專利名稱：葡聚糖四氧化三鐵磁性納米材料及其制備方法和應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種醫藥載體材料，更具體地說它是一種葡聚糖四氧化三鐵磁性納米材料，本發明還涉及這種磁性納米材料的制備方法和應用。
背景技術：
傳統的基因載體主要包括兩大類病毒載體和非病毒載體。病毒載體是迄今為止實驗室里最有效的基因轉移方法，其轉移效率甚至可以達到90％。然而由于其局限性，尤其是安全問題的存在，其在臨床上的應用受到限制。非病毒載體因而得到了快速發展，但其轉染效率一直不如病毒載體系統。
隨著納米技術、生物工程技術的不斷進步，非病毒載體的研究也發展到了一個新的階段。目前，藥物/核酸轉運系統已經發展到靶向轉運系統。該系統將能攜帶效應分子，主動或被動地轉運到機體的靶部位發揮治療作用，而對其它部位的毒副作用很低。國內外的研究顯示，在四氧化三鐵晶粒表面包附一層生物大分子(如蛋白質，脂質體，多糖等)，能夠得到良好的生物相容性和生物安全性。而且這種磁性微球具有磁響應性，在外加梯度磁場作用下能夠趨向運動，可以作為攜帶藥物或核酸分子的載體骨架進行腫瘤的磁控靶向治療。其中，多糖類高分子聚合物更具有可生物降解、幾乎無免疫原性的優點。而且其良好的親水性使其可以制備成親水凝膠狀的納米顆粒。這種天然的親水表面能減弱機體內巨噬細胞的吞噬作用，延長其在血液中的循環時間，因此很適合用于生物大分子類藥物的傳遞。
四氧化三鐵(Fe3O4)磁性微粒毒性低，具有磁響應性。當磁性微粒的粒徑足夠小時，具有超順磁性，即在外加磁場中有較強的磁性，撤離磁場時磁性很快消失，剩磁為零，不會被永久磁化。因此，四氧化三鐵磁性微粒成為目前生物磁性材料領域的一個研究熱點。
葡聚糖(dextran)，又名右旋糖苷，是具有線狀主鏈的一類多糖，主要由1，6-α-D-吡喃糖苷連接在一起，本身及其在體內的降解產物(CO2、H2O)對人體無毒，在臨床上已被用作血容量擴增劑。經葡聚糖包被的磁性納米微粒，既可以通過大分子上的活性基團連接具有生物活性的物質，又能通過布朗運動保持其在溶液中的穩定性。因此，葡聚糖四氧化三鐵磁性納米材料(DCIONPs)在醫學領域將有著廣闊的應用前景。
上個世紀八十年代以來，人們不斷嘗試制備粒徑更小、磁響應性更強的葡聚糖磁性微粒，然而迄今為止相關的制備方法均較復雜、成本較高，不能較好地兼顧好粒徑的大小和磁響應性高低的關系，尚沒有形成成熟統一的制備方法。本實驗擬采用簡單易行、成本低廉的方法研制粒徑微小、磁響應性高的葡聚糖四氧化三鐵磁性納米材料。并將該磁性納米微粒與基因分子相結合，在外加磁場的導向下，高度濃集、作用于腫瘤細胞。
發明內容
本發明的目的在于克服上述現有背景技術的不足之處，而提供一種磁響應性強、粒徑小且分布均一的葡聚糖四氧化三鐵磁性納米材料。
本發明的另一個目的在于提供一種上述葡聚糖四氧化三鐵磁性納米材料的制備方法。
本發明的再一個目的是提供上述葡聚糖四氧化三鐵磁性納米材料的應用，檢測其與DNA分子的結合效率，以及在磁場導向下轉染腫瘤細胞的能力。
