專利名稱：干擾素α突變體及其聚乙二醇衍生物的制作方法
技術領域：
本發明一般的涉及干擾素α突變體及其聚乙二醇衍生物的制備方法及用途。具體講本發明涉及利用體外定點突變技術對幾種α干擾素進行定點突變，將其85或86位替換為一個Cys，并利用該位點與聚乙二醇共價結合。本發明還涉及利用半胱氨酸對干擾素特異性修飾的方法、干擾素α突變體聚乙二醇衍生物純化提取及其在癌癥和感染性疾病中的應用。
背景技術：
干擾素是一類重要的家族性細胞因子，具有廣譜的抗病毒、抗細胞增殖和免疫調節作用。哺乳動物的干擾素可以分為α、β、γ、ω等幾型，其中α干擾素又可分十余種亞型，經大量臨床研究證明，α型干擾素是一種重要的抗病毒和抗腫瘤治療藥物。目前我國在臨床使用最廣泛的主要是重組人干擾素α1b、α2a和α2b。
另外，研究顯示，人α干擾素的I型家族有20多個基因成員，其中大部分編碼功能蛋白，彼此在核苷酸水平上有大約90％的同源性。通過基因工程的手段可以產生相當數量的干擾素的衍生物或類似物。目前最引人注目的是美國Amgen公司根據13種α型干擾素的基因序列同源性，設計出的一種全新的蛋白質工程藥物干復津(INFERGEN，IFN-Con 1)，并經美國FDA批準1997年在美國上市，用于治療丙型肝炎，其抗病毒活性是α2b干擾素的5-10倍。我公司(北京三元基因工程有限公司)已經用體外同源重組方法得到多種α族干擾素分子，在活性和穩定性方面比干復津有更大優勢，這部分工作已經申報專利，公開號CN1511849A。
但是，無論是干擾素α1b、α2a、α2b還是干復津，作為蛋白質性藥物，由于穩定性差，血漿清除率高，體內半衰期短，易產生抗原抗體反應等，在臨床治療中受到很大的限制。基因工程技術使大規模合成人重組蛋白成為可能，很大程度上解決了異源蛋白引起的免疫原性問題，卻仍然無法克服血漿清除快和生物利用度低等缺點，這些缺點造成的結果是需頻繁注射干擾素才能達到有效的血漿治療濃度；而且，每次注射后均會導致血藥濃度的較大波動形成藥物濃度的峰值與谷值。這樣就可能增加了治療費用以及給藥不便和不良反應的風險。因此，人們試圖采用各種藥物傳遞技術(Drug Delivery Technology)，來提高蛋白質藥物的療效。而目前在藥物傳遞技術中研究最為廣泛的是聚乙二醇修飾技術(PEGNOLOGY)。
聚乙二醇修飾蛋白質的技術是近十幾年來發展起來的一種用于改進蛋白質類藥物體內藥動學性質的新技術。它是將活化的聚乙二醇分子[Poly(ethylene glycol)，PEG]鍵合到蛋白質分子表面上，從而影響蛋白質的空間結構，最終導致蛋白質各種生物化學性質的改變，如化學穩定性增加，抵抗蛋白酶水解的能力提高，免疫原性和毒性降低或消失，體內半衰期延長，血漿清除率降低等等。
PEG組分是由氧乙烯單體聚合而成的惰性長鏈的兩性分子。現在已有多種不同的PEG分子可供利用。被活化的PEG其活性功能基團可以被聯結到治療分子的某特殊部位(比如胺、巰基或其他親核物質)。在大多數情況下，PEG衍生物的共價鍵聯結的是利用賴氨酸的氨基和多肽分子的N-末端作為修飾部位，每一個連接部位決定一種不同的同種型(isotype)。在藥物研發過程中，PEG同種型的分布具有重要意義。由于產品的生物學活性與特定同種型分布的混合物有密切關系，產品必須按分布要求來定義。必須證明在整個藥物開發過程中，包括生產過程改變和按比例放樣時PEG同種型分布的一致性。在實際生產中，這給產品的工藝控制和質量評價帶來很大困難。
定點修飾則可以避免以上種種麻煩，在蛋白質特定位點進行修飾可獲得高特異性修飾產物，可以有效控制修飾產物的純度，使工藝更簡單并且產品質量也更易評價，因此受到越來越多的重視。利用分子內的半胱氨酸(Cys)位點可以對蛋白質進行高選擇性修飾。帶有游離巰基的蛋白質為數不多，但卻是維持蛋白空間結構的重要共價鍵，在此位點的化學修飾常會導致分子結構的較大破壞，使蛋白活性喪失。采用基因工程的手段可以實現這一目的。值得注意的是，不同的蛋白質或多肽結構和性質不同，究竟能不能引進及在什麼位點引進存在差異。通過基因工程途徑人為增加的Cys，會因形成分子內錯配或分子間結合，導致分子不穩定或形成非正常聚合體。在這方面，全面的序列分析和準確的分子結構模擬將會提供思路。
序列分析發現包括干擾素α2a、α2b和IFN-con 1在內的絕大多數α干擾素分子內都有四個半胱氨酸，其中1和99位Cys、29和139位Cys之間形成二硫鍵。本公司前期通過體外同源重組獲得的新型干擾素(MIFN)也保持了這一特點。IFN-α1b在結構上和α族其他干擾素有明顯不同，前者除了具有上述4個Cys形成正常二硫鍵之外，在第86位有第5個Cys，小試發現，利用該位點可以對干擾素進行定點修飾。但相對其他α族干擾素而言，IFN-α1b本身的生物活性較低，僅約為一般α干擾素的1/10，IFN-α1b在經PEG修飾后又會進一步降低其比活性，因此IFN-α1b的PEG偶聯物作為藥物的臨床使用價值不大。
本公司結合IFN-α1b的特點改造α族其他干擾素，將IFN-Con 1和MIFN的86位、IFN-α2a及α2b的第85位(不包括序列前的起始氨基酸----甲硫氨酸或甲酰甲硫氨酸)替換為一個Cys，并利用PEG進行定點修飾，獲得高特異性的干擾素α突變體聚乙二醇衍生物。這種衍生物在具有譬如穩定、水溶性好、抗原性低等PEG化蛋白的一般性優點之外，尤其具有生物活性高的特點(相對與PEG-IFN-α1b)，為以后的臨床應用打好基礎。
