專利名稱：一種噬菌蛭弧菌制劑的生產方法
技術領域：
本發明屬于生物技術領域，具體涉及一種噬菌蛭弧菌制劑的生產方法。
背景技術：
國內外在水產養殖及動物疾病防治中，目前主要使用抗生素等化學制劑。這些制劑的副作用，如藥物殘留、病原菌的抗藥性、抑制有益菌群等，給人類健康及畜牧業生產帶來的不良影響越來越明顯。近年來微生物生態制劑的研究開發受到各方關注，特別是噬菌蛭弧菌的研究受到人們的青睞。
噬菌蛭弧菌自1963年被發現以來，因其是一種寄生菌，能裂解大腸桿菌、沙門氏菌、嗜水氣單胞菌、弧菌等動物致病菌，而其本身對人和動物無毒無害，還可以改善水環境等，日益受到人們的關注。在研究開發中，人們都用大腸桿菌作為宿主菌。用活的大腸桿菌培養生產噬菌蛭弧菌，受多種技術條件的限制，很難進行大規模工業化生產，同時影響生態環境。因而有人提出用高溫(70-150℃)或化學藥物(氯仿等)將大腸桿菌殺死，制造滅活的宿主菌，用來生產噬菌蛭弧菌。實踐證明，用這種方法生產的噬菌蛭弧菌制劑，會降低噬菌蛭弧菌對活的宿主菌的裂解能力，甚至降到無裂解能力，因此，對防治動物細菌性疾病效果不穩，同時該制劑保存時間短，使制劑開發應用受到限制，在水產養殖中更受到制約。
發明內容
本發明目的在于提供一種新的噬菌蛭弧菌制劑的生產方法，為噬菌蛭弧菌的工業化生產提供一種新的活性宿主菌，解決原大腸桿菌作為宿主菌很難進行工業化生產及造成環境污染的問題，并保證噬菌蛭弧菌的裂解活性，進一步提高其防治病害的效果。
為了達到上述目的，本發明的主要技術方案如下一種噬菌蛭弧菌的生產方法，該方法由以下步驟組成1.宿主菌混懸液的制備將培養好的光合細菌中的紅假單胞菌混懸液靜置24～96小時，除去上層溶液(占全部溶液體積的1/2～2/3)，加入與除去的上層溶液等體積量的0.2％～0.85％NaCl溶液，搖勻，再靜置24～72小時，除去上層溶液(占全部溶液體積的1/2～2/3)，再加入0.2％～0.85％NaCl溶液，配成原全部溶液體積1/2～2/3的宿主菌混懸液備用。
2.配制培養液將PH6.5～8.0的磷酸鹽緩沖液用水10倍稀釋，然后加入CaCl2和MgCl2制成培養液，培養液中CaCl2和MgCl2含量均為10～100mg/L。
3.噬菌蛭弧菌的發酵工藝在所制成的培養液中，加入與培養液體積比為5％～30％的由步驟1制備的宿主菌混懸液，再加入與已加宿主菌混懸液的培養液體積比為2％～3％的噬菌蛭弧菌液(含菌量大于105pfu/ml)，在28～30℃溫度條件下培養72～120小時，即制成噬菌蛭弧菌制劑。
步驟1中最后制得的宿主菌混懸液的含菌量為30～300億/ml；且紅假單胞菌混懸液優選的靜置時間為24～48小時。
步驟2培養液中加入少量的CaCl2和MgCl2有助于促進后面的噬菌蛭弧菌的生長。且培養液中CaCl2和MgCl2的優選含量為20mg/L；同時PH6.5～8.0的磷酸鹽緩沖液可以是PBS。
本發明經過多年研究提出，光合細菌中的紅假單胞菌可作為生產培養噬菌蛭弧菌的新宿主菌，從而解決了用大腸桿菌作為宿主菌很難進行工業化生產的難題，還避免了用大腸桿菌作為宿主菌所造成的環境污染；同時新宿主菌作為一種活菌，保證了噬菌蛭弧菌的裂解活性，因而其防治病害效果顯著提高。如上海奉賢農場實驗表明，使用本發明制得的制劑后，對蝦幼苗育成率達98％以上；又如，南京福潤德生物有限公司使用本發明制得的制劑防治青蟹疾病，成活率達87％以上，而對照組僅為51.5％，效果極顯著。同時本發明所得制劑對鰻魚因弧菌、愛德華氏菌、嗜水氣單胞菌等引起的疾病亦有明顯的防治效果。