制備葡聚糖四氧化三鐵磁性納米材料的方法，其特征在于其化學反應式為具體步驟如下①、4.0g Dextran T-10溶于20ml三蒸去離子水，在通入氮氣的同時，加入2.33mmol FeCl3·6H2O和1.26mmol FeCl2·4H2O；②、溶液經超聲波，功率200瓦作用3分鐘后，加大功率至325瓦，逐滴加入25％~30％氨水1.2ml；③、調整超聲波功率至300瓦，持續模式作用于反應液30分鐘，脈沖模式作用30分鐘；④、冷卻后得到黑色膠體混懸液；
⑤、將所得黑色膠體混懸液置于5×103高斯磁場中作用1h，即得本發明葡聚糖四氧化三鐵磁性納米材料。
在上述技術方案中，所述步驟①、②、③中的反應容器均置于冰水浴中。
根據上述方法制備的葡聚糖四氧化三鐵磁性納米材料，微粒多呈球形或橢圓形，有效粒徑為93.1±2.2nm，半峰寬為26.7±1.3nm，Zeta電位為正，分散度為0.083±0.011，在外加場強為104Oe、溫度為18℃的條件下微粒的磁響應強度為26.0±1.1emu/g，撤除磁場時剩磁為零。
葡聚糖四氧化三鐵磁性納米材料的應用，將其作為醫藥載體在制藥中的應用。
本發明葡聚糖四氧化三鐵磁性納米材料具有如下優點制備方法簡單，采用一步法即可制成，成本低廉，有利于推廣。微粒有效粒徑小、粒徑分布窄以及磁響應性高。微粒能夠較好的與質粒DNA相結合，起到基因載體的作用。在外加磁場的作用下，其早期轉染效率得到顯著提高。
圖1不同鐵含量制得的DCIONPs的磁響應性。
圖2不同葡聚糖含量制得的DCIONPs的粒徑大小。
圖3Fe/dextran比值與顆粒大小的關系。
圖4Fe/dextran比值與磁響應性的關系。
圖5葡聚糖磁液形態。
圖6葡聚糖磁性微粒的掃描電鏡觀。
圖7DCIONPs粒徑分析圖8DCIONPs粒徑分析(95％粒徑分布)圖9DCIONPs粒徑分析(99％粒徑分布)。
圖10DCIONPs的Zeta電位檢測圖11DCIONPs原子力顯微鏡照片(二維觀)圖12DCIONPs原子力顯微鏡照片(三維觀)圖13不同質量比(DCIONPs(Fe)∶pGenesil-1)瓊脂糖凝膠電泳情況圖14不同質量比與DCIONPs/pGenesil-1結合率的關系曲線圖15細胞轉染后綠色熒光蛋白表達情況(4小時，外加磁場)圖16細胞轉染后綠色熒光蛋白表達情況(48小時，外加磁場)圖17細胞轉染后綠色熒光蛋白表達情況(4小時，不加磁場)圖18細胞轉染后綠色熒光蛋白表達情況(48小時，不加磁場)具體實施方式
實施例葡聚糖四氧化三鐵磁性納米材料的制備及葡聚糖四氧化三鐵磁性納米材料分析一、材料(一)試劑水合氯化亞鐵(FeCl2·4H2O)水合氯化鐵(FeCl3·6H2O)25-30％氨水(NH3·H2O)氮氣(N2)以上均為國產分析純。
葡聚糖T-10 Dextran T-10(Pharmacia公司產)實驗用水均為雙蒸水及三蒸水。
(二)儀器JY-9211型超聲細胞粉碎儀(寧波科學生物儀器廠)JJ-3控溫定時電動攪拌器(常州國華電器有限公司)RE-52C旋轉蒸發器(鞏義市英峪予華儀器廠)Anke TGL-16G型臺式高速離心機(上海安亭科學儀器廠)釹-鐵-硼(Nd-Fe-B)永磁體0-5000高斯(包頭磁鐵廠)501型超級恒溫器(上海實驗儀器廠)CTS24型霍爾效應數字磁強計(上海震宏實業公司)PHSJ-4A型實驗室PH計(上海精密科學儀器有限公司)
