專利名稱：一種用哺乳動物細胞高效分泌表達丙型肝炎病毒包膜蛋白e2的方法
技術領域：
本發明涉及生物醫藥工程技術領域，尤其涉及一種用哺乳動物細胞高效分泌表達丙型肝炎病毒(HCV)包膜蛋白E2的方法。
背景技術：
丙型肝炎病毒(HCV)是經血液傳播的急、慢性肝炎的主要致病因子之一，目前全球HCV感染者約有1.7億，60％以上的HCV感染會發展為慢性感染。HCV慢性感染與肝硬化、肝細胞癌具有高度相關性，并且還與淋巴瘤、冷球蛋白血癥等密切相關。雖然目前已經建立了且已商品化的HCV感染診斷方法，但應用最廣泛的血清學診斷方法，即酶聯免疫吸附試驗(ELISA)方法還有一定的漏檢率，需要增加一些有診斷意義的病毒抗原。此外，目前還沒有研制成功一種疫苗能有效預防HCV感染。
HCV包膜蛋白包括E1和E2兩種，其中E2介導HCV與靶細胞的結合，是涉及HCV感染性的最關鍵蛋白。有報道，在ELISA診斷試劑中加入E2合成肽能提高檢測的敏感性，減少漏檢，因此，有必要將該蛋白參入目前的基于HCV核心蛋白和非結構蛋白的ELISA檢測中。由于E2蛋白在HCV與靶細胞結合中的關鍵作用，因此，該蛋白可作為HCV疫苗的重要候選抗原。但是，只有哺乳動物細胞表達的具有高度糖基化以及天然空間構型的E2蛋白才具有與靶細胞結合的生物學功能以及天然的抗原性，而E2蛋白屬于低表達蛋白，用基因重組的方法獲得哺乳動物細胞表達的該蛋白具有相當技術難度。這也是目前在ELISA方法中未引入E2蛋白的主要原因，也是妨礙HCV疫苗研究的重要原因。
發明內容
本發明的目的在于提供一種用哺乳動物細胞高效分泌表達丙型肝炎病毒包膜蛋白E2的方法。
本發明提供了一種能用哺乳動物細胞高水平分泌表達HCV包膜E2蛋白的技術方法，首先構建了一種新型的哺乳動物細胞表達質粒載體，該質粒載體利用強的真核啟動子高水平調控HCV包膜E2基因的表達，而借助于內含子的剪切功能控制篩選用的標記基因(谷氨酰氨合成酶基因，GS)僅低水平表達。將該表達質粒轉染哺乳動物細胞，以甲硫酰硫酸胺(MSX)篩選穩定轉染的細胞克隆，因MSX為GS的高效抑制劑，故只有染色體中高拷貝整合質粒編碼基因的細胞才能存活，而存活的細胞能高水平表達質粒編碼的目的基因--HCV包膜E2基因。本發明中用目前最廣泛用于哺乳動物細胞基因重組蛋白工程的中國倉鼠卵巢細胞(CHO)為宿主細胞，以該質粒轉染CHO-K1細胞，構建成功穩定高水平分泌表達HCV包膜E2蛋白的細胞株，并建立了該細胞株的無血清懸浮培養方法，因培養液中不含有牛血清等蛋白成分，從而能以簡單的層析方法從培養液中純化得到重組HCV包膜E2蛋白。
本發明的具體內容如下1.HCV包膜E2蛋白胞外段基因的擴增根據1b基因型HCV包膜E2蛋白編碼基因的核苷酸序列設計、合成引物，以聚合酶鏈反應(PCR)擴增HCV包膜E2蛋白胞外段基因，插入T克隆載體，對E2胞外段基因進行DNA測序。
2.谷氨酰胺合成酶基因的克隆根據谷氨酰胺合成酶(GS)基因的序列，設計合成引物，以逆轉錄(RT)PCR從中國倉鼠卵巢細胞(CHO)克隆GS基因，插入T克隆載體，對GS基因進行DNA測序。
3.基于內含子剪切載體的構建將GS基因插入真核表達質粒載體pCI-neo(美國Promega產品)的內含子基因的剪切供體(SD)與剪切受體(SA)位點之間，而將HCV包膜E2蛋白基因置于GS基因內含子之3′端。
4.表達質粒轉染CHO細胞用脂質體將質粒轉染CHO細胞，檢測HCV包膜E2蛋白的表達。
5.穩定表達HCV包膜E2蛋白的CHO細胞株的構建以低濃度的GS抑制劑--甲硫酰硫酸胺(MSX)篩選穩定轉染的CHO-K1細胞克隆，再以濃度遞增的MSX加壓篩選高水平表達HCV包膜E2蛋白的CHO-K1細胞，然后逐漸以無血清培養液替代含小牛血清的培養液，使細胞完全適應于無血清培養生長。
6.重組HCV包膜E2蛋白的抗原性鑒定用單抗和多抗鑒定從細胞培養上清中的HCV包膜E2蛋白的抗原性。
本發明能批量制備具有HCV包膜蛋白天然生物學功能以及抗原性的重組HCV包膜E2蛋白，為HCV感染的血清學檢測試劑以及HCV疫苗的開發奠定了基礎，并可以為HCV分子病毒學研究提供重要材料。