因為光合細菌本身是水產養殖和改善水質的有益菌，且與噬菌蛭弧菌具有協同作用，因此本發明中采取光合細菌中的紅假單胞菌可作為生產培養噬菌蛭弧菌的新宿主菌進一步提高了噬菌蛭弧菌制劑的使用效果，還延長噬菌蛭弧菌的保存期，可達6～12個月。由本發明制得的制劑在改善水質方面效果明顯，使水體pH值穩定，降低水體中化學需氧量(COD)、以及氨態氮和亞硝酸鹽含量等；中國水產研究所淡水漁業研究中心實驗表明，使用噬菌蛭弧菌后，氨態氮由0.35降為0.22(mg/L)，COD由6.4降為4.2(mg/L)。本制劑對防治仔雞白痢，仔豬黃白痢等幼禽畜下痢也有顯著效果。
具體實施例方式
以下為本發明噬菌蛭弧菌制劑生產方法的多組具體實施例，包括新宿主菌——光合細菌培養液的制備方法和噬菌蛭弧菌的發酵工藝實施例11.宿主菌混懸液的制備——將培養好的光合細菌紅假單胞菌混懸液(培養方法見中國微生態學雜志p.78.1990.3，菌株包括渾球紅假單孢菌P4或沼澤紅假單孢菌101，菌種購買于上海交通大學生物技術所)，靜置24小時，除去占全部溶液體積1/2的上層溶液；加入與除去的上層溶液等體積量的0.2％NaCl溶液，搖勻，再靜置24小時，除去占全部溶液體積1/2的上層溶液，再加入0.2％NaCl溶液，配成原全部溶液體積2/3的宿主菌混懸液，含菌量為30～300億/ml，獲得的宿主菌混懸液備用。
2.配制培養液將PH7的磷酸鹽緩沖液(可以是PBS)用水10倍稀釋，然后加入CaCl2和MgCl2制成培養液，培養液中CaCl2和MgCl2含量均為20mg/L。
3.噬菌蛭弧菌的發酵工藝在所制成的培養液中，加入與培養液體積比為10％的由步驟1制備的宿主菌混懸液，再加入與已加宿主菌混懸液的培養液體積比為2％的含菌量大于105pfu/ml的噬菌蛭弧菌液(培養方法見動物微生態研究進展p190，2000年，中國農業大學出版社，菌種包括Bdl或Bd6，購買于江蘇省衛生防疫站)，在28～30℃溫度條件下培養80小時，即制成噬菌蛭弧菌制劑。
實施例21.宿主菌混懸液的制備——將培養好的光合細菌紅假單胞菌混懸液(培養方法見中國微生態學雜質p.78.1990.3，菌株包括渾球紅假單孢菌P4或沼澤紅假單孢菌101，菌種購買于上海交通大學生物技術所提供)，靜置48小時，除去占全部溶液體積2/3的上層溶液；加入與除去的上層溶液等體積量的0.75％NaCl溶液，搖勻，再靜置48小時，除去占全部溶液體積2/3的上層溶液，再加入0.3％NaCl溶液，配成原全部溶液體積1/2的宿主菌混懸液，含菌量為30～300億/ml，獲得的宿主菌混懸液備用。
2.配制培養液將PH7.5的磷酸鹽緩沖液(可以是PBS)用水10倍稀釋，然后加入CaCl2和MgCl2制成培養液，培養液中CaCl2和MgCl2含量均為60mg/L。