JA1003型精密電子天平(上海良平儀器儀表有限公司)SZ-97型自動三重純水蒸餾器(上海亞榮生化儀器廠)NanoScope IV原子力顯微鏡(Veeco Instruments，USA。武漢理工大學測量中心)JSM-5610LV掃描電鏡(JEOL，Japan。武漢理工大學測量中心)Zeta-PALS激光粒度分析儀(Brookhaven Instruments Corporation，USA。武漢理工大學復合材料國家重點實驗室)3257-35DC磁性測試儀(YOKOGAWA Ltd.，Japan。日本橫河電機株式會社)二、方法(一)正交法篩選制備DCIONPs的影響因素以反應液中總鐵含量、葡聚糖含量、反應溫度為影響因素，每一因素分為3個水平，進行正交設計，依據L9(33)安排實驗，見表1。實驗結果按以下3個指標進行評估1.樣品有效粒徑(Effective Diameter，Eff.Diam.)；2.樣品粒徑分散度(Poly-dispersity)；3.樣品飽和磁化強度(SaturationMagnetization，Ms)。每種試驗條件重復3次，制備出的樣品評估指標取平均值。
表1 正交試驗因素水平(L9＝33)
A總鐵含量(mmol/ml)；B葡聚糖含量(wt％)；C反應溫度(℃)(二)制備與純化根據上述正交設計法，分析優選試驗條件，采用化學共沉淀法一步合成葡聚糖四氧化三鐵磁性納米材料(DCIONPs)。在適量葡聚糖的存在下，依據化學反應式
經超聲波的粉碎空化作用，并通入氮氣防止二價鐵的氧化，在液相條件下合成微粒。利用其磁響應性，在外加磁場的作用下分離純化磁性微粒。具體步驟如下①、4.0g Dextran T-10溶于20ml三蒸去離子水，在通入氮氣的同時，加入2.33mmolFeCl3·6H2O和1.26mmolFeCl2·4H2O；②、溶液經超聲波，功率200瓦作用3分鐘后，加大功率至325瓦，逐滴加入25％-30％氨水1.2ml；③、調整超聲波功率至300瓦，持續模式作用于反應液30分鐘，脈沖模式作用30分鐘；④、冷卻后得到黑色膠體混懸液；⑤、將所得黑色膠體混懸液置于5×103高斯磁場中作用1h，即得本發明葡聚糖四氧化三鐵磁性納米材料。
所述步驟①、②、③中的反應容器均置于冰水浴中，以利于良好的散熱。
若要獲得固態樣品，可置于旋轉蒸發器中進行真空干燥。
(三)葡聚糖四氧化三鐵磁性納米材料的理化性質檢測1.外觀形態室溫條件下，肉眼觀察微粒及磁液的外觀形態。
2.掃描電鏡觀察將樣品適度稀釋后經常規處理，置于掃描電鏡下觀察微粒的形態及大小。
3.激光光散射粒度分析儀檢測將磁液樣品用過膜三蒸水稀釋至無色透明后，在激光光散射粒度分析儀中檢測顆粒有效粒徑、粒徑分布及Zeta電位。重復檢測三次，每次進行一分鐘，取平均值。
4.原子力顯微鏡觀察滴一滴樣品于干凈蓋玻片上，于層流室中自然晾干，然后置于原子力顯微鏡下，選擇“tapping”模式，觀察微粒大小及表面形態。
5.磁響應性檢測將樣品裝于平底容器中，在外加場強為104Oe、溫度為18℃條件下進行檢測。重復測試三次，取平均值。
結果(一)正交法分析制備DCIONPs的影響因素根據表2.1的正交設計進行試驗，結果見表2。
表2 不同試驗條件制備DCIONPs的方案及結果
