專利名稱：：顯示mcsp的表面表達的細胞的細胞毒性介導的制作方法
技術領域：
：本發明涉及癌性疾病的診斷和治療，具體涉及腫瘤細胞的細胞毒性的介導；最具體地涉及使用癌性疾病調節抗體(CDMAB),可選地與一種或多種化療劑組合，作為手段來引發細胞毒性反應。本發明進一步涉及〗吏用本發明的CDMAB的結合測定。
背景技術：
：黑色素瘤相關硫酸軟骨素蛋白聚糖(MSCP)是由開發了針對人類轉移黑色素瘤細胞系的單克隆抗體的數位研究者各自獨立地鑒定的。有數種抗體被發現與黑色素瘤細胞表面相關的特定抗體反應。由于這些抗體是相互獨立地開發的，造成目標抗原的名稱多種多樣，后來所有這些名稱都被確定為MCSP。因此，MCSP又被稱為高分子量黑色素瘤相關抗原(HMW-MAA),人黑色素瘤蛋白聚糖(HMP)，黑色素瘤-相關蛋白聚糖抗體(MPG)和黑色素瘤硫酸軟骨素蛋白聚糖(mel-CSPG)，而且還被鑒定為多種特異性抗體的抗原，這些抗體中的一些已在下文中列出。還發現MCSP與大鼠蛋白聚糖NG2有超過80%的同源性，因此也被稱作該名字。MCSP是糖蛋白-蛋白聚糖復合物，由250kDa的N-聯糖蛋白和>450kDa的蛋白聚糖組分構成。核心糖蛋白存在于黑色素瘤細胞表面，或者作為游離的糖蛋白，或者作為附加了硫酸軟骨素的修飾的糖蛋白。通過MSCP的分子克隆鑒定了數種結構特征。存在3個胞外域，其總共含有10個半胱氨酸(5個可能的二硫橋)，15個可能的N-聯糖基化位點，和U個可能的硫酸軟骨素附著位點。跨膜片段具有一個單獨的半胱氨酸，但該殘基功能上的重要性還沒有得到證明。胞質域具有3個蘇氨酸殘基，它們可能充當蛋白激酶C的磷酸化位點，盡管目前尚未顯示MCSP是磷酸化的。已經證實MCSP在大多數黑色素瘤癌中表達，而且原本認為其在正常細胞和其他種類的腫瘤中的分布非常有限。導致這一結論的一項早期的研究對用曱醛或曱醇固定的組織進行免疫組化(IHC)以確定MCSP的分布，其使用了抗MCSP抗體B5。在這項研究中，發現抗體B5與22種被測試的黑色素瘤中的17種反應，與2種星細胞瘤中的2種反應，而不與23種癌中的任何一種反應。在22種被測試的正常組織中，發現B5只與皮膚角質形成細胞、肺泡上皮和毛細血管內皮結合。另外一項研究考察了MSCP的組織分布，其是使用冷凍組織切片由抗MCSP抗體9.2.27來確定的。仍然，在所有被測試的黑色素瘤組織和細胞系中都發現了反應性，但6種不同癌中的任一種中都沒有發現反應性。在被測試的7種胎兒組織中，只有皮膚中觀察到反應性，主動脈中觀察到微弱的反應性，而在成人組織中，在被測的13種組織中只有3種觀察到了反應性。接下來的一項研究使用抗MCSP抗體B5,9.2.27，225.28S和A0122考察了MCSP的分布，所有這些抗體都識別MCSP的獨特表位。這項研究是對冷凍組織進行的。發現所有的抗MCSP抗體都有相似的染色圖案，它們與正常的和惡性的、來源于神經、間質和上皮的腫瘤發生反應，這些腫瘤先前被認為是MSCP陰性的。具體地，抗體B5與24種被測器官中的多種上皮、結締、神經和肌肉組織發生反應，并且與34種不同的腫瘤中的28種發生反應。作者解釋說，他們的發現與先前的報道的不同，是由于使用了改良的、穩定性更好的IHC技術；并指出固定劑的選擇是重要的，可能導致這樣的結論，即MSCP抗原的一個重要特征是其對IHC中所涉及的處理步驟的敏感性。進行了一項進一步的研究以在超微結構水平上定位MCSP。使用電子顯孩i術的免疫定位顯示，MSCP幾乎專一地定位于孩i端絲(microspikes)，這是黑色素瘤細胞表面的一個微域，可能在細胞-細胞接觸和細胞-基質粘附(cell-substratumadhesion)中起作用。1996年MCSP的分子克隆使得利用MCSPcDNA探針對腫瘤細胞系和正常人類組織的MCSP表達進行Northern印跡分析成為可能。在被測試的8種不同的腫瘤細胞系中，只有在黑色素瘤細胞系中觀察到了MCSP表達。在被測試的16種正常成人組織和4種正常胎兒組織中，沒有任何一種觀察到MCSP表達。不同的MCSP組織定位研究中發現的不一致之處，提示可能需要進一步的研究，來闡明這種抗原的真實表達模式或者解釋這些已報道的不同。由于已知蛋白聚糖調節細胞-細胞和細胞-細胞外基質(ECM)相互作用，考察了MCSP在這些過程中的作用。已經證實MCSP刺激04/3r整聯蛋白介導的粘附和黑色素瘤細胞的擴散，而且還有人提出通過MCSP核心蛋白的信號傳導誘導pl30eas的募集和酪氨酸磷酸化，其可以調節細胞粘附和運動性，對腫瘤的侵入(invasion)和轉移作貢獻。這些結果一起提示，MCSP可能促進黑色素瘤細胞的粘附通過激活整聯蛋白并且激活導致細胞骨架重排(cytoskeletalrearrangement)的途徑。MCSP還被發現與膜-類型3基質金屬蛋白酶(MT3-MMP)相聯系，可能是通過MCSP的硫酸軟骨素組分。有人提出體內黑色素瘤中MT3-MMP的表達可以促進生長著的腫瘤附近的ECM蛋白的降解，提供腫瘤以擴張的空間。因此，MT3-MMP和MCSP之間的聯系可能是一個激活步驟，以促進黑色素瘤的侵入。已經利用抗MCSP抗體進行了數個體外測試來考察MCSP在腫瘤侵入和轉移相關聯的過程中所起的作用。利用抗體9.2.27測試了MCSP在非貼壁依賴的生長(anchorage-independentgrowth)中的作用。在含有9.2.27的軟瓊脂中培養的黑色素瘤細胞在其集落形成中顯示出67-74%的特異性下降。這些發現提示，MCSP可能參與細胞-細胞相互作用，并對非貼壁依賴的生長有貢獻。同一作者還在測量M14黑色素瘤細胞在牛主動脈內皮(BAE)細胞基底膜上的粘附的測試中，考察了用9.2.27阻斷MCSP的效果。將9.2.27處理的效果與用對照單克隆抗體W6/32(針對所有I類組織相容性抗原)的處理相比較。M14對照細胞和抗體預處理過的M14細胞一皮鋪到BAE細胞的基底膜上。在9.2.27處理的細胞中觀察到了達27%的顯著的細胞粘附抑制，而在W6/32處理的細胞中沒有觀察到顯著的效果。用9.2.27預處理細胞造成的一個更引人注意的效果是細胞擴散的抑制，這是使用掃描電子顯微術在超微結構水平證實的。許多針對黑色素瘤開發的、并且被確定為特異地識別MCSP的抗體已經接受了體內和體外測試，以確定它們的抗癌效果。