圖1pCIDA-GS-E2-neo質粒的結構圖2Western blot分析胞漿內和分泌至培養上清中的E2蛋白(用羊抗E2多抗檢測)其中1，2pCIDA-GS-E2-neo轉染的CHO-K1細胞裂解液3pCIDA-GS-E2-neo轉染的CHO-K1細胞培養上清4pCIDA-GS-neo轉染的CHO-K1細胞裂解液圖3dot blot培養上清中的E2蛋白(用E2單抗檢測)其中1，2pCIDA-GS-neo轉染的CHO-K1細胞培養上清3，4pCIDA-GS-E2-neo轉染的CHO-K1細胞培養上清圖4分泌表達的HCV包膜E2蛋白的SDS-PAGE分析
具體實施例方式下面結合附圖和實施例對本發明作進一步描述。
實施例11.HCV包膜E2蛋白胞外段基因的擴增根據1b基因型HCV包膜E2蛋白編碼基因的核苷酸序列設計、合成引物，以聚合酶鏈反應(PCR)擴增HCV包膜E2蛋白胞外段基因。為了使表達產物便于純化，在E2胞外段基因的3′末端引入了編碼6個組氨酸殘基的核苷酸序列。PCR擴增的模板質粒pGEM-HCJ4含有1b型HCV基因全序列，為美國國立衛生研究院Yanagi M博士構建、提供(參見Virology.1998；244(1)161-72)。DNA擴增用試劑為美國Promega產品。
引物序列(下游引物E2R含SalI酶切位點)E2F5′-GAGACCCACACGACGGGGAG-3′E2R5′-GTCGACAACTCAGTGGTGGTGGTGGTGGTGTTCTGACCTATCCCTGTCC-3′在0.5毫升離心管建立以下反應體系質粒pGEM-HCJ4 10ng10×Pfu聚合酶反應緩沖液 5μl引物E2F(5mM)2μl引物E2R(5mM)2μldNTP(10mM) 1μlPfu聚合酶(3U/μl) 0.5μl補充雙蒸滅菌水至總反應體積50μl，用MJ PTC-100型PCR儀進行熱循環反應94℃變性2分鐘，94℃變性40秒，60℃退火40秒，72℃延伸1分鐘20秒，共進行30個循環，然后72℃延伸5分鐘，溫度降至4℃結束反應。反應產物進行瓊脂糖凝膠電泳，將目的條帶回收。
2.E2基因與人免疫球蛋白信號肽基因的拼接為了使重組HCV包膜E2蛋白能分泌表達，在該基因的5′末端引入人免疫球蛋白信號肽基因。
合成引物(上游引物ISF含NheI酶切位點)ISF5′-GCTAGCGCCACCATGGAGACCGACACCCTGCTGCTGTGGGTGCTGCTGCTGTGGGTGCC-3′ISR5′-CTCCCCGTCGTGTGGGTCTCGGCGTCGCCGGTGCTGCCGGGCACCCACAGCAGCAGC-3′在0.5毫升離心管建立以下反應體系10×Taqase反應緩沖液5μl引物ISF(5mM)2μl引物ISR(5mM)2μldNTP(10mM) 1μlTaqase聚合酶(5U/μl)0.2μl補充雙蒸滅菌水至總反應體積50μl，用MJ PTC-100型PCR儀進行熱循環反應94℃變性2分鐘，94℃變性20秒，60℃退火30秒，72℃延伸30秒，共進行30個循環，然后72℃延伸5分鐘，溫度降至4℃結束反應。
再進行拼接反應在0.5毫升離心管建立以下反應體系E2胞外段基因回收產物2μl人免疫球蛋白信號肽基因反應產物 5μl10×Pfu聚合酶反應緩沖液 5μl引物ISF(5mM)2μl引物E2R(5mM)2μldNTP(10mM) 1μlPfu聚合酶(3U/μl) 0.5μl補充雙蒸滅菌水至總反應體積50μl，用MJ PTC-100型PCR儀進行熱循環反應94℃變性2分鐘，94℃變性40秒，60℃退火40秒，72℃延伸1分鐘20秒，共進行30個循環，然后72℃延伸5分鐘，溫度降至4℃結束反應。然后向反應管中加入Taqase 0.5U，72℃反應20分鐘。反應產物進行瓊脂糖凝膠電泳，將目的條帶回收，與T載體pMD18T連接，連接反應體系如下在0.5毫升離心管建立以下反應體系回收的E2融合基因6.5μl5×T4 DNA連接酶緩沖液 2μlT載體pMD18T 0.5μlT4DNA連接酶(2U/μl) 1μl混勻，置于16℃水浴16小時，取5μl轉化感受態大腸桿菌DH5α，得到的氨芐青霉素抗性菌落接種于含有氨芐青霉素100μg/ml的LB培養液，振蕩培養過夜，再提取重組質粒進行酶切鑒定，命名為pMD-E2，其中的人免疫球蛋白信號肽與HCV包膜蛋白E2融合基因的序列如SEQID NO1所示。