影響因素(自變量)A總鐵含量(mmol/ml)；B葡聚糖含量(wt％)；C反應溫度(℃)評估指標(因變量)X1樣品有效粒徑(nm)；X2樣品多分散性；X3樣品飽和磁化強度(emu/g)根據上述實驗方案得到的結果顯示影響微粒性質的因素主要有兩個即A、反應液中總鐵含量；B、反應液中葡聚糖的含量。從上表可以看出，當反應液中鐵的含量越高，制得的樣品磁響應性越高(見圖1)；當反應液中葡聚糖的含量越高，樣品的有效粒徑越小、分散度越好(見圖2)。而反應的溫度對實驗結果無顯著影響。可見，對于制備性質穩定、粒子粒徑小、磁響應性高的磁性納米微粒，反應物的含量是關鍵。
在醫學應用中，人們往往需要粒徑足夠小、磁響應性足夠高的磁性微粒，但這卻是一對矛盾。磁微粒的粒徑太小則磁響應性就會較低，反之亦然。那么，如何使二者達到一個平衡，使其微粒夠小、磁性較高？將Fe/dextran的比值作為橫坐標，分別將粒徑(size)、飽和磁響應強度(Ms)作為縱坐標作圖(圖3，圖4)。
(二)葡聚糖四氧化三鐵磁性納米材料的理化性質1.外觀形態改良制備的葡聚糖磁性微粒為黑色膠體混懸液(圖5)，密封常溫保存3個月性質不改變。
2.掃描電鏡觀察顆粒以橢圓形和球形居多，另有少許不規則形，邊界明顯。顆粒中心部位顏色較深，而周邊顏色較淺，提示有殼核結構存在。鏡下觀，顆粒大小多為200nm左右(圖6)。
3.激光光散射粒度分析儀檢測經三次重復檢測，測得有效粒徑為93.1±2.2nm；分散度為0.083±0.011，分散性好；半峰寬為26.7±1.3nm，粒徑分布圖顯示為單峰分布，峰型窄，提示該樣品大小較均一(圖7)。進一步分析，顯示該樣品95％的粒子其粒徑小于102.51納米(圖8)，99％的粒子其粒徑小于122.26納米(圖9)。Zeta電位檢測顯示該微粒表面帶正電(圖10)。
4.原子力顯微鏡觀察顯示多數大小約為200nm左右的大顆粒是由數個球形或卵圓形微粒黏附在一起，每個微粒的粒徑普遍在50nm以下。另外，顆粒表面比較粗糙，似有絨毛樣結構。因此，通過原子力顯微鏡觀察，可以認為該方法制備出的微粒的實際大小為50nm以下，甚至更小(圖11、12)。
5.磁性微粒的磁響應性分析在外加場強為104Oe的情況下，微粒的飽和磁響應強度為26.0±1.1emu/g，撤除磁場后剩磁為零，提示此法制備的葡聚糖四氧化三鐵磁性納米材料具有良好的超順磁性(superparamagnetism)。
磁性基因復合物的合成及特性研究材料和方法一、材料(一)試劑pGenesil-1質粒載體購自武漢市晶賽生物工程技術有限公司Lipofactamine2000轉染試劑購自InvitrogenSofast梭華轉染試劑購自廈門太陽馬生物工程有限公司DCIONPs為本課題組自制(有效粒徑為93.1±2.2nm，半峰寬為26.7±1.3nm，磁響應性為26.0±1.1emu/g)DMEM高糖細胞培養基購自Invitrogen公司小牛血清購自Hyclone公司胰蛋白酶購自Amresco公司青霉素、鏈霉素購自華北制藥廠實驗用水均為雙蒸水及三蒸水。
(二)細胞株人大腸癌Lovo細胞株由武漢大學生命科學院細胞培養室提供。