3.噬菌蛭弧菌的發酵工藝在所制成的培養液中，加入與培養液體積比為20％的由步驟1制備的宿主菌混懸液，再加入與已加宿主菌混懸液的培養液體積比為3％的含菌量大于105pfu/ml的噬菌蛭弧菌液(培養方法見動物微生態研究進展p190，2000年，中國農業大學出版社，菌種包括Bd1或Bd6，購買于江蘇省衛生防疫站)，在28～30℃溫度條件下培養100小時，即制成噬菌蛭弧菌制劑。
本發明經過申請人大量實驗，證實其對防治魚蝦疾病，改善水質均有顯著效果
1.將渾球紅假單孢菌P4培養的噬菌蛭弧菌Bd1制劑用于對蝦幼苗，用100ppm浸泡15～20分鐘，可使幼苗成活率平均達98％；本制劑對大腸桿菌、弧菌、嗜水氣單胞菌有很好的裂解效果。以嗜水氣單胞菌為例，其裂解動態見下表
2.本制劑防治青蟹疾病，每次用5ppm，灑入水池，10～15天使用一次，成活率達87％以上，而對照組僅為51.5％。
3.用本制劑改善水質實驗結果表明，每次用量10ppm，30天使用1次，結果氨態氮(mg/L)由0.35降為0.22。COD(mg/L)由6.4降為4.2，pH值穩定。
權利要求
1.一種噬菌蛭弧菌制劑的生產方法，其特征是該方法由以下步驟組成1)宿主菌混懸液的制備將培養好的光合細菌中的紅假單胞菌混懸液靜置24～96小時，除去上層溶液，加入與除去的上層溶液等體積量的0.2％～0.85％NaCl溶液，搖勻，再靜置24～72小時；除去上層溶液，再加入0.2％～0.85％NaCl溶液，配成原全部溶液體積1/2～2/3的宿主菌混懸液備用；2)配制培養液將PH6.5～8.0的磷酸鹽緩沖液用水10倍稀釋，再加入CaCl2和MgCl2制成培養液，培養液中CaCl2和MgCl2含量均為20mg/L；3)噬菌蛭弧菌的發酵工藝在所制成的培養液中，加入體積比為5％～30％的由步驟1制備的宿主菌混懸液，再加入與已加宿主菌混懸液的培養液體積比為2％～3％的噬菌蛭弧菌液，在28～30℃溫度條件下培養72～120小時，即制成噬菌蛭弧菌制劑。
2.根據權利要求1所述的噬菌蛭弧菌制劑的生產方法，其特征為步驟1中兩次除去的上層溶液均占全部溶液體積的1/2～2/3。
3.根據權利要求1所述的噬菌蛭弧菌制劑的生產方法，其特征為步驟1中紅假單胞菌混懸液的靜置時間優選為24～48小時。
4.根據權利要求1所述的噬菌蛭弧菌制劑的生產方法，其特征為步驟1中制得的宿主菌混懸液含菌量為30～300億/ml。
5.根據權利要求1所述的噬菌蛭弧菌制劑的生產方法，其特征為步驟1中的磷酸鹽緩沖液為PBS。
6.根據權利要求1所述的噬菌蛭弧菌制劑的生產方法，其特征為步驟2中制成的培養液中CaCl2和MgCl2優選含量均為20mg/L。
7.根據權利要求1所述的噬菌蛭弧菌制劑的生產方法，其特征為步驟3中加入的噬菌蛭弧菌液的含菌量大于105pfu/ml。
全文摘要
一種噬菌蛭弧菌制劑的生產方法，包括如下步驟1)將紅假單胞菌混懸液與0.2％～0.85％NaCl溶液制成含菌量為30～300億/ml的宿主菌混懸液；2)將pH6.5～8.0的磷酸鹽緩沖液用水10倍稀釋，再加入CaCl
文檔編號A61P31/00GK1857327SQ20061003934
公開日2006年11月8日 申請日期2006年4月6日 優先權日2006年4月6日
發明者薛恒平 申請人:薛恒平, 南京福斯特牧業科技有限公司