單克隆抗體9.2.27識別MCSP的核心糖蛋白組分，而且是最早被研究其抑腫瘤性質的抗體之一。Bumol等研究了9.2.27及9.2.27的白喉毒素A交聯物用于在棵鼠中生長的黑色素瘤腫瘤的免疫治療。首先進行了體外的細胞毒性測試，測量9.2.27和9.2.27-DTA交聯物對M21人類黑色素瘤細胞中蛋白質合成的影響，由蛋白質中["S]曱硫氨酸的摻入來指示。9.2.27-DTA交聯物顯著地抑制M21黑色素瘤細胞中的蛋白質合成，盡管用未交聯的DNA產生的作用更強。單獨使用9.2.27時僅取得了最低的效果。在負荷人類黑色素瘤的棵鼠中考察了9.2.27和9.2.27-DTA交聯物的抗腫瘤作用。對小鼠皮下種植M21腫瘤，并寸吏成瘤生長3天，然后在第三天，及從此以后每隔三天，用9.2.27或9.2.27-DTA交聯物處理小鼠。將接受處理的小鼠的腫瘤體積與未備處理的對照小鼠進行比較。與未處理的對照比較，在第18天(數據報道的最后一天)，用9.2.27處理的小鼠顯示64%的腫瘤生長抑制，而用9.2.27-DTA處理的小鼠顯示52%的腫瘤生長抑制。在這個初步實驗中，作者作出結論9.2.27和9.2.27-DTA交聯物抑制棵鼠中M21黑色素瘤生長的效果大致相等。該初步研究報道了9.2.27處理體內抑制腫瘤生長，但后來的一些研究，包括相同作者進行的研究，顯示棵露的9.2.27在體內沒有顯示任何抗腫瘤效果。總結起來，如下所列，考察使用9.2.27處理人類肺瘤的有用性的實驗已經顯示，盡管9.2.27靶向癌細胞，但用此凈果露抗體處理并沒有產生抗癌活性。進行了一項I期臨床試驗，其設計為施用大劑量的9.2.27,以備使用9.2.27免疫交聯物(immunoconjugates)進行后續治療研究。根據流式細胞術和/或免疫過氧化物酶染色，8名惡性黑色素瘤患者的肺瘤與9.2.27反應，這8名患者通過靜脈注射接受單次劑量的抗體，每周兩次，劑量按1,10,50,100和200mg階段性升高。盡管這些患者中沒有人經受了顯著的毒性，而且9.2.27定位到了轉移的黑色素瘤結節(metastaticmelanomanodules),但沒有觀察到臨床反應。在后來的一項研究中，將9.2.27與化療劑多柔比星(doxorubicin,DXR)交聯，并考察該交聯物在體內和體外的黑色素瘤生長抑制作用。用DXR-9.2.27交聯物處理的M21細胞的生長抑制通過[311]胸腺嘧啶核苷摻入分析來測量。該交聯物對M21靶細胞顯示特異性的劑量依賴的生長抑制作用，而對MCSP陰性對照細胞系不顯示作用。沒有進行考察單獨的9.2.27的作用的體外測試。為了在體內考察DXR-9.2.27交聯物，皮下注射M21細胞，使其經過8-10天成瘤。在第IO天及此后每隔三天進行靜脈注射。只有在用DXR-9.2.27交聯物處理的小鼠中觀察到了顯著的腫瘤生長抑制作用。單獨的DXR處理和單獨的9.2.27處理都未能抑制腫瘤生長；9.2.27和DXR的混合物也顯示相似的陰性結果。進行另外一項研究考察一種9.2.27交聯物的效果。Schrappe等將化療劑4-去乙酰長春堿-S-羧基酰肼(DAVLBHY)與9.2.27交聯，并測試其對人膠質瘤的作用。用U87MG(—種人膠質瘤細胞系)細胞皮下注射棵鼠，在第2，5,7，9天處理這些動物。9.2.27-DAVLBHY交聯物最有效地縮小了胂瘤體積。用PBS或單純的9.2.27處理的對照組產生了快速生長的腫瘤，而且用9.2.27處理的小鼠與用PBS處理的小鼠相比肺瘤體積沒有減小。抗體225.28S是針對人M21黑色素瘤細胞系的，其最初被描述為與一種高分子量的黑色素瘤相關抗原反應。這種分子后來被證明就是MCSP。一項早先的研究測試了225.28S對于一種人黑色素瘤細胞系的細胞溶解能力，并將其與另外一種抗MCSP抗體克隆653.40S比較，225.28S是一種IgG2a,而653.40S是一種IgGi。225.28S和653.40S被確定為識別MCSP上相同的或空間上相接近的抗原決定簇。人們發現兩種抗體在體外試驗中都不能與補體結合裂解黑色素瘤細胞。兩種抗體在抗體依賴性細胞介導性細胞毒性測試(ADCC)中都可以介導靶黑色素瘤細胞的裂解，其中225.28S顯示出比653.40S更高的裂解活性。但是，只有使用比其他人已報道的高得多的效應物/靶細胞比例的裂解，其中，已報道的是使用抗黑色素瘤抗原的抗體。實驗作者結論說，這些抗體的與人類補體結合裂解細胞的活性的缺乏，以及ADCC中發生細胞裂解所需要的較高的效應物/靶細胞比例，提示將單克隆抗體注射到黑色素瘤患者體內不可能造成腫瘤細胞的破壞。作者提出，這些抗體在免疫治療中的用途應當只限于作為放射性同位素、化療劑或毒劑的載體。在一項I期臨床試驗中考察了棵露抗體225.28S的治療潛力，在該試驗中，該抗體以10mg的劑量靜脈投藥于2名早期黑色素瘤患者。盡管沒有提到可能因為該抗體的施用而導致的臨床不良作用或嚴重的毒性作用，但也沒有陽性的治療反應。將抗體225.28S與蝶呤辟u素(purothionin)交聯，然后測試該交聯物對人黑色素瘤細胞系Colo38的體外毒性；蝶呤硫素是一種低分子量多肽，其對分裂中的細胞是特別有毒的。發現Colo38細胞與225.28S-蝶呤疏素交聯物培養24小時的培養物抑制了3H-胸腺嘧啶核苷的攝取。此外，在與所述交聯物共孵育7天的培養物中Colo38細胞的生存力(viability)顯著下降。盡管觀察到了體內毒性，仍然有一部分黑色素瘤細胞經受了225.28S-蝶呤硫素處理而生存下來。作者提出惡性疾病(malignantdiseases)的免疫治療可能需要依賴多種單克隆抗體的雞尾酒(cocktail),由這些針對獨特的肺瘤相關抗原的多克隆抗體充當毒劑的載體，暗示單獨的225.8S交聯物不足以治療癌癥。評價了225.28S-蝶呤硫素交聯物處理對于棵鼠中人黑色素瘤的生長的作用。在棵鼠中皮下或腹膜內植入Colo38細胞。對于腹膜內植入的小鼠在第1、3、5天進行處理，對皮下植入的小鼠在第1,3，5和20天進行處理，檢測所有小鼠的存活情況。只有在用225.28S-蝶呤硫素交聯物處理的腹膜內植入的小鼠中觀察到統計學上顯著的生存時間的延長。單獨的225.28S，單獨的蝶呤硫素，或者225.28S與蝶呤硫素的混合物都沒有延長腹膜內植入或皮下植入的小鼠的生存。