本發明制備了新的干擾素分子及其聚乙二醇衍生物，為科學研究和臨床治療提供了新的藥物分子，也為蛋白質改造和PEG定點修飾提供新的方法和思路。
發明內容
本發明提供四種干擾素α突變體MIFNCys86、IFN-Con 1Cys86、IFNα-2aCys85及IFNα-2bCys85(氨基酸序列見附錄SEQ ID NO.1-4)，系對四種現有的干擾素MIFN、IFN-Con 1、IFNα-2a及IFNα-2b進行定點突變，將86(MIFN和IFN-Con 1)或85(IFNα-2a和IFNα-2b)位氨基酸替換為Cys而得。利用體外定點突變的技術，分別對目的基因進行重組，將獲得重組基因插入表達載體pET-23b中，獲得了可編碼重組蛋白的重組質粒。四種重組子分別在大腸桿菌BL21(DE3)受體細胞中高效穩定的表達，表達產物以包涵體形式存在，表達量占菌體總蛋白的30％以上。MIFNCys86及IFN-Con 1Cys86的純化依次采用了疏水層析、DEAE陰離子交換層析和S-100凝膠排阻層析三步純化工藝，可以得到高純度的MIFNCys86及IFN-Con 1Cys86；IFNα-2aCys85及IFNα-2bCys85的純化依次采用了DEAE陰離子交換層析、單抗親和層析和S-100凝膠排阻層析三步純化工藝，可以得到高純度的IFNα-2aCys85及IFNα-2bCys85。
本發明提供多種干擾素α突變體聚乙二醇衍生物，其中干擾素α突變體系指MIFNCys86、IFN-Con 1Cys86、IFNα-2aCys85及IFNα-2bCys85；其中聚乙二醇可以是直鏈或有分支結構，平均分子量為約20KD和約40KD。
本發明還提供四種干擾素α突變體聚乙二醇衍生物的制備和純化方法。
本發明最后提供了四種干擾素α突變體聚乙二醇衍生物體外藥效和藥代試驗的方法和結果，提示其在治療或預防免疫調節紊亂如腫瘤疾病或傳染病方面的應用中有更好的技術參數。
本附圖用來說明本發明的具體實施例，而不限制本發明的保護范圍。
圖1表示“MIFNCys86的基因構建和擴增”中兩輪PCR產物的瓊脂糖電泳圖譜(實施例1A)。1泳道為DNA marker；2泳道為首輪PCR中反應體系1的產物；3泳道為首輪PCR中反應體系2的產物；4泳道為第二輪PCR產物。
圖2表示“MIFNCys86重組質粒的構建、轉化和鑒定”中陽性克隆作為模板PCR產物的瓊脂糖電泳圖譜(實施例2A)。1泳道為DNA marker；2～8泳道分別為一個單菌落的PCR產物，其中2、4、5、6、7、8為陽性克隆。
圖3表示四種突變體重組質粒的Nde I/EcoR I雙酶切電泳圖譜(實施例2A～2D)。1泳道為DNA marker；2泳道為pET-23b質粒載體；3、7泳道分別為Nde I/EcoR I酶切前后MIFNCys86的重組質粒；4、8泳道分別為Nde I/EcoR I酶切前后IFN-Con 1Cys86的重組質粒；5、9泳道分別為Nde I/EcoR I酶切前后IFNα-2aCys85的重組質粒；6、10泳道分別為Nde I/EcoR I酶切前后IFNα-2bCys85的重組質粒。
圖4表示純化的MIFNCys86、IFN-Con 1Cys86、IFNα-2aCys85及IFNα-2bCys85的SDS-PAGE圖譜(實施例3A～3D)。1泳道為蛋白marker；2、3、4、5泳道分別為純化的MIFNCys86、IFN-Con 1Cys86、IFNα-2aCys85及IFNα-2bCys85。
圖5表示MIFNCys86、IFN-Con 1Cys86、IFNα-2aCys85及IFNα-2bCys85與PEG-MAL(20KD)偶聯反應的SDS-PAGE圖譜(實施例4)。1泳道為蛋白marker；2、3、4、5泳道分別為MIFNCys86、IFN-Con 1Cys86、IFNα-2aCys85及IFNα-2bCys85與PEG-MAL(20KD)偶聯反應的產物。
圖6表示MIFNCys86、IFN-Con 1Cys86、IFNα-2aCys85及IFNα-2bCys85與PEG-MAL(40KD)偶聯反應的SDS-PAGE圖譜(實施例4)。1泳道為蛋白marker；2、3、4、5泳道分別為MIFNCys86、IFN-Con 1Cys86、IFNα-2aCys85及IFNα-2bCys85與PEG-MAL(40KD)偶聯反應的產物。
圖7表示純化的4種干擾素α突變體的PEG-MAL(20KD)衍生物的SDS-PAGE圖譜(實施例5)。1泳道為蛋白marker；2、3、4、5分別泳道為mPEG(20KD)-MIFNCys86、mPEG(20KD)-IFN-Con 1Cys86、mPEG(20KD)-IFNα-2aCys85及mPEG(20KD)-IFNα-2bCys85。
圖8表示純化的4種干擾素α突變體的PEG-MAL(40KD)衍生物的SDS-PAGE圖譜(實施例5)。1泳道為蛋白marker；2、3、4、5分別泳道為mPEG(40KD)-MIFNCys86、mPEG(40KD)-IFN-Con 1Cys86、mPEG(40KD)-IFNα-2aCys85及mPEG(40KD)-IFNα-2bCys85。
具體實施例方式