3.CHO細胞GS基因的克隆用含有5％新生牛血清的DMEM培養液傳代培養CHO-K1細胞(購自美國ATCC)，細胞達到80％匯合時，用Trizol Reagent(美國Gibco產品)抽提細胞總RNA，操作參照使用說明進行。得到的細胞總RNA溶解于DEPC處理的滅菌重蒸水。
逆轉錄反應(RT)逆轉錄反應試劑為美國Promega產品。
取RNA 2μl(約5μg)，置于一只50μl離心管內，再依次加入以下各組分5×AMV逆轉錄反應緩沖液 5μldNTP(10mM) 1μloligo(dT)15(5pmol/μl) 1μl于70℃熱水浴5分鐘，再迅速置于冰水浴，加入以下組分RNA酶抑制劑(30U/μl) 2μlAMV逆轉錄酶(5U/μl)1μl加DEPC處理的滅菌重蒸水至終體積25μl。
混勻，于42℃水浴40分鐘，再95℃5分鐘滅活逆轉錄酶，立即進行PCR擴增GS基因。
根據GS基因的序列設計、合成引物(上下游引物GSF、GSR中分別引入ApaI和SacII酶切位點)GSF5′-GGGCCCATGGCCACCTCAGCAAGTTCC-3′GSR5′-CCGCGGTTAGTTTTTGTATTGGAAGGGCTCGTCGCC-3′以RT產物為模板擴增GS基因，擴增產物插入T載體pMD18T，得到重組質粒命名為pMD-GS，再對GS基因進行DNA測序，操作方法同前。測序所得的GS基因序列與Genbank accession X03495一致。
4.基于內含子篩選標記的表達載體的構建以真核表達載體pCI-neo(美國Promega產品)為基本框架，將GS基因插入內含子基因中，因內含子基因在轉錄以后從mRNA鏈上被剪切，其中的編碼序列由于在5′端缺少帽狀結構和3′端缺少多聚腺苷序列而僅能低水平表達，因此將篩選標記基因插入內含子中能提高篩選得到的細胞克隆的陽性表達率。
根據pCI-neo載體中的CMV巨細胞病毒啟動子/增強子以及嵌合內含子的序列合成引物inDF5′-GAGCTCGTTTAGTGAACCG-3′(含Sac I酶切位點)inDR5′-GGGCCCTCTGTCTCGACAAGCCCAG-3′(含ApaI酶切位點)inAF5′-GGGCCCATACCGCGGAAGACTCTTGCGTTTCTG-3′(含ApaI、SacII酶切位點)inAR5′-GTCGACCTATAGTGAGTCGT-3′(含NheI酶切位點)
以質粒pCI-neo為模板，以引物inDF、inDR擴增內含子剪切供體位點片段，以引物inAF、inAR擴增內含子剪切受體位點片段。分別將內含子剪切供體位點片段和受體位點片段插入T載體pMD18T，得到重組質粒命名為pMD-inD、pMD-inA，再進行DNA測序，操作方法同前。
以SacI、ApaI酶切質粒pMD-inA，回收切出的內含子剪切供體位點片段inD；以ApaI、NheI酶切質粒pMD-inA，回收切出的內含子剪切供體位點片段inA。
以SacI、NheI酶切質粒pCI-neo，切除質粒中的內含子基因，回收載體大片段，將載體大片段與inD、inA片段連接，得到的重組質粒命名為pCIDA-neo，該載體的特點在于，內含子中引入了兩個酶切位點ApaI和SacII，可以插入篩選標記基因。
將質粒pMD-GS以ApaI和SacII酶切，切出的GS基因插入pCIDA-neo中，得到重組質粒pCIDA-GS-neo。其特點在于GS基因插入在內含子之中。