還記錄了皮下植入小鼠的腫瘤體積，發現只有225.28S-蝶呤硫素交聯物處理顯著地縮小了腫瘤體積。單獨-使用225.28S處理沒有造成腫瘤體積的減小。此外還把225.28S與化療劑曱氨蝶呤(methotrexate,MTX)交聯，并在體內考察其對腫瘤生長的作用。棵鼠用Ml人黑色素瘤細胞皮下接種，并在第1，4,7，10和14天接受處理。只有MTX-225.28S交聯物處理抑制了腫瘤生長。單獨用225.28S、單獨用MTX或用225.28S和MTX的混合物都沒有抑制腫瘤生長。225.28S被用于一項考察施用具有異種性質的試劑導致的對人體的潛在毒性作用的研究。85位患有轉移性表皮黑色素瘤的患者被施以用1231,1231，min，或"Tc標記的完整的225.28S或者F(ab，)2片段。注射的抗體的量為14到750/ig。沒有患者觀察到臨床上可檢測的副作用。沒有臨床反應被報道，盡管這不一定被預計到的結果，因為該項研究是被設計用于毒理學目的的。225.28S被用來產生鼠抗獨特型單克隆抗體，包括抗體MF11-30，其帶有MCSP的鏡像(mirrorimage)。MF11-30已被證明在同種和異種系統中都可誘導抗MCSP抗體的發生。在兩個臨床試驗中以逐漸升高的劑量測試MF1-30，這兩個試驗被設計來測試晚期惡性黑色素瘤患者中的毒性和反應。兩個試驗中都幾乎沒有由于該抗體的施用而導致的副作用，且治療得到良好地耐受。在第二個試驗中，7位患者產生了抗-抗-獨特型抗體，其效價為至少1:8，并沒有顯示出明顯的血清MCSP水平變化，這些患者的平均生存期為55周(范圍為16-95周)，顯著長于其他12位患者(這些患者產生了效價為l:4或更少的抗-抗-獨特型抗體，并且顯示出血清MCSP水平的升高)，他們的生存期為19周(范圍為8-57)。還生成了抗體763.74，其抗黑色素瘤細胞并識別MCSP。還沒有任何關于抗體763.74體外或體內抗癌作用的報道，但這種抗體也被用來生成鼠抗獨特型單克隆抗體。這些抗體中的一種，MK2-23,帶有抗MCSP抗體763.74所決定的抗原決定簇的內影像(internalimage)。在臨床前實驗中，證明在同種宿主(BALB/c小鼠)和異種宿主(家兔)中用MK2-23免疫都誘導了抗-MCSP抗體的產生。當MK2-23與載體蛋白鑰孑L蟲戚血藍蛋白(keyholelimpethemocyanin,KLH)交聯被與佐劑共同施用時，其免疫原性顯著增強。進行了一項臨床實驗來對黑色素瘤患者中MK2-23誘導的體液應答進行定性。對25名第IV期的黑色素瘤患者在第0，7和28天通過皮下注射2mg的MK2-23/KLH交聯物與卡介苗(BCG)的混合物進行免疫。如果抗-抗-獨特型抗體的效價較低則給與額外的注射。用MK2-23免疫的患者中約有60產生了抗MCSP抗體，盡管這些抗MCSP抗體的水平和親和性都較低。發現在MK2-23免疫后產生了抗-MCSP抗體的患者比沒有產生該抗體的患者生存期要顯著的長。產生了抗MCSP抗體的患者的生存期的中值為52周(范圍為19-93)，而9名血清中沒有可檢測的抗-MCSP抗體的患者的生存期的中值是19周(范圍是9到45)。3名產生了抗MCSP抗體的患者經歷了疾病的部分緩解。盡管在這項研究中獲得了有希望的結果，MK2-23免疫的患者中仍有40%沒有產生可檢測的抗MCSP抗體的反應。同樣，3名實現了病情部分緩解的病人最終都復發了。一項嘗試是試圖通過用小劑量的環磷酰胺(cyclophosphamide,CTX)對患者進行預處理來提高MK2-23的免疫原性，環磷酰胺據報道可通過選擇性地使某些抑制細胞群失活來提高針對腫瘤相關抗原的細胞和體液應答。但是，沒有^r測到CTX預處理對MK2-23免疫原性的作用。單克隆抗體48.7是被開發為針對人轉移性黑色素瘤細胞系M1733的，該抗體據報道可與一種分子反應，該分子后來^皮確定為MCSP。在一項I期臨床試驗中，48.7被與小鼠單克隆抗體96.5組合施用，抗體96.5是針對人黑色素瘤上存在的類轉鐵蛋白(transferrin-like)細胞表面糖蛋白p97的。5名患者在第1天分別接受單抗96.5和48.7各2mg,第2天分別接受10mg,第3天到第10天每天接受各25mg。處理被良好地耐受；但對處理沒有臨床反應而且在所有的患者中都發生了疾病進展。在另一個臨床試驗中也考察了這兩種抗體，其中用這兩種抗體中任一個的放射性標記的Fab片段處理3名黑色素瘤轉移到中樞神經系統的患者。兩名患者接受了5mg劑量的碘標記的48.7Fab片段，結合血腦屏障(BBB)的滲透壓開放(osmoticopening)以促進該抗體進入腦中的胂瘤。滲透壓血腦屏障調節增加了Fab向含瘤半球和脊髓液的運輸，但沒有顯示該抗體清楚地、持續地定位于腫瘤。該作者假設說定位的缺乏可能是由于抗體劑量不足。Melimmune是兩種鼠抗獨特型抗體Melimmune-l(I-Mel-1)和Melimmune-2(I-Mel誦2)的二元制劑(dualpreparation)，這兩種抗體沖莫擬MCSP的不同表位。I-Mel-1是抗獨特型抗體MF11-30的一種亞克隆，MF11-30針對抗MCSP抗體225.28(如前所述)。I-Mel-1被證明在家兔中誘導抗MCSP反應。I-Mel-2是針對抗MCSP抗體MEM136的抗獨特型抗體，MEM136與和225.28不同的MCSP表位反應。I-Mel-1也被證明在家兔中誘導抗MCSP反應。在一項I期臨床試驗中測試了含有1:1組成的I-Mel-1和I-Mel-2的Melimmune制劑，該試驗在21名黑色素瘤切除并沒有顯示轉移的患者中進行。報道了這些收治于同一機構的患者中12人的詳細的免疫反應分析結果。在兩個治療方案中的一個中，患者接受了0.2-4.0mg劑量的Melimmune(I-Mel-1和I-Mel-2各0.1-2,0mg),所有的病人都產生了抗I-Mel-1和抗I-Mel-2抗體，其中12個患者中有IO人針對I-Mel-2的抗體峰值響應(peakantibodyresponse)大于針對I-Mel-1抗體峰值響應。^f旦是該項研究無法顯示針對MCSP的特異性抗體的誘導，因為這些患者的血清都不能抑制放射性標記的225.28與表達MCSP的Mel-21細胞的結合，或者;改射性標記的MEM136與Mel-21細胞的結合。