Lys Gly Arg Val Thr Ile ThrAla Asp Arg Ser Thr Ser Thr Ala Tyr65 70 75 80Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Leu Cys85 90 95Gly Arg Glu Gly Ile Arg Tyr Tyr Gly Leu Leu Gly Asp Tyr Trp Gly100 105 110Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser115 120<210>13<211>121<212>蛋白質<213>人工序列<220>
<223>合成肽<400>13Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala1 5 10 15Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr20 25 30Val Ile His Trp Val Arg Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Ala Trp Met35 40 45Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Thr Lys Tyr Asn Glu Arg Phe50 55 60Lys Gly Lys Val Thr Ile Thr Ser Asp Arg Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Leu Cys85 90 95GlyArg Glu Gly Ile Arg Tyr Tyr Gly Leu Leu Gly Asp Tyr Trp Gly100 105 110Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser115 120<210>14<211>107<212>蛋白質<213>人工序列<220>
<223>合成肽<400>14Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly1 5 10 15Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gly Thr Ser Glu Asp Ile Ile Asn Tyr20 25 30Leu Asn Trp Tyr Arg Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Glu Leu Leu Ile35 40 45Tyr His Thr Ser Arg Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly50 55 60Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro65 70 75 80Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Tyr Thr Leu Pro Tyr85 90 95Thr Val Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys100 105<210>15<211>107<212>蛋白質<213>人工序列<220>
<223>合成肽<400>15Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala SerVal Gly1 5 10 15Asp Arg Val Thr Ile Gly Cys Gly Thr Ser Glu Asp Ile Ile Asn Tyr20 25 30Leu Asn Trp Tyr Arg Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Glu Leu Leu Ile35 40 45Tyr His ThrSer Arg Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly50 55 60Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asp Leu Gln Pro65 70 75 80Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Tyr Thr Leu Pro Tyr85 90 95Thr Val Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys100 105<210>16
<211>107<212>蛋白質<213>人工序列<220>
<223>合成肽<400>16Asp Ile Gln Met Thr Gln Ala Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly1 5 10 15Asp Arg Val Thr Ile Gly Cys Gly Thr Ser Glu Asp Ile Ile Asn Tyr20 25 30Leu Asn Trp Tyr Arg Lys Lys Pro Gly LysAla Pro Glu Leu Leu Ile35 40 45Tyr His Thr SerArg Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly50 55 60Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asp Leu Gln Pro65 70 75 80Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Tyr Thr Leu Pro Tyr85 90 95Thr Val Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys100 105<210>17<211>107<212>蛋白質<213>人工序列<220>
<223>合成肽<400>17Asp Ile Gln Met Thr Gln Ala Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly1 5 10 15Asp Arg Val Thr Ile Gly Cys Gly Thr Ser Glu Asp Ile Ile Asn Tyr20 25 30Leu Asn Trp Tyr Arg Lys Lys Pro Gly Lys Ala Val Glu Leu Leu Ile35 40 45Tyr His Thr SerArg Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly50 55 60Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Asp Leu Gln Pro65 70 75 80Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Tyr Thr Leu Pro Tyr85 90 95Thr Val Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys100 105<210>18<211>5<212>蛋白質<213>小家鼠<400>18Asp Thr Tyr Met His1 5<210>19<211>17<212>蛋白質<213>小家鼠
<400>19Arg Ile Asp Pro Ala Asn Gly Asn Thr Lys Ser Asp Pro Lys Phe Gln1 5 10 15Ala<210>20<211>9<212>蛋白質<213>小家鼠<400>20Gly Leu Arg Leu Arg Phe Phe Asp Tyr1 5<210>21<211>10<212>蛋白質<213>小家鼠<400>21Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met His1 5 10<210>22<211>7<212>蛋白質<213>小家鼠<400>22Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser1 5<210>23<211>10<212>蛋白質<213>小家鼠<400>23Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Pro Ile Thr1 5 10<210>24<211>5<212>蛋白質<213>小家鼠<400>24Asp Tyr Gly Met Ala1 5<210>25<211>17<212>蛋白質<213>小家鼠<400>25Ala Ile Ser Ser Gly Gly Ser Tyr Ile His Phe Pro Asp Ser Leu Lys1 5 10 15Gly<210>26<211>12<212>蛋白質<213>小家鼠
<400>26Arg Gly Phe Tyr Gly Asn Tyr Arg Ala Met Asp Tyr1 5 10<210>27<211>15<212>蛋白質<213>小家鼠<400>27Arg Ala Asn Glu Ser Val Asp His Asn Gly Val Asn Phe Met Asn1 5 10 15<210>28<211>7<212>蛋白質<213>小家鼠<400>28Ala Ala Ser Asn Gln Gly Ser1 5<210>29<211>9<212>蛋白質<213>小家鼠<400>29Gln Gln Ser Lys Asp Val Pro Trp Thr1 權利要求
1.一種治療子宮內膜異位癥的藥物，其特征在于所述的藥物包括白細胞介素-5拮抗劑作為活性成分。
2.根據權利要求1所述的藥物，其特征在于其中所述的白細胞介素-5拮抗劑是抑制白細胞介素-5與白細胞介素-5受體結合的抗體或其抗體片段。
3.根據權利要求2所述的藥物，其特征在于其中所述的抑制白細胞介素-5與白細胞介素-5受體結合的抗體是與白細胞介素-5結合的抗體。
4.根據權利要求3所述的藥物，其特征在于其中所述的白細胞介素-5是人白細胞介素-5。
5.根據權利要求2所述的藥物，其特征在于其中所述的抑制白細胞介素-5與白細胞介素-5受體結合的抗體是與白細胞介素-5受體結合的抗體。
6.根據權利要求5所述的藥物，其特征在于其中所述的白細胞介素-5受體是白細胞介素-5受體α鏈。
7.根據權利要求5或6所述的藥物，其特征在于其中所述的白細胞介素-5受體是人白細胞介素-5受體。
8.根據權利要求2到7任意一項所述的藥物，其特征在于其中所述的抗體是單克隆抗體。
9.根據權利要求8所述的藥物，其特征在于其中所述的單克隆抗體是基因重組抗體。
10.根據權利要求9所述的藥物，其特征在于其中所述的基因重組抗體是選自人嵌合抗體、人源化抗體和人抗體的基因重組抗體。
11.根據權利要求2到10任意一項所述的藥物，其特征在于其中所述的抗體片段是選自Fab、Fab’、F(ab’)2、單鏈抗體(scFv)、二聚可變區(雙特異抗體)、二硫化物穩定可變區(dsFv)以及包括CDR的肽的抗體片段。
12.根據權利要求1到11任意一項所述的白細胞介素-5拮抗劑在制備治療子宮內膜異位癥的藥物中的應用。
13.一種治療子宮內膜異位癥的方法，其特征在于所述的方法包括給予權利要求1到11任意一項所述的白細胞介素-5拮抗劑。
全文摘要
本發明提供了一種包括白細胞介素－5拮抗劑作為活性成分的用于治療子宮內膜異位癥的藥物。
文檔編號A61P15/08GK101090734SQ20058004120
公開日2007年12月19日 申請日期2005年10月28日 優先權日2004年10月28日
發明者大島悅男, 川崎博和, 木本直哉, 渡邊昭彥 申請人:協和發酵工業株式會社