除非特殊定義，本文描述所用的術語是在有關技術領域中公知的術語。標準的化學符號及縮寫符號可以與其全名互換使用。例如“PEG”和“聚乙二醇”具有相同的含義；“干擾素α”、“IFN-α”及“α干擾素”含義也相同。
除非特殊指明，本文所用到但未明確闡述或簡單闡述的技術和方法是指本技術領域通常使用的技術和方法，可以一般的按照本領域公知的技術和方法進行。試劑盒的使用是根據制造商或供應商提供的說明書進行。
本發明MIFN、IFN-Con 1、IFNα-2a及IFNα-2b四種蛋白的類似物可以通過氨基酸功能等效分子的取代、添加或缺失來獲得，如在本技術領域公知，用性質類似的一個或多個氨基酸殘基取代原序列內相應的氨基酸殘基改變原蛋白質序列，形成沉默改變。
本發明中聚乙二醇衍生物的聚乙二醇部分，如本領域技術人員公知，可以具有直鏈或分支結構。是一種巰基反應PEG化試劑，能夠和半胱氨酸殘基的巰基發生反應。本發明嘗試用分子量約5000、10000、12000、20000、30000和40000道爾頓的PEG對四種α干擾素突變體進行修飾，均可以獲得PEG-干擾素的衍生物。資料顯示PEG化蛋白的半衰期隨著PEG分子量的增大有不同程度延長。本發明實施例中用20000和40000道爾頓的PEG作為低、高分子量的代表具體闡述PEG-干擾素衍生物的制作純化方法及藥效、藥代試驗。
在優選的實施例中，PEG化試劑是Nektar Therapeutics提供的mPEG-MAL[也寫做PEG-MAL(20KD)]或mPEG2-MAL[也寫做PEG-MAL(40KD)]，文中mPEG-MAL和mPEG2-MAL有時也一般性的簡寫為PEG-MAL或PEG。
本發明中MIFN、IFN-Con 1、IFNα-2a及IFNα-2b四種α干擾素的工程菌由北京三元基因工程有限公司提供。
下面實施例將進一步解釋本發明。
實施例1A MIFNCys86的基因構建和擴增采用PCR體外定點突變技術(PCR-SDM)，以重疊延伸的手段進行定點突變。定點突變技術已經比較成熟，程序比較固定。可以根據具體試驗調整的是引物的位置長度和PCR的反應條件，在實際操作中可以有多種組合，都可以達到定點突變的目的，均涵蓋在本發明的保護范圍之內。本實施例所列為優選方案(同樣原因，實施例1B～1D所列也為優選方案)。
設計兩對引物，上游引物P1為T7 promoter primer(taatacgactcactataggg)，P3序列為ggaaaaattctgcaccgaactgt；下游引物P2為T7 terminator primer(gctagttattgctcagcgg)，P4序列為acagttcggtgcagaatttttcc。突變位點包含在P3和P4之中。
提取MIFN的質粒作為模板，首輪PCR包括兩個反應體系反應體系1引物為P1、P4，擴增突變位點及其上游的DNA序列；反應體系2引物為P2、P3，擴增突變位點及其下游的DNA序列。反應條件為94℃ 4min、94℃ 1min，然后55℃ 2min、72℃ 2min共30個循環。第二輪PCR為重疊延伸PCR，以首輪PCR的產物為模板，以P1、P2為引物進行PCR擴增。反應條件為94℃ 4min、94℃ 1min，然后56℃ 2min、72℃ 2min共30個循環。圖1表示兩輪PCR產物的瓊脂糖電泳圖譜。
第二輪PCR產物經瓊脂糖電泳分析，選擇720bp左右的DNA片段，用Nde I/EcoR I雙酶切，電泳回收500bp左右的目的DNA片段備用。
實施例1B IFN-Con 1Cys86的基因構建和擴增設計兩對引物，上游引物P1為T7 promoter primer(taatacgactcactataggg)，P3序列為ggataaattctgcaccgaactgt；下游引物P2為T7 terminator primer(gctagttattgctcagcgg)，P4序列為acagttcggtgcagaatttatcc。突變位點包含在P3和P4之中。
PCR反應程序同實施例1A，不同之處是本實施例中首輪PCR反應模板為IFN-Con 1的質粒。第二輪PCR產物經瓊脂糖電泳分析，選擇720bp左右的DNA片段，用Nde I/EcoR I雙酶切，電泳回收500bp左右的目的DNA片段備用。
實施例1C IFN α-2aCys85的基因構建和擴增引物設計同實施例1B，PCR反應程序同實施例1A，不同之處是本實施例中首輪PCR反應模板為IFNα-2a的質粒。第二輪PCR產物經瓊脂糖電泳分析，選擇720bp左右的DNA片段，用Nde I/EcoR I雙酶切，電泳回收500bp左右的目的DNA片段備用。
實施例1D IFNα-2bCys85的基因構建和擴增引物設計同實施例1B，PCR反應程序同實施例1A，不同之處是本實施例中首輪PCR反應模板為IFNα-2b的質粒。第二輪PCR產物經瓊脂糖電泳分析，選擇720bp左右的DNA片段，用Nde I/EcoR I雙酶切，電泳回收500bp左右的目的DNA片段備用。
實施例2A MIFNCys86重組質粒的構建、轉化和鑒定在重組質粒的構建和轉化中，雙酶往往可以有多種選擇，連接反應的條件也可以有所變化，都可以完成重組質粒的構建；本實施例中宿主細胞選擇了實驗室常用的JM109和DH5α，并不排斥用其他宿主進行轉化。本著科學、方便和快捷的原則，本實施例所列重組質粒的構建、轉化和鑒定方案為優選方案(同樣原因，實施例2B～2D所列也為優選方案)。