還使用了直4妄的細胞結合測試來測定病人血清中抗MCSP抗體的存在；但是在流式細胞術(FACS)分析中沒有顯示免疫前和免疫后的血清結合M21細胞的區別。在另一項臨床試驗中測試了I-Mel-2,其中26名轉移性黑色素瘤患者接受2mgI-Mel-2和100或250/xgSAF-m佐劑的處理，通過肌肉注射投藥，每兩周一次投藥4周，然后每兩月一次直到病情發展。在26名患者中有5人通過抑制放射免疫測定(inhibitionradioimmunoassay)檢測到了抗MCSP抗體。在具有可檢測的抗MCSP抗體的5名患者中，有l人經歷了完全的緩解，l人病情穩定，其他3人病情進展。病情完全緩解的患者具有最高的抗MCSP抗體效價(1:1500)。現有專利US5270202(及其相關專利W09216646A1,EP0576570A1)教導了一種抗獨特型抗體IMelpg2(又稱IM32)，其針對MEM136,—種針對人黑色素瘤相關蛋白聚糖(又稱"HMW-MAA")的抗體。IMelpg2抗體^皮證明特異性地針對MEM136，并且有人提出其可用于"^斷和治療細胞表達MPG表位的疾病。盡管體外測試確定IMelpg2對腫瘤細胞侵入有作用，但是其在被測試的抗體中并不是最有效的，也沒有跡象顯示其有體內抗腫瘤作用，雖然其顯示Ab3反應。EP0380607B1教導了針對單抗225.28的抗獨特型抗體，225.28對于一個未確定的HMW-MAA表位有特異性。這些抗體都可用于黑色素瘤的積極免疫治療(activeimmunotherapy)。MF11-30和IMelpgl,以及針對225.28的多克隆抗獨特型抗體已經被報道并且在動物試-驗中評估，MF1l-30正在黑色素瘤患者中接受臨床試驗，雖然還沒有支持性的數據。MF11-30可誘導225.28獨特型抗體。通過用BMCycline處理MF11-30細胞系并檢測無支原體污染而獲得了IMelpgl細胞系。盡管抗IMelpgl可以在家兔血清中被誘導，并且證明可結合Colo38黑色素瘤細胞，但是其沒有顯示殺胂瘤(tumorcidal)活性，不管是在體內還是體外。US4879225教導了由不溶性免疫復合物制備抗體。這里，通過將9.2.27固定在蛋白A-Sepharose上用作抗原，生成了HMW-MAA特異性單抗9.2.27的大鼠抗獨特型抗體。使用與Sepharose交聯的多種細胞或細胞裂解物復合物制備了抗黑色素瘤抗體。將結合黑色素瘤細胞但不結合正常T細胞或B細胞的鼠單抗與9.2.27比較。下面這些與9.2.27具有相似性質的鼠單抗被選擇用于進一步定性分析NR-ML-02，NR-ML-03,NR-ML-04，NR-ML-05，NR-ML-06。上述抗體中的每一個在使用9.2.27作為捕捉抗體和溶解的SKMEL-28黑色素瘤細胞膜作為抗原來源的夾心ELISA分析中都為陽性。進一步地，這些抗體被確定為識別黑色素瘤細胞，而且也與平滑肌和內皮細胞反應。還制備了61種抗蛋白聚斗唐抗體，其中10種與NR-ML-02/NR-ML-04識別相同的決定簇，3種與NR-ML-03或NR-ML-05識別相同的決定簇，45種并不識別與上述5種抗體相同的表位。在US5084396中，這些抗體祐j文射性標記，并在荷載黑色素瘤異種移植物的棵鼠中比較它們與9.2.27的腫瘤攝取。NR-ML-05和NR-ML-02的腫瘤攝取最高，其次是9.2.27,然后是NR-ML-02。上述兩個發明中都沒有證據顯示這些細胞導致癌性疾病中腫瘤負荷(tumorburden)的降^氐或患有癌性疾病的哺乳動物生存率的提高。US5034223教導了一種通過用非交聯的阻斷抗體(blockingantibody)預處理來促進交聯抗體向帶有腫瘤相關抗原的組織的運輸的方法。將針對HMW-MAA,9.2.27和NR-ML-05的抗體與technicium-99(Tc-99)交聯，并且在臨床條件下施用，在施用前先施用了未標記的單抗NR-2AD，其具有只特異性針對1個患者的B細胞淋巴瘤的抗獨特型。由于這些研究被設計為使用無細胞毒性或放射腐蝕性(radioablative)作用的Tc-99作為報道放射性同位素，沒有出現抗腫瘤作用的證據，盡管通過應用該方法促進了抗HMW-MAA抗體的掘^取。US5580774教導了使用編碼單抗9.2.27的抗體基因構建嵌合抗體。其沒有關于公開癌性疾病的診斷或治療的內容。US5493009和US5780029教導了針對抗HMW-MAA抗體763.74的鼠抗獨特型抗體MK2-23和其交4關物。MK2-23可直接結合763.74并抑制763.74結合Colo38黑色素瘤細胞。另外，MK2-23誘出的Ab3可直接結合HMW-MAA并可竟爭性抑制763.74結合Colo38黑色素瘤細胞。在一項臨床試驗中，在第IV期黑色素瘤患者中用MK2-23進行了積極免疫治療。患者免疫后血清有89%與Colo38黑色素瘤細月包反應，并抑制763.74結合Cok)38黑色素瘤細胞，提示Ab3抗體的誘導。在15名患者的6人中報道了轉移病灶大小的減少，但未提供研究的詳情。部分地鑒定了患者血清中抗體的特異性；而且，還不清楚Ab3抗體是否只要其存在就對任何觀察到的臨床反應負責，因為763.74抗體沒有天生的抗腫瘤作用。US5866124教導了嵌合抗獨特型抗體MK2-CH7I和其衍生物，其針對抗HMW-MAA抗體763.74，并衍生自MK2-23。多項發明,例如US5017693,US5707603,US5817774,US6248870,US5112954，US6238667,教導了將化合物交聯到針對HMW-MAA的抗體，但沒有公開這些抗體在治療癌性疾病中的用處。重要的是，如果這些抗體單獨用作抗癌治療是有效的，它們就不會需要交聯物來賦予細胞毒性或細胞生長抑制作用了。這些專利和專利申請鑒定了MCSP抗原和相關抗體，但沒有公開本發明的分離的單克隆抗體，或本發明的分離的單克隆抗體的用處。