5.HCV包膜E2基因表達載體的構建質粒pMD-E2以NheI和SalI酶切，回收切出的HCV包膜E2基因，將該基因插入經過NheI和SalI酶切的線性化載體pCIDA-GS-neo，即得到E2表達載體pCIDA-GS-E2-neo，其表達調控結構如圖1所示PCMV為巨細胞病毒啟動子，introD為內含子供體序列，GS為谷氨酰氨合成酶基因，introA為內含子受體序列，Sig為人免疫球蛋白信號肽，E2為HCV包膜E2基因，polyA為SV40病毒多聚腺苷酸序列。
6.HCV包膜E2蛋白在CHO細胞中的表達用含有5％新生牛血清的DMEM培養液傳代培養CHO-K1細胞，細胞80％融合時，以0.25％胰蛋白酶消化細胞，細胞傳代接種于35mm細胞培養皿，次日將2μg質粒pCIDA-GS-E2-neo及對照質粒pCIDA-GS-neo分別與10μl脂質體轉染試劑Lipofectamine(美國Invitrogen產品)混勻，轉染CHO-K1細胞，操作按照使用說明進行。將細胞培養皿置于37℃、5％二氧化碳、飽和濕度的細胞培養箱中，12小時后加1ml含20％胎牛血清的DMEM培養液，繼續培養48小時。然后凍融裂解細胞，細胞裂解液進行SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳，再進行western blot檢測，E2抗體為山羊抗HCV包膜E2蛋白多抗(美國Biodesign產品)，酶標抗體為辣根過氧化物酶(HRP)標記的驢抗山羊IgG(華美生物工程有限公司產品)。同時將培養上清進行濃縮，濃縮液進行western blot檢測。操作均參照《分子克隆實驗指南第二版》(科學出版社，1995)進行。結果如圖2，可見細胞裂解液中存在各種不同分子量形式的E2蛋白，最高分子量的蛋白為完全糖基化E2，而其余為部分糖基化E2，其中分泌至培養上清中的主要為完全糖基化的E2。細胞培養上清用抗E2單克隆抗體(美國Biodesign產品)進行dot blot檢測，如圖3所示，也能檢測到分泌至培養上清中E2蛋白。
7.穩定表達HCV包膜E2蛋白的CHO-K1細胞株的構建將質粒pCIDA-GS-E2-neo轉染于接種24孔板中的CHO-K1細胞，48小時后，將細胞以0.25％胰蛋白酶消化，接種于5個100mm細胞培養皿，用含有10％透析的胎牛血清的GMEM-S培養液(JRH產品)培養，加甲硫酰硫酸胺(MSX)(Sigma產品)至終濃度25μmol/L，3-4天后細胞開始死亡，兩周后培養皿形成由單個細胞增殖而形成的集落(克隆)，挑選單個克隆，接種于24孔板，繼續用25μmol/L MSX的GMEM-S培養液培養，一周后培養上清用dot blot法檢測E2蛋白的表達，對表達水平最高的克隆以胰蛋白酶消化，以105個細胞/孔接種96孔板，用濃度遞增的MSX(100-1000μmol/L)加壓培養，2周后，對生長良好的細胞檢測其培養上清中E2的表達。表達量最高者再進行有限稀釋，接種于96孔板，對單個細胞克隆進行表達水平分析，得到的最高表達克隆作為待用的細胞株，命名為CR9。
8.無血清培養用無血清培養基(JRH產品)逐漸替代GMEM-S培養基，使CR9細胞逐漸適應完全無血清培養基而從貼壁轉為懸浮生長。將懸浮細胞改用搖瓶培養，培養體積150毫升。由于無血清培養液中除了細胞分泌表達E2外，其他蛋白含量(來源于少數死亡的細胞)極低，因而極大方便了蛋白純化，培養上清離心、超濾以后，用鎳離子金屬鰲合層析的方法進行初步純化(試劑采用Qiagen產品)，每一百毫升培養液中可得到E2蛋白25毫克。圖4為不同批次純化蛋白的SDS-PAGE分析。