將pET-23b質粒載體用Nde I/EcoR I雙酶切，經瓊脂糖電泳回收并和實施例1A中最后回收的目的DNA片段連接。連接反應條件為2×Rapid buffer 4～5μl、T4 DNA Ligase 1μl、目的片段1～2μl、載體3μl，4℃過夜連接。
制備JM109或DH5α感受態細胞，轉化上述連接產物，涂布氨芐平板，37℃過夜培養。
挑取單菌落作為模板，用本發明實施例1A中設計的引物P1、P2進行PCR擴增，擴增產物經瓊脂糖電泳(電泳圖譜如圖2所示)，陽性克隆應在720bp左右出現特異條帶。取陽性克隆小量培養，提取質粒用Nde I/EcoR I雙酶切，分別在3kb左右和500bp左右出現特異的條帶(瓊脂糖電泳圖譜如圖3所示)，與預計情況相符，初步說明重組質粒構建成功。為了進一步確認其序列，以T7通用引物通過ABI377測序儀進行全自動序列測定。
實施例2B IFN-Con 1Cys86重組質粒的構建、轉化和鑒定本實施例中連接的基因片段為實施例1B回收的目的基因片段。連接、轉化及鑒定操作中用到的技術和方法與實施例2A完全相同。Nde I/EcoR I酶切鑒定電泳圖譜如圖3所示。為確認序列，同樣以T7通用引物通過ABI377測序儀進行全自動序列測定。
實施例2C IFNα-2aCys85重組質粒的構建、轉化和鑒定本實施例中連接的基因片段為實施例1C回收的目的基因片段。連接、轉化及鑒定操作中用到的技術和方法與實施例2A完全相同。Nde I/EcoR I酶切鑒定電泳圖譜如圖3所示。為確認序列，同樣以T7通用引物通過ABI377測序儀進行全自動序列測定。
實施例2D IFNα-2bCys85重組質粒的構建、轉化和鑒定本實施例中連接的基因片段為實施例1D回收的目的基因片段。連接、轉化及鑒定操作中用到的技術和方法與實施例2A完全相同。Nde I/EcoR I酶切鑒定電泳圖譜如圖3所示。為確認序列，同樣以T7通用引物通過ABI377測序儀進行全自動序列測定。
實施例3A MIFNCys86的表達和純化將實施例2A中得到的重組質粒轉化大腸桿菌BL21(DE3)或其他適宜宿主，誘導表達。以大腸桿菌BL21(DE3)作為宿主時表達的MIFNCys86約占菌體總蛋白的30～50％，主要以包涵體形式存在。
粗純將發酵收集的菌體以TE溶解，超聲破菌后收集包涵體，然后用6～8mol/L的Gu·HCl或尿素溶解，室溫攪拌或4℃放置過夜，再用濃度為0.05～0.2mol/L、pH8.0～10.5的硼酸復性，復性液置4℃過夜。4℃離心取上清，即為粗純的MIFNCys86。
精純依次采用了疏水層析、DEAE陰離子交換層析和S-100凝膠排阻層析三步純化工藝。具體步驟如下將復性液稀釋成含10％～30％(NH4)2SO4的溶液上樣到Phenyl Sepharose層析柱，用兩個柱體積的10％～30％(NH4)2SO4沖洗，然后用15％～35％乙二醇進行洗脫，收集洗脫峰組分用A液(10～80mmol/L Tris-HCl pH7.5～10.5)充分透析；將透析后的洗脫液上樣到用A液充分平衡的DEAE Sepharose FF層析柱，然后用B液(含0.2～0.4mol/LNaCl的A液)進行洗脫，收集洗脫峰組分；將DEAE Sepharose FF離子交換層析的洗脫峰組分上樣到用C液(20～40mmol/L PB+20～40mmol/L NaCl Ph6.5～7.5)充分平衡好的Sephacryl S-100層析柱，用C液沖洗，收集洗脫峰組分。經以上純化流程后，最后得到的MIFNCys86純度在95％以上(SDS-PAGE圖譜如圖4所示)。
實施例3B IFN-Con 1Cys86的表達和純化將實施例2B中得到的重組質粒轉化大腸桿菌BL21(DE3)或其他適宜宿主，誘導表達。以大腸桿菌BL21(DE3)作為宿主時表達的IFN-Con 1Cys86約占菌體總蛋白的30～50％，主要以包涵體形式存在。
本實施例純化方法和步驟與實施例3A完全相同。最后得到的IFN-Con 1Cys86純度在95％以上(SDS-PAGE圖譜如圖4所示)。
實施例3C IFN α-2aCys85的表達和純化將實施例2C中得到的重組質粒轉化大腸桿菌BL21(DE3)或其他適宜宿主，誘導表達。以大腸桿菌BL21(DE3)作為宿主時表達的IFNα-2aCys85約占菌體總蛋白的30～50％，主要以包涵體形式存在。
粗純本實施例所用到的粗純方法與實施例3A相同。
精純依次采用了DEAE陰離子交換層析、單抗親和層析和S-100凝膠排阻層析三步純化工藝。具體方法將復性液以30mmol/LTris-HCl(pH8.0)稀釋10倍上樣到DEAESepharose FF離子交換層析柱，用含0.3mol/L NaCl的30mmol/L Tris-HCl(pH7.0)溶液洗脫，收集洗脫峰；將上一步洗脫樣品經PBS(pH7.0)3倍稀釋，上樣到IFNα-2a單抗層析柱，以含100mmol/L NaCl的0.3mol/L Gly溶液(pH2.5)洗脫，收集洗脫峰；再將上一步洗脫樣品上樣到Sephacryl S-100層析柱，以PBS(pH7.0)洗脫。最后得到的IFNα-2aCys85純度在95％以上(SDS-PAGE圖譜如圖4所示)。