發明內容本發明人先前已被授予美國專利6,180,357，名為"個人化的患者特異性抗癌抗體"(IndividualizedPatientSpecificAnti-CancerAntibodies),該專利涉及選擇個人定制的抗癌抗體的方法，這些抗體可用于治療癌性疾病。對于本文而言，術語"抗體"和"單克隆抗體"(mAb)可以互換使用，指雜交瘤(例如鼠或人的)產生的完整免疫球蛋白，免疫連接物，以及，如適合的，免疫球蛋白片段和所述免疫球蛋白來源的重組蛋白，例如嵌合和人源化的免疫球蛋白、F(ab')和F(ab')2片段、單鏈抗體、重組免疫球蛋白可變區(Fv)、融合蛋白等。本領域中普遍承認，多肽中的某些氨基酸序列可以發生變化而不顯著地影響蛋白質的結構或功能。在抗體的分子重排中，骨架區(backboneregion)的核酸或氨基酸序列的改變一般是可以被容忍的。這樣的改變包括但不限于，置換(優選保守性的置換)，缺失或添加。另外，將標準的化療藥征(chemotherapeuticmodalities)，例如it射性核素，與本發明的CDMAB交聯，以集中該化療劑的使用，也落入本發明的范圍內。所述CDMAB也可以與毒素，細胞毒性部分，酶例如生物素交聯的酶，或血源性細胞交聯，以產生抗體交聯物(antibodyconjugates)。本申請使用如'357專利所教導的生產患者特異性抗癌抗體的方法來分離編碼癌性疾病調節性多克隆抗體的雜交瘤細胞系。可以使這些抗體特異性地針對一種腫瘤而使得癌癥治療的定制化稱為可能。在本申請的范圍中，具有殺細胞(細胞毒性)或抑制細胞生長(細胞增殖抑制)功能的抗癌抗體，以下都稱為細胞毒性的。這些抗體可用于幫助癌癥的分期和診斷，并可用于治療腫瘤轉移。個人化的抗癌治療的前景將帶來患者治療方式的改變。臨床上可能將是這樣的情況在腫瘤發現時獲得腫瘤樣本并保存。根據此樣本，該腫瘤可以由一組先有的癌性疾病調節抗體來分類。患者可能按常規分期，但可得的抗體可能可以用于對患者進一步分期。患者可以立即用已有的抗體來處理，并且/或者，可以使用本文所列出的方法或使用噬菌體展示庫結合本發明公開的篩選方法來生產一組針對該腫瘤特異性的抗體。所有產生的抗體都將被添加到抗癌抗體庫中，因為其他的腫瘤可能帶有和正在被處理的腫瘤相同的表位。根據此方法生產的抗體可以用于治療任何患有能結合這些抗體的癌的患者中的癌性疾病。基本上使用US6,180,357的方法，并如S.N.10/348,231所公開的，用來自患者的乳腺癌活檢物的細胞免疫小鼠后，獲得了小鼠單克隆抗體11BD-2Ell-2。11BD-2E11-2抗原在不同組織來源的數種人細胞系的細胞表面都有表達。乳腺癌細胞系MCF-7和卵巢癌細胞系OVCAR-3對11BD-2E11-2的體外細胞毒作用敏感。當移植到小鼠中時，11BD-2E11-2針對MCF-7和OVCAR-3細胞的細胞毒作用被其針對這些癌細胞的抗腫瘤活性進一步擴大。臨床前異種移植腫瘤模型被認為是處理有效性的可靠預測手段。在一個人類乳腺癌的預防性體內模型中，11BD-2E11-2阻止了腫瘤生長并減輕了腫瘤負荷(如S.N.10/762,129公開的)。在第51天(最后一次治療后不久)，在11BD-2Ell-2處理組中平均腫瘤大小是同型對照組的20%。監測持續到處理后280天以后。植入后7.5個月，11BD-2E11-2處理組仍有40%存活。相對地，同型對照組在處理后6.5個月后死亡率為100%。因此，在確立的人乳腺癌模型中，相對于對照處理組，11BD-2Ell-2提高了生存率并減輕了腫瘤負荷。為了確定11BD-2Ell-2是否在更多的人乳腺癌模型中有效，在一個確立的乳腺癌4莫型中測定了其針對MDA-MB-468(MB-468)細胞的抗肺瘤活性。與緩沖液對照相比，11BD-2E11-2降低了25%的腫瘤生長。因此，11BD-2E11-2在確立的和預防性的乳腺癌異種抑制物模型中有效地抑制腫瘤生長。另外，11BD-2E11-2在至少兩種不同的乳腺癌模型中顯示了抗腫瘤活性。除了在人乳腺癌模型中的有益作用外，11BD-2E11-2處理還在預防性的卵巢癌模型中(如S.N.10/762,129中所公開)具有抗胂瘤活性。在上述模型中，體重被用作腫瘤進展的替代量度。植入后80天(處理結束后16天)，處理組中的小鼠的平均體重為對照組的87.6%(p=0.015)。因此，11BD-2Ell-2處理是有效的，因為其在確立的人卵巢癌模型中相比于緩沖液對照組延遲了腫瘤的進展。11BD-2E11-2在數種不同的癌癥模型中顯示的抗腫瘤活性使之成為一種有吸引力的治療劑。為了確定11BD-2Ell-2是否在更多的人卵巢癌模型中有效，在一種確立的卵巢癌模型中測定了其針對ES-2+SEAP細胞(用人胎盤分泌性堿性磷酸酶(SEAP)轉染的ES-2卯巢癌細胞)的抗肺瘤活性。與緩沖液對照相比，11BD-2E11-2提高了處理組中一組小鼠的存活率。11BD-2E11-2處理組中的一只小鼠在處理后顯示出循環SEAP水平的下降。循環SEAP水平可用作腫瘤負荷的指標。因此，11BD-2E11-2在確立的和預防性的卵巢癌異種抑制物模型中有效地抑制了腫瘤生長。另外，11BD-2E11-2在至少兩種不同的卯巢癌模型中顯示了抗腫瘤活性。為了驗證11BD-2E11-2表位為藥物靶標，測定了冷凍的正常人組織中11BD-2E11-2抗原的表達。根據用11BD-2Ell-2免疫組化染色的結果，大多數的祖師沒有表達11BD-2Ell-2抗原，包括肝、腎和心臟等重要器官的細胞。但是在幾乎所有的組織中血管平滑肌纖維都有染色。一些組織的上皮也有染色。11BD-2E11-2的定位和它在乳腺癌患者中的普遍性對評估11BD-2E11-2免疫治療對患者的效益和-沒計有效的臨床試-瞼是重要的。為了研究11BD-2E11-2抗原在來自癌癥患者的乳腺腫瘤中的表達，在來自8名乳腺癌患者的肺瘤組織樣本(還有7個樣本在微陣列玻片上脫離或不能代表該腫瘤)中篩選11BD-2Ell-2抗原的表達。該研究的結果顯示這些組織樣本中的62%的11BD-2Ell-2抗原染色呈陽性。患者的樣本中的UBD-2Ell-2表達似乎是對癌細胞特異性的，因為染色僅限于惡性細胞。另外，在3個來自乳腺癌患者的正常組織的樣本(還有兩個樣品也徹底從微陣列玻片上脫離)中0個具有11BD-2E11-2染色。當根據腫瘤的分期，或癌癥進展的程度來分析腫瘤時，結果并沒有顯示出腫瘤分期越晚11BD-2E11-2陽性表達越高的傾向。但是，結果被較小的樣本量所限制。如本文所述的，其他生化數據也暗示被11BD-2Ell-2識別的抗原是MCSP。這被下面的研究結果所支持被11BD-2Ell-2免疫沉淀的蛋白為針對MCSP的大鼠同源物的抗體所識別；被抗MCSP抗體免疫沉淀的蛋白則為11BD-2Ell-2所識別。