SEQUENCE LISTING<110>中國人民解放軍第二軍醫大學<120>一種用哺乳動物細胞高效分泌表達丙型肝炎病毒包膜蛋白E2的方法<130>說明書，權利要求書<160>1<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>921<212>DNA<213>人工序列<400>1atggagaccg acaccctgct gctgtgggtg ctgctgctgt gggtgcccgg cagcaccggc60gacgccgaga cccacacgac ggggagggtg gccggccaca ccacctccgg gttcacgtcc120cttttctcat ctggggcgtc tcagaaaatc cagcttgtga ataccaacgg cagctggcac180atcaacagga ctgccctaaa ttgcaatgac tccctccaaa ctgggttctt tgccgcgctg240ttttacgcac acaagttcaa ctcgtccggg tgcccggagc gcatggccag ctgccgcccc300attgactggt tcgcccaggg gtggggcccc atcacctata ctaagcctaa cagctcggat360cagaggcctt attgctggca ttacgcgcct cgaccgtgtg gtgtcgtacc cgcgtcgcag420
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1.一種用哺乳動物細胞高效分泌表達丙型肝炎病毒包膜蛋白E2的方法，其特征在于該方法構建了一種新型的哺乳動物細胞表達質粒，該表達質粒高水平表達作為目標基因的丙型肝炎病毒包膜蛋白E2，而低水平表達作為篩選標記的谷氨酰氨合成酶。
2.根據權利要求1所述的一種用哺乳動物細胞高效分泌表達丙型肝炎病毒包膜蛋白E2的方法，其特征在于其中的表達質粒是將谷氨酰氨合成酶基因插入真核表達質粒載體pCI-neo的內含子基因的剪切供體與剪切受體位點之間，將丙型肝炎病毒包膜蛋白E2基因置于谷氨酰氨合成酶基因內含子之3′端。
3.根據權利要求2所述的一種用哺乳動物細胞高效分泌表達丙型肝炎病毒包膜蛋白E2的方法，其特征在于表達質粒中的丙型肝炎病毒包膜蛋白E2與人免疫球蛋白信號肽的融合基因的序列如SEQ ID NO1所示。
4.根據權利要求1或2所述的一種用哺乳動物細胞高效分泌表達丙型肝炎病毒包膜蛋白E2的方法，其特征在于將其中的表達質粒轉染哺乳動物細胞后，以甲硫酰硫酸胺篩選穩定轉染的細胞克隆。
5.根據權利要求4所述的一種用哺乳動物細胞高效分泌表達丙型肝炎病毒包膜蛋白E2的方法，其特征在于將其中的哺乳動物細胞為中國倉鼠卵巢細胞。
6.權利要求1或2所述的一種用哺乳動物細胞高效分泌表達丙型肝炎病毒包膜蛋白E2的方法在構建穩定的高水平分泌表達丙型肝炎病毒包膜蛋白E2的工程細胞株中的應用。
7.權利要求1或2所述的一種用哺乳動物細胞高效分泌表達丙型肝炎病毒包膜蛋白E2的方法在診斷丙型肝炎病毒感染疾病中的應用。
8.根據權利要求7所述的一種用哺乳動物細胞高效分泌表達丙型肝炎病毒包膜蛋白E2的方法在用酶聯免疫吸附試驗診斷丙型肝炎病毒感染疾病中的應用。
9.權利要求1或2所述的一種用哺乳動物細胞高效分泌表達丙型肝炎病毒包膜蛋白E2的方法在治療丙型肝炎病毒感染疾病中的應用。
10.權利要求1所述的一種用哺乳動物細胞高效分泌表達丙型肝炎病毒包膜蛋白E2的方法在丙型肝炎病毒疫苗中的應用。
全文摘要
本發明涉及生物醫藥工程技術領域，全球HCV感染者約有1.7億，70％以上的HCV感染會發展為慢性感染，HCV包膜蛋白E2介導HCV與靶細胞的結合，是涉及HCV感染性的最關鍵蛋白，而E2蛋白屬于低表達蛋白，用基因重組方法獲得哺乳動物細胞表達的該蛋白相當困難。本發明的目的在于提供一種用哺乳動物細胞高效分泌表達丙型肝炎病毒包膜蛋白E2的方法，該方法構建了一種新型的哺乳動物細胞表達質粒，該表達質粒高水平表達目標基因E2蛋白，而低水平表達篩選標記谷氨酰氨合成酶。本發明能批量制備具有HCV包膜蛋白天然生物學功能以及抗原性的重組HCV包膜E2蛋白，為HCV感染的血清學檢測試劑以及HCV疫苗的開發奠定了基礎，并可以為HCV分子病毒學研究提供重要材料。
文檔編號A61K38/16GK1821411SQ20061002420
公開日2006年8月23日 申請日期2006年2月28日 優先權日2006年2月28日
發明者趙平, 廖小玲, 曹潔, 戚中田 申請人:中國人民解放軍第二軍醫大學