實施例3D IFNα-2bCys85的表達和純化將實施例2D中得到的重組質粒轉化大腸桿菌BL21(DE3)或其他適宜宿主，誘導表達。以大腸桿菌BL21(DE3)作為宿主時表達的IFNα-2bCys85約占菌體總蛋白的30～50％，主要以包涵體形式存在。
粗純本實施例所用到的粗純方法與實施例3A相同。
精純依次采用了DEAE陰離子交換層析、單抗親和層析和S-100凝膠排阻層析三步純化工藝。具體方法將復性液以30mmol/L Tris-HCl(pH8.0)稀釋10倍上樣到DEAESepharose FF離子交換層析柱，用含0.3mol/L NaCl的30mmol/L Tris-HCl(pH7.0)溶液洗脫，收集洗脫峰；將上一步洗脫樣品經PBS(pH7.0)3倍稀釋，上樣到IFNα-2b單抗層析柱，以含100mmol/L NaCl的0.3mol/L Gly溶液(pH2.5)洗脫，收集洗脫峰；再將上一步洗脫樣品上樣到Sephacryl S-100層析柱，以PBS(pH7.0)洗脫。最后得到的IFNα-2bCys85純度在95％以上(SDS-PAGE圖譜如圖4所示)。
實施例4 MIFNCys86、IFN-Con 1Cys86、IFNα-2aCys85及IFNα-2bCys85的PEG偶聯本發明四種干擾素α突變體可以和各種分子量的PEG偶聯，在優選實施例中，PEG有兩種mPEG-MAL和mPEG2-MAL，平均分子量分別約為20KD、40KD。
1)MIFNCys86、IFN-Con 1Cys86、IFNα-2aCys85及IFNα-2bCys85的濃縮以上四種干擾素α突變體可以分別用DEAE Sepharose FF層析柱進行濃縮。具體方法如下將實施例3A～3D其中之一純化的蛋白樣品以10～80mmol/L Tris-HCl pH7.5～8.5溶液稀釋2倍或以上，上樣到DEAE層析柱，然后用20mmol/L PB緩沖液(pH7.6)+300mmol/L NaCl的洗脫得到目的蛋白的濃縮液。
2)MIFNCys86、IFN-Con 1Cys86、IFNα-2aCys85及IFNα-2bCys85與mPEG-MAL的偶聯
MIFNCys86、IFN-Con 1Cys86、IFNα-2aCys85及IFNα-2bCys85與mPEG(20KD)-MAL偶聯反應，其單PEG衍生物分別寫做mPEG(20KD)-MIFNCys86、mPEG(20KD)-IFN-Con 1Cys86、mPEG(20KD)-IFNα-2aCys85及mPEG(20KD)-IFNα-2bCys85。
MIFNCys86、IFN-Con 1Cys86、IFNα-2aCys85及IFNα-2bCys85與mPEG(40KD)-MAL偶聯反應，其單PEG衍生物分別寫做mPEG(40KD)-MIFNCys86、mPEG(40KD)-IFN-Con 1Cys86、mPEG(40KD)-IFNα-2aCys85及mPEG(40KD)-IFNα-2bCys85。
偶聯反應步驟具體如下取本實施例步驟1中適量體積的濃縮液，調整蛋白濃度到8～12mg/ml，加入摩爾比為1∶1的PEG粉末，輕輕搖動使粉末溶解后于4℃反應過夜，即反應時間應超過10小時。SDS-PAGE檢測反應的偶聯程度(圖5-6所示)。
實施例5 干擾素α突變體衍生物的純化采用DEAE Sepharose Fast Flow離子交換層析對修飾產物進行純化，具體條件如下采用25mmol pH8.0 Tris緩沖體系將反應液稀釋20～30倍后，以流速為3～4ml/min上樣于平衡過的DEAE柱，待基線平衡后，用含NaCl濃度為80mM的25mM pH8.0 Tris洗脫液洗脫得到目的蛋白的洗脫峰。最后得到的重組蛋白純度都在95％以上(SDS-PAGE圖譜如圖7-8所示)。
實施例6 通過WISH-VSV系統測定4種α干擾素、突變體及突變體聚乙二醇衍生物的體外抗病毒活性采用細胞病變抑制法通過WISH-VSV系統測定干擾素的體外抗病毒活性，是本技術領域公知的方法，具體參照2005版《中華人民共和國藥典》三部附錄X C“干擾素的生物活性測定”。
本實施例測定了16種干擾素(或衍生物)的體外抗病毒活性，具體包括4種α干擾素MIFN、IFN-Con 1、IFNα-2a和IFNα-2b；4種α干擾素的突變體MIFNCys86、IFN-Con 1Cys86、IFNα-2aCys85及IFNα-2bCys85(本發明實施例3A～3D制備)；還有8種聚乙二醇衍生物mPEG(20KD)-MIFNCys86、mPEG(20KD)-IFN-Con 1Cys86、mPEG(20KD)-IFNα-2aCys85、mPEG(20KD)-IFNα-2bCys85、mPEG(40KD)-MIFNCys86、mPEG(40KD)-IFN-Con 1Cys86、mPEG(40KD)-IFNα-2aCys85及mPEG(40KD)-IFNα-2bCys85(本發明實施例5制備)。
其體外抗病毒活性測定結果見下述表1～4。
表1MIFN、MIFNCys86、mPEG(20KD)-MIFNCys86及mPEG(40KD)-MIFNCys86的體外抗病毒活性
表2IFN-Con 1、IFN-Con 1Cys86、mPEG(20KD)-IFN-Con 1Cys86及mPEG(40KD)-IFN-Con1Cys86的體外抗病毒活性