免疫組化和生化試驗結果顯示，11BD-2Ell-2與MCSP抗原結合。因此，優勢的證據證明11BD-2E11-2通過與MCSP上獨特的表位連接而介導抗癌作用。總結起來，這些數據顯示11BD-2Ell-2是一種癌相關抗原并在人類中表達，而且是一種病理學上重要的癌靶標。進一步地，該數據還顯示11BD-2Ell-2抗體結合人癌組織，并可以合適地用于診斷性、治療預測性和預后性等分析。另外，由于該抗原在大部分非惡性細胞中不表達，該抗原的細胞定位指示癌的狀態；這一觀察結果使得該抗原、該抗原的基因或衍生物，及該抗原的蛋白或變體可以用于診斷性、治療預測性和預后性等分析。已經開發了多種獨特的抗MCSP抗體并在許多體外和體內系統中對它們作了測試。在臨床前模型中，除了一項未能重復的研究之外，棵露的抗MCSP抗體已經被證明在數個不同的黑色素瘤模型和一個膠質瘤模型中對減輕腫瘤和提高生存率沒有效果；還沒有用抗MCSP抗體研究其他癌類型。所有棵露的抗MCSP抗體的人體試驗都沒有產生任何積極的臨床效果。棵露的11BD-2E11-2已被證明能在人乳腺癌的小鼠模型中提高生存率和減少腫瘤負荷。11BD-2E11-2還被證明在人卵巢癌的小鼠模型中抑制腫瘤發展和提高存活率。抗MCSP抗體已被與多種毒劑或化療劑交聯，這些交聯物在小鼠黑色素瘤模型中已經顯示出積極的體內效果。還沒有在人中測試抗-MCSP交聯物的報道，所以這些交聯物的安全性還是未知。但是單克隆抗體單獨給藥被很好地耐受，幾乎沒有伴隨相關的毒性。因此，如果使用單獨的棵露抗MCSP抗體治療癌癥患者能夠獲得積極的臨床結果，這將是有益的，而且較之現有的治療方法將是一個進步。與毒劑交聯并不是11BD-2Ell-2顯示抗癌活性所必需的；因此不存在施用抗體-毒劑交聯物所帶來的特定的安全擔憂。許多抗-MCSP抗體還被用來產生抗獨特型抗體，這些抗體在動物和人中都已被測試。在小型非盲試驗中，當用抗獨特型抗體免疫患者導致可檢測的抗-MCSP免疫反應時，這些患者與沒有產生特異性免疫反應的患者相比生存中值增加了。在給出的例子中，可以通過施用抗獨特型抗體實現靶向MCSP以獲得積極的臨床反應。這種方法的問題之一是，不是所有被用抗獨特型抗體免疫的患者都產生抗-MCSP反應。因此，如果能有一經直接施用即可產生積極的臨床效果的抗MCSP抗體，就能夠克服依賴患者自身的免疫反應來產生臨床上的效益的問題。11BD-2E11-2就是一種這樣的抗體，因為其直接靶向MCSP,并且在臨床前異種移植腫瘤模型中顯示抗癌作用，臨床前異種移植腫瘤模型被認為是治療有效性的可靠預測手段。總之，本發明教導作為治療劑的靶標的11BD-2Ell-2抗原，當其被施用時可減輕哺乳動物中表達該抗原的癌癥的腫瘤負荷(乂人而延遲其病情進展)，并延長被處理的哺乳動物的生存。該發明還教導一種CDMAB(1BD-2E11-2)及其衍生物的用途該利用CDMAB靶定其抗原，以減輕哺乳動物中表達該抗原的癌的腫瘤負荷，并延長荷載表達該抗原的腫瘤的哺乳動物的生存。另外，該發明還教導檢測癌性細胞中11BD-2Ell-2抗原的用途，其可用于荷載表達該抗原的腫瘤的哺乳動物的診斷、治療預測和預后。如果初次療程對病人無效，或發生轉移，那么可以重復產生針對該腫瘤的特異性抗體的過程作為重復治療。另外，可以將抗癌抗體與得自該患者的紅細胞交聯并再注入來治療轉移。目前幾乎沒有對轉移的有效治療方法，轉移通常預示著導致死亡的不好的結果。但是轉移癌通常高度血管化，通過紅細胞運輸抗癌抗體具有將抗體集中在腫瘤處的作用。即使在轉移前，大部分癌細胞都依賴于宿主的血液供應來生存，而且與紅細胞交聯的抗體也可有效地對抗原位肺瘤。或者，所述抗體也可交聯其他的血源性細胞，例如淋巴細胞、巨噬細胞、天然殺傷細胞等等。抗體分為五類，每一類都具有由其重鏈賦予的功能。一般認為棵露抗體對癌細胞的殺傷是通過抗體依賴性細胞介導性細胞毒作用(ADCC)或補體依賴型細胞毒作用(CDC)。例如鼠IgM和IgG2a抗體可以通過與補體系統的C-I組分結合活化人補體，從而激活經典的補體激活途徑，可以導致腫瘤裂解。對于人類抗體，最有效的補體激活抗體是IgM和IgGl。鼠IgG2a和IgG3同型抗體可有效地募集具有Fc受體的細胞毒細胞，這導致細胞被單核細胞、巨噬細胞、粒細胞和特定的淋巴細胞所殺死。IgGl和IgG3同型的人類抗體都介導ADCC。另一種可能的抗體介導細胞殺傷可能是通過使用催化細胞膜或者其相關糖蛋白或糖脂中多種化學鍵水解的抗體，即所謂催化性抗體(catalyticantibodies)。還有兩種被更廣泛承認的抗體介導癌細胞殺傷途徑。第一種是使用抗體作為疫苗誘導機體產生針對位于癌細胞上的假設的抗原的免疫應答。第二種是使用抗體來耙定生長受體(growreceptors)并干擾其功能或下調該受體，以有效地使其功能喪失。癌癥藥物的臨床有用性是基于該藥物在可接受的風險模式下對患者的效益。在癌癥治療中生存率一般是人們最追求的效益，但是除了生命的延長以外，還有多種其他的被普遍承認的效益。所述其他的效益，在治療對生存不造成不良影響的情況下，包括癥狀的減輕、針對不良事件的保護，推遲復發或延長無瘤生存期(disease-freesurvival),及推遲病情進展。這些標準被普遍接受，而且管理機構例如美國食品藥品管理局(F.D.A.)已批準了產生此類效益的藥物(Hirschfeldetal.CriticalReviewsinOncology/Hematolgy42:137-1432002)。除了這些標準以外，公認還有其他終點指標(endpoints)可能預示此類效益。美國FDA所給予的加快的批準程序部分地承認了可能存在預測患者的效益的替代終點指標。在年底(2003),在這個程序下已經有16種藥物被批準，且其中4種已經得到完全批準，也就是說，后續的研究已經顯示了如替代終點指標所預測的直接患者效益。在實體瘤中，判定藥物效果的一個重要的終點指標是通過測量對治療的反應來評價腫瘤負荷(Therasseetal.JournaloftheNationalCancerInstitute92(3):205-2162000)。這種評價的臨床標準(RECIST標準)已經由ResponseEvaluationCriteriainSolidTumorsWorkingGroup,—個國際癌癥專家組發布。