(三)儀器JY-9211型超聲細胞粉碎儀(寧波科學生物儀器廠)JJ-3控溫定時電動攪拌器(常州國華電器有限公司)Anke TGL-16G型臺式高速離心機(上海安亭科學儀器廠)釹-鐵-硼(Nd-Fe-B)永磁體0-5000高斯(包頭磁鐵廠)JA1003型精密電子天平(上海良平儀器儀表有限公司)SZ-97型自動三重純水蒸餾器(上海亞榮生化儀器廠)XW-80A型旋渦混合器(上海醫科大學儀器廠)YDS-10型液氮生物容器(成都金鳳液氮容器有限公司)DZF型真空干燥箱(上海精宏實驗設備有限公司)BB16UV CO2氣體培養箱(Heraeus公司)BHC-1360IIA/B3型生物安全柜(哈爾濱東聯電子技術開發有限公司)
XD-101型倒置生物顯微鏡(南京江南光電集團股份有限公司)OPTON EM10C型透射電鏡(同濟醫學院超微病理教研室)倒置熒光顯微鏡(OLYMPUS公司)二、方法(一)磁性基因復合物的合成1.配制梯度濃度的DCIONPs磁液。
2.以不同濃度相同體積的DCIONPs與一定量的pGenesil-1質粒載體充分混合作用。
3.按DCIONPs(Fe)∶pGenesil-1質量比分成5組(1∶1，5∶1，10∶1，15∶1，20∶1)，并設置單純質粒(不加磁液)作為對照組。
4.充分混合、吹打，并于常溫下水平搖床振蕩作用5分鐘，溴化乙錠(EB)染色。
5.瓊脂糖凝膠電泳30分鐘，紫外光下顯影。
6.BANDSCAN軟件分析結合率。
(二)大腸癌lovo細胞株的復蘇、傳代培養及接種1.細胞復蘇(1)從液氮罐中取出凍存管。
(2)立即置于37℃水浴中，持續搖晃使其盡快融化。
(3)酒精消毒瓶頸后，用吸管吸出lovo細胞懸液，注入離心管并滴加約10倍培養液混合。
(4)800rpm離心5分鐘后，除去上清液。
(5)重復上述步驟，用培養液再洗滌一到兩次。
(6)棄上清后，加入1ml DMEM培養液并吹打成細胞懸液。
(7)用吸管吸出細胞懸液，滴入25ml培養瓶中，加入含10％小牛血清的DMEM培養液稀釋。
(8)放入37℃、5％CO2培養箱中培養。
2.當細胞生長到覆蓋培養瓶壁大部分面積時，可進行細胞的傳代培養(1)倒掉培養瓶中陳舊培養液。
(2)加入PBS液沖洗1-2次。
(3)加入適量0.25％的胰蛋白酶，37℃消化3-5分鐘。
(4)倒置顯微鏡下觀察，細胞間隙增大、形狀漸變圓即加入培養液停止消化。
(5)吸管吸取培養液，輕輕吹打瓶壁至細胞脫落、瓶壁透明為止。
(6)移取細胞懸液于無菌試管中，1000bpm離心5分鐘，倒掉上清液。
(7)加入含小牛血清的培養液，小心吹打制成細胞混懸液。
(8)分裝入若干個25ml無菌培養瓶中，置于培養箱中繼續培養。
3.細胞種板(1)如上述方法將lovo細胞消化脫壁后終止消化。
(2)吸取細胞于無菌試管中離心棄上清。
(3)加入培養液后小心吹打制成細胞混懸液。
(4)滴一滴混懸液于細胞計數板上，于倒置顯微鏡下觀察計數。
(5)調整混懸液細胞濃度至約為105/ml，接種于96孔板。
(6)補充培養液至每孔200μl，置于培養箱中培養。
(三)磁性轉染效率的檢測以不同的基因載體(包括Lipofactamine2000、Sofast梭華及自行制備的DCIONPs)載附相等量的pGenesil-1空質粒(含綠色熒光蛋白表達框)體外轉染大腸癌細胞-Lovo細胞。分別給予外加磁場(5×103高斯)和不加磁場作用1小時后，于不同時間點(1h，2h，4h，8h，16h，24h，48h)在倒置熒光顯微鏡下觀察細胞的綠色熒光蛋白的表達，比較其轉染效率。