表3IFNα-2a、IFNα-2aCys85、mPEG(20KD)-IFNα-2aCys85及mPEG(40KD)-IFNα-2aCys85的體外抗病毒活性
表4IFNα-2b、IFNα-2bCys85、mPEG(20KD)-IFNα-2bCys85及mPEG(40KD)-IFNα-2bCys85的體外抗病毒活性
實施例7 大鼠藥代動力學研究通過本實施例表5所示的藥代動力學研究方案測定了12種干擾素(或衍生物)的體外抗病毒活性，具體包括4種α干擾素的突變體MIFNCys86、IFN-Con 1Cys86、IFNα-2aCys85及IFNα-2bCys85(本發明實施例3A～3D制備)；8種聚乙二醇衍生物mPEG(20KD)-MIFNCys86、mPEG(20KD)-IFN-Con 1Cys86、mPEG(20KD)-IFNα-2aCys85、mPEG(20KD)-IFNα-2bCys85、mPEG(40KD)-MIFNCys86、mPEG(40KD)-IFN-Con 1Cys86、mPEG(40KD)-IFNα-2aCys85及mPEG(40KD)-IFNα-2bCys85(本發明實施例5制備)。
表5藥代動力學研究方案
在上述試驗方案中，從大鼠眼底收集血樣，然后離心分離收集血清，用CPE法(WISH/VSV系統)檢測血清樣品中干擾素含量。
表6MIFNCys86及其PEG衍生物的藥代動力學參數表
經3P87軟件擬合發現MIFNCys86及其PEG衍生物在SD大鼠體內的代謝規律符合一級吸收的一房室模型。PEG化可顯著改善MIFNCys86的藥代動力學性質，與MIFNCys86相比，mPEG-MIFNCys86的吸收半衰期、達峰時間、消除半衰期顯著延長；藥時曲線下面積顯著增加；清除率顯著降低。可見，PEG化可以延長MIFNCys86的體內平均存留時間，降低清除率。
在IFN-Con 1Cys86及其PEG衍生物、IFNα-2aCys85及其PEG衍生物、IFNα-2bCys85及其PEG衍生物的藥代動力學試驗中也有同樣發現，即與修飾前相比，PEG化的干擾素的吸收半衰期、達峰時間、消除半衰期顯著延長；藥時曲線下面積顯著增加；清除率顯著降低。
由此證明，PEG化可以延長干擾素的體內平均存留時間，降低清除率。
至此，已經對本發明進行了較為充分的描述。優選的實施例只能闡述而不限制本發明，對于本領域的技術人員來說，實現本發明的方法和手段可以變化和改進，均應涵蓋在本發明的保護范圍之內。
后面附氨基酸和核苷酸的序列表，其中IFN-Con 1、IFNα-2a和IFNα-2b的核苷酸序列為公知序列，在本發明的具體實施例中只是把相應位點的密碼子突變成tgc，因此本發明未附IFN-Con 1Cys86、IFNα-2bCys85和IFNα-2bCys85的DNA序列。
附序列表序列表1為MIFNCys86的氨基酸序列；序列表2為IFN-Con 1Cys86的氨基酸序列；序列表3為IFNα-2aCys85的氨基酸序列；序列表4為IFNα-2bCys85的氨基酸序列；序列表5為MIFNCys86的DNA序列；
序列表1MIFNCys86的氨基酸序列序列長度166個氨基酸序列描述SEQ ID NO.1Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly Ser Arg Arg Thr Leu1 5 10 15Ile Leu Leu Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser Pro Phe Ser Cys Leu20 25 30Lys Asp Arg His Asp Phe Pro Phe Pro Gln Glu Glu Phe Asp Gly35 40 45Asn Gln Phe Gln Lys Ala Gln Ala Ile Ser Val Leu His Glu Met50 55 60Ile Gln Gln Thr Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala65 70 75Ala Trp Asp Glu Ser Leu Leu Glu Lys Phe Cys Thr Glu Leu Tyr80 85 90Gln Gln Leu Asn Asp Leu Glu Ala Cys Val Ile Gln Glu Val Gly95 100 105Val Glu Glu Thr Pro Leu Met Asn Val Asp Ser Ile Leu Ala Val110 115 120Lys Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr Leu Tyr Leu Thr Glu Lys Lys125 130 135Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val Arg Ala Glu Ile Met Arg140 145 150Ser Phe Ser Leu Ser Thr Asn Leu Gln Glu Arg Leu Arg Arg Lys155 160 165Asp166