如果藥物4艮據RECIST標準的目標反應所顯示，相對于合適的對照組顯示對腫瘤負荷有作用，則其傾向于最終產生直接的患者效益。在前臨床條件下腫瘤負荷一般更易于直接評估和證實。由于前臨床研究可以轉換為臨床條件，在前臨床模型中能夠延長生存的藥物，其臨床有用性是最為人期待的。與產生對臨床治療的積極反應相似，在前臨床條件下減輕腫瘤負荷的藥物也可以對該致病具有顯著的直接影響。雖然生存的延長是腫瘤藥物治療中人們最追求的臨床結果，還有其他具有臨床有用性的效益，而且人們清楚，胂瘤負荷的減輕可能關聯腫瘤進展的延遲，生存的延長或二者，腫瘤負荷的減輕也可以帶來直接的效益并具有臨床影響(Eckhardtetal.DevelopmentalTherapeutics:SuccessesandFailuresofClinicalTrialDesignsofTargetedCompounds;ASCOEducationalBook,39thAnnualMeeting,2003,209-219頁)。因此，本發明的目標之一是利用從來自特定個體的細胞生產癌性疾病調節抗體的方法，這些抗體對癌細胞是細胞毒性的，而對非癌細胞是相對無毒的，利用上述方法來分離雜交瘤細胞系和雜交瘤細胞系所編碼的相應分離的單克隆抗體及其抗原結合片段。本發明的另一個目的是教導CDMAB及其抗原結合片段。本發明還有一個目的是生產其細胞毒性通過ADCC介導的CDMAB，。本發明還有一個目的是生產其細胞毒性通過CDC介導的CDMAB。本發明的一個進一步的目的是提供這樣的CDMAB,其細胞毒性是其催化水解細胞化學鍵的能力的功效。本發明的另一個目的是提供可用于癌癥的診斷、預后和監控的結合測定的CDMAB。本發明的其他目的和優點可由下面的描述而清楚，其中，作為"i兌明和舉例，提供了本發明的特定的實施方式。本專利或申請文件包含至少一幅彩圖。本發明或發明申請公開的具有彩圖的拷貝將由專利局根據要求并提供并收取必要的費用。圖1:MDA-MB-231(泳道1)或OVCAR-3(泳道2)膜的Western印跡，該膜用11BD-2Ell-2探測。膜蛋白是在還原條件下分離的。分子量標記標示在右邊。圖2:去糖基化對于11BD-2E11-2結合MDA-MB-231膜的影響。11BD-2E11-2與在單獨的去糖基化^_沖液中(泳道1),與PNG酶F，內切-o-糖苷酶，唾液酸酶，半乳糖苷酶和氨基葡糖苷酶(glucosaminidase)的組合中(泳道2),與PNG酶，內切-o-糖苷酶和唾液酸酶的組合中(泳道3),單獨的唾液酸酶中(泳道4)，單獨的內切-o-糖苷酶中(泳道5),和單獨的PNG酶中(泳道6)孵育的所述MDA-MB-231膜結合。圖3:用11BD-2E11-2免疫沉淀的MDA-MB-231膜蛋白的SDS-PAGE(圖面A)和Western印跡(圖面B)。泳道1表示分子量標準，泳道2為MDA-MB-231膜蛋白，泳道3為11BD-2E11-2免疫沉淀物，泳道4為同型對照的免疫沉淀物。圖4:用下列物質11BD-2E11-2(圖面A),IgGl同型對照(克隆107.3,圖面B)，抗-大鼠NG2(多克隆，圖面C)，正常家兔IgG(圖面D),抗-MCSP(克隆9.2.27,圖面E)和IgG2a同型對照(克隆G155-228,圖面F)探測的蛋白的Western印跡。泳道1:11BD-2E11-2免疫沉淀物，泳道2:IgGl同型對照(克隆107.3)免疫沉淀物，泳道3:抗-MCSP(克隆9.2.27)免疫沉淀物，泳道4:IgG2a同型對照(克隆G155-228)免疫沉淀物，泳道5:MDA-MB-231膜，和泳道6:單純的樣品緩沖液(陰性對照)。圖5:11BD-2E11-2,同型對照或針對數種癌細胞系和非癌細胞系的抗-EGFR的代表性流式細胞直方圖。圖6:代表性的顯微照片，顯示11BD-2E11-2(A)和同型對照抗體(B)對來自冷凍的人組織陣列的心臟組織切片的結合模式。11BD-2Ell-2對心肌纖維沒有染色。放大倍數為200X。圖7:代表性的顯微照片，顯示11BD-2E11-2(A)、抗-肌動蛋白(B)和同型對照抗體(C)對來自冷凍的人組織陣列的骨骼肌組織切片的結合模式。11BD-2Ell-2對骨骼肌無染色，但對血管平滑肌有染色(箭頭所示)。；改大倍數為200X。圖8:11BD-2E11-2(A)和同型對照抗體(B)結合乳腺癌腫瘤(浸潤性導管癌)的代表性顯微照片。圖面A的黑色箭頭指向腫瘤細胞。》文大倍數為200X。圖9:在預防性MDA-MB-468乳腺癌模型中11BD-2E11-2或緩沖液對照對腫瘤生長的影響。虛線表示抗體被施用的時間段。數據點表示平均值+/-測量標準誤差。圖10:在確立的ES-2異種移植研究中用11BD-2E11-2或緩沖液對照抗體處理后荷瘤小鼠的生存情況。圖11:在確立的ES-2異種移才直研究中用11BD-2E11-2或緩沖液對照抗體處理前、處理中和處理后荷瘤小鼠的SEAP水平。具體實施方式實施例1用Western印跡法鑒定結合蛋白為了鑒定抗體11BD-2E11-2所結合的抗原，對表達該抗原的細胞膜進行凝膠電泳，并通過Western印跡轉移到膜上，以確定由該抗體檢測到的蛋白。1:膜的制備先前的工作顯示了11BD-2Ell-2通過流式細胞術結合乳腺癌細胞系MDA-MB-231(MB-231)。先前的工作還顯示11BD-2E11-2針對卵巢癌細胞系OVCAR-3的有效性。因此，使用這兩種細胞系的膜制備物進行抗原鑒定。從MB-231乳腺癌或OVCAR-3卵巢細胞的鋪滿培養物制備全細胞膜。從積聚的細胞(cellstack)中去掉培養基，用磷酸鹽緩沖鹽水洗滌細胞。用解離緩沖液(Gibco-BRL,GrandIsland,NY)在37。C平臺式搖床上解離細胞20分鐘。收集細胞并在40。C下900g離心10分鐘。離心后，將沉淀的細胞重懸于PBS中并再次在4"C下900g離心10分鐘以洗滌細胞。將沉淀保存在-80°C。將細胞沉淀以每克細胞3mL緩沖液的比例重懸于勻漿緩沖液中，所述勻漿緩沖液每50mL含有1片完全蛋白酶抑制物合劑(Completeproteaseinhibitococktail)(Roche,LavalQC)。用polytron勻漿器在冰上對細胞懸液進行勻漿以裂解細胞。細胞勻漿在4。