結果(一)磁性基因復合物結合率的檢測當質粒DNA與磁性納米微粒結合后，其空間構象發生改變，不能與溴化乙啶(Ethidium Bromide，EB)結合顯色；而沒能結合上的質粒DNA可以與EB結合而顯色。因此，可以通過瓊脂糖凝膠電泳的顯色亮度來觀察磁性納米微粒與核酸的結合情況。
電泳結果顯示，隨著DCIONPs的含量逐漸增加，與其結合的pGenesil-1逐漸增多，沒能結合而顯影的DNA逐漸減少(圖13)。BANDSCAN軟件分析顯示，當二者的質量比從1增加到5時，二者結合率有一個快速升高的過程。而繼續增加磁性微粒的含量，結合率升高的過程趨緩(圖14)。當質量比為20∶1時，pGenesil-1結合率達到50％。
(二)磁性轉染的效率比較Lovo細胞中綠色熒光蛋白(eGFP)的檢測結果顯示，在外加磁場作用組，早期DCIONPs的轉染效率與Lipofactamine2000無顯著性差異，但均比Sofast梭華為高(圖15)。8h及以后，DCIONPs的轉染效率漸低于Lipofactamine2000，48h時與Sofast梭華的轉染效率無顯著性差異(圖16)。
在不加磁場組，早期及晚期的轉染效率Lipofactamine2000均高于后兩者，DCIONPs與Sofast梭華無顯著性差異(圖17，18)。對于Lipofactamine2000及Sofast，有無磁場在相同時間點時無顯著差異。
對于DCIONPs，8小時前的轉染效率外加磁場組明顯高于無磁場組，8小時后二者漸趨一致。
權利要求
1.葡聚糖四氧化三鐵磁性納米材料的制備方法，其特征在于其化學反應式為具體步驟如下①、4.0g Dextran T-10溶于20ml三蒸去離子水，在通入氮氣的同時，加入2.33mmolFeCl3·6H2O和1.26mmolFeCl2·4H2O；②、溶液經超聲波，功率200瓦作用3分鐘后，加大功率至325瓦，逐滴加入25％-30％氨水1.2ml；③、調整超聲波功率至300瓦，持續模式作用于反應液30分鐘，脈沖模式作用30分鐘；④、冷卻后得到黑色膠體混懸液；⑤、將所得黑色膠體混懸液置于5×103高斯磁場中作用1h，即得本發明葡聚糖四氧化三鐵磁性納米材料。
2.根據權利要求1所述的葡聚糖四氧化三鐵磁性納米材料的方法，其特征在于所述步驟①、②、③中的反應容器均置于冰水浴中。
3.根據權利要求1或2所述制備方法所制得的葡聚糖四氧化三鐵磁性納米材料，其特征在于其有效粒徑為93.1±2.2nm，半峰寬為26.7±1.3nm，Zeta電位為正，分散度為0.083±0.011，磁響應性為26.0±1.1emu/g。
4.葡聚糖四氧化三鐵磁性納米材料的應用，其特征在于將其作為醫藥載體在制藥中的應用。
全文摘要
葡聚糖四氧化三鐵磁性納米材料及其制備方法，其化學反應式為
文檔編號A61P35/00GK101062416SQ20061012552
公開日2007年10月31日 申請日期2006年12月18日 優先權日2006年12月18日
發明者王國斌, 陶凱雄, 夏澤鋒, 羅艷, 蔡開琳, 王繼亮, 劉敬偉, 肖勇, 童強, 田源, 張景輝, 陳景波, 翟榮林, 蔡明 申請人:華中科技大學同濟醫學院附屬協和醫院