序列表2IFN-Con 1Cys86的氨基酸序列序列長度166個氨基酸序列描述SEQ ID NO.2Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly Asn Arg Arg Ala Leu1 5 10 15Ile Leu Leu Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser Pro Phe Ser Cys Leu20 25 30Lys Asp Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Gln Glu Glu Phe Asp Gly35 40 45Asn Gln Phe Gln Lys Ala Gln Ala Ile Ser Val Leu His Glu Met50 55 60Ile Gln Gln Thr Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala65 70 75Ala Trp Asp Glu Ser Leu Leu Asp Lys Phe Cys Thr Glu Leu Tyr80 85 90Gln Gln Leu Asn Asp Leu Glu Ala Cys Val Ile Gln Glu Val Gly95 100 105Val Glu Glu Thr Pro Leu Met Asn Val Asp Ser Ile Leu Ala Val110 115 120Lys Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr Leu Tyr Leu Thr Glu Lys Lys125 130 135Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val Arg Ala Glu Ile Met Arg140 145 150Ser Phe Ser Leu Ser Thr Asn Leu Gln Glu Arg Leu Arg Arg Lys155 160 165Asp166
序列表3IFNα-2aCys85的氨基酸序列序列長度165個氨基酸序列描述SEQ ID NO.3Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly Ser Arg Arg Thr Leu1 5 10 15Met Leu Leu Ala Gln Met Arg Lys Ile Ser Leu Phe Ser Cys Leu20 25 30Lys Asp Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Gln Glu Glu Phe Gly Asn35 40 45Gln Phe Gln Lys Ala Glu Thr Ile Pro Val Leu His Glu Met Ile50 55 60Gln Gln Ile Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala65 70 75Trp Asp Glu Thr Leu Leu Asp Lys Phe Cys Thr Glu Leu Tyr Gln80 85 90Gln Leu Asn Asp Leu Glu Ala Cys Val Ile Gln Gly Val Gly Val95 100 105Thr Glu Thr Pro Leu Met Lys Glu Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg110 115 120Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr Leu Tyr Leu Lys Glu Lys Lys Tyr125 130 135Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser140 145 150Phe Ser Leu Ser Thr Asn Leu Gln Glu Ser Leu Arg Ser Lys Glu155 160 165
序列表4IFNα-2bCys85的氨基酸序列序列長度165個氨基酸序列描述SEQ ID NO.4Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly Ser Arg Arg Thr Leu1 5 10 15Met Leu Leu Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser Leu Phe Ser Cys Leu20 25 30Lys Asp Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Gln Glu Glu Phe Gly Asn35 40 45Gln Phe Gln Lys Ala Glu Thr Ile Pro Val Leu His Glu Met Ile50 55 60Gln Gln Ile Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala65 70 75Trp Asp Glu Thr Leu