C下15,000g離心IO分鐘以去除核顆粒。收集上清，分裝到小管中，并在4。C下75，600g離心90分鐘。小心地從小管中移出上清，并將每份膜沉淀重懸在大約5mL的勻漿緩沖液中。將所有小管中的重懸的膜沉淀合并到一個小管中，并在4。C下75,600g離心90分鐘。小心地去除管中的上清，將沉淀稱重。以每克膜沉淀3mL緩沖液的比例向沉淀中加入含有1%TritonX-100的溶解緩沖液。用平臺式搖床在冰上300rpm振蕩1小時以溶解膜。將膜溶液在75,600g離心以沉淀不溶物。從管中小心地移出含有溶解的膜蛋白的上清，測量蛋白含量，并在-80'C保存。2:SDS-PAGE和Western印跡用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離膜蛋白。將20pg的膜蛋白與含有100mMDTT的SDA-PAGE樣品緩沖液混合，并加載到8%的SDS-PAGE凝膠的泳道中。在參考泳道中運行預染色的分子量標記樣品(Invitrogen,Burlington,ON)。電泳先在100V下進行10分鐘，然后在150V下運行直到觀察到預染分子量標記的足夠的分辨。通過40V下電印跡16小時將蛋白質從凝膠上轉移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜(Millipore，Billerica,MA)上。通過注意觀察預染分子量標記乂人凝膠轉移到膜上來評估轉移情況。轉移后，用含有5%脫脂奶粉和0.5%Tween-20的三羥曱基氨基曱烷(Tris)緩沖鹽水(TBST)封閉膜2小時。用TBST將膜洗滌一次，然后與5/xg/mL的稀釋于含有3%脫脂奶粉的TBST中的11BD-2E11-2共孵育2小時。TBST洗滌3次后，將膜與交聯辣根過氧化物酶(HRP)的山羊抗小鼠IgG(Fc)共孵育，該酶來自JacksonImmunologicals(WestGrovePA)。孵育后用TBST洗滌3次，然后與HRP底物3，3'，5,5'-四曱基聯苯胺(TMB)(來自VectorLaboratories,BurlingtonON的底物試劑盒)共孵育。如圖1，11BD-2E11-2清楚地結合分離的MB-231(泳道1)和OVCAR-3(泳道2)的3個分子量區域。通過與分子量(MW)標準比較，該抗體結合分子量大約為150，240和280kDa的蛋白質。所有進一步的研究都使用MB-231的膜來進行，因為這種細胞系中已經觀察到了更強的反應性。實施例2測定11BD-2E11-2結合的抗原的糖基化為了確定11BD-2E11-2抗體所識別的抗原是否為糖蛋白，將MB-231膜蛋白與不同組合的PNG酶F，內切-o-糖苷酶，唾液酸酶，半乳糖苷酶和氨基葡萄糖苷酶共孵育。用SDS-PAGE分離膜然后作Western印跡，如用11BD-2E11-2所做的一樣。圖2顯示11BD-2E11-2結合MDA-MB-231膜的結果，所述MDA-MB-231膜在單獨的去糖基化H沖液中(泳道l)，與PNG酶F,內切-o-糖苷酶，唾液酸酶，半乳糖苷酶和氨基葡糖苷酶(glucosaminidase)的組合中(泳道2)，與PNG酶，內切-o-糖苷酶和唾液酸酶的組合中(泳道3)，單獨的唾液酸酶中(泳道4),單獨的內切-o-糖芬酶中(泳道5)，和單獨的PNG酶中(泳道6)孵育。用糖苷酶處理MB-231膜并沒有消除11BD-2E11-2的結合，但是所有的的泳道中都發現了蛋白質分子量的偏移，暗示11BD-2Ell-2所識別的抗原是糖蛋白。實施例311BD-2E11-2結合抗原的鑒定1.免疫沉淀通過用11BD-2Ell-2抗體免疫沉淀溶解的膜糖蛋白來分離同源配體(cognateligand),以鑒定11BD-2E11-2對應的抗原。將100/xL的ProteinGDynabeads(DynalBiotech,LakeSuccessNY)用1mL的0.1M磷酸鈉緩沖液,pH6.0洗滌3次。將溶于總體積100jiiL的pH6.00.1M磷酸鈉緩沖液中的100/ig11BD-2Ell-2加入到洗滌后的微珠中。將混合物在旋轉混合下孵育1小時。去掉未結合的抗體，并將11BD-2E11-2包被的抗體用含0.1%Tween-20的pH7.4的磷酸鈉溶液0.5mL洗滌三次。將11BD-2E11-2包被的抗體用0.2MpH8.2的三乙醇胺1mL洗滌2次。加入1mL含0.02M二曱基庚二亞胺酸(dimethylpimelimidate)的0.2M三乙醇胺(pH8.2)并在旋轉混合下孵育30分鐘使11BD-2Ell-2化學交聯到微珠上。將微珠在旋轉混合下與1mL的0.05MTris(pH7.5)孵育15分鐘以終止反應。11BD-2E11-2交聯的孩吏珠用1mL含0.1%Tween-20的1mMKH2P04,10mMNa2HP04，137mMNaCl和2.7mMKC1(PBS)洗滌3次。將11BD-2E11-2交聯的樣O朱與0.1M檸檬酸(pH3.0)孵育3分鐘，然后用含0.1%的Tween-20的0.1MPBS洗滌3遍，進行預洗脫(pre-elute)。用所述相同的方式制備第二套抗體交聯的微珠，其使用抗無關分子三硝基苯酚的小鼠IgGi抗體(克隆107.3，來自BDBiosciences,OakvilleON),作為陰性IgGi同型對照。11BD-2E11-2交聯的微珠在4。C旋轉混合下與含1%BSA的O.IM磷酸鈉(pH7.4)溫育30分鐘來封閉。用0.1M磷酸鈉(pH7.4)將微珠洗滌3次。將500的MB-231細胞全膜制備物與11BD-2E11-2交聯的微珠在4。C旋轉混合下共孵育2.5小時。將結合了免疫復合物的微珠用含1%TritonX-100的1mMKH2P04,10mMNa2HP04,287mMNaCl:2.7mMKC1洗滌3次。將11BD-2E11-2交聯的微珠與0.1M檸檬酸(pH3.0)在輕柔混合下孵育3分鐘以將11BD-2E11-2結合蛋白從微珠上洗脫下來。加入9/iL1MTris(pH9)將洗脫的蛋白調為中性pH。將中和的洗脫蛋白保存于-80。C。11BD-2E11-2交聯的微珠用3mL含0.1%Tween-20的PBS洗滌。將IgGi同型對照(克隆107.3)交聯的微珠與MB-231膜蛋白孵育并按照與11BD-2Ell-2微