Leu Asp Lys Phe Cys Thr Glu Leu Tyr Gln80 85 90Gln Leu Asn Asp Leu Glu Ala Cys Val Ile Gln Gly Val Gly Val95 100 105Thr Glu Thr Pro Leu Met Asn Glu Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg110 115 120Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr Leu Tyr Leu Lys Glu Lys Lys Tyr125 130 135Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser140 145 150Phe Ser Leu Ser Thr Asn Leu Gln Glu Ser Leu Arg Ser Lys Glu155 160 165
序列表5NIFN的核苷酸序列序列長度507bp序列描述SEQ ID NO.5atgtgtgacc tgccgcagac ccactctctg ggttctcgtc gtaccctgat cctgctggct 60cagatgcgtc gtatctctcc gttctcttgc ctgaaagacc gtcacgactt cggtttcccg 120caggaagagt tcgacggtaa ccagttccag aaagctcagg ctatctctgt tctgcacgaa 180atgatccagc agaccttcaa cctgttctct accaaagact cttctgctgc ttgggacgaa 240tctctgctgg aaaaattcta caccgaactg taccagcagc tgaacgacct ggaagcatgc 300gttatccagg aagttggtgt tgaagaaacc ccgctgatga acgttgactc tatcctggtt 360gttaaaaaat acttccagcg tatcaccctg tacctgaccg aaaaaaaata ctctccgtgt 420gcttgggaag ttgttcgtgc tgaaatcatg cgttctttct ctctgtctac caacctgcag 480gaacgtctgc gtcgtaaaga ctaatag 50權利要求
1.四種干擾素α突變體，其特征在于其氨基酸有SEQ ID NO.1-4表示的序列。
2.四種核苷酸序列，其特征在于編碼權利要求1所述的氨基酸。
3.四種干擾素α突變體的聚乙二醇衍生物，其特征在于聚乙二醇修飾權利要求1所述的蛋白。
4.根據權利要求3所述的聚乙二醇衍生物，其特征在于蛋白的修飾位點為第85～86位上任一位點的半胱氨酸殘基。
5.根據權利要求1所述的干擾素α包括新型干擾素(MIFN)、集成干擾素(IFN-Con 1)、干擾素α-2a(IFN α-2a)及干擾素α-2b(IFN α-2b)。
6.根據權利要求1所述的干擾素α包括MIFN、IFN-Con 1、IFN α-2a及IFN α-2b四種蛋白的突變體、衍生物、類似物、生物活性或藥用活性的活性片段。
7.根據權利要求5或權利要求6所述的MIFN系本公司構建的新型于擾素分子，專利公開號CN 1511849A。
8.根據權利要求3所述的干擾素α突變體的聚乙二醇衍生物，其特征在于其中聚乙二醇具有直鏈或分支結構。
9.根據權利要求3所述的干擾素α突變體的聚乙二醇衍生物，其特征在于其中聚乙二醇部分的平均分子量為約5000道爾頓-約60000道爾頓。
10.一種制備干擾素α突變體的聚乙二醇衍生物的方法，包括以下步驟a)制備濃縮的干擾素α突變體溶液；b)聚乙二醇與步驟(a)所述干擾素α突變體偶聯反應；c)干擾素α突變體的聚乙二醇衍生物的純化提取。
11.藥物組合物，其包含根據權利要求3所述的干擾素α突變體的聚乙二醇衍生物。
12.根據權利要求11所述的藥物組合物，其特征在于該藥物組合物可以用于治療或預防病毒性感染或腫瘤等疾病。
全文摘要
本發明提供了干擾素α突變體及其聚乙二醇衍生物，其中聚乙二醇共價結合于干擾素α突變體的游離半胱氨酸(Cys)殘基。本發明還提供了干擾素α突變體及其聚乙二醇衍生物的制備方法及用途。本發明的技術手段包括1.通過序列分析，結合干擾素α1b的結構特點，對現有的四個干擾素分子新型干擾素(MIFN)、集成干擾素(IFN－Con 1)、干擾素α－2a(IFNα－2a)及干擾素α－2b(IFNα－2b)進行改造，把86或85位的氨基酸替換成Cys并使之高效表達，建立新分子的純化方法，用WISH/VSV法測定其生物活性；2.對新構建的分子進行聚乙二醇(PEG)修飾，并對修飾后的產物建立純化工藝；3.干擾素α突變體聚乙二醇衍生物的體外抗病毒活性檢測；4.干擾素α突變體聚乙二醇衍生物的藥代動力學試驗。
文檔編號A61K47/48GK1970572SQ200610167660
公開日2007年5月30日 申請日期2006年12月21日 優先權日2006年12月21日
發明者劉金毅, 牛曉霞, 周敏毅, 楊軼, 孫儉波, 程永慶 申請人:北京三元基因工程有限公司, 北京畢艾歐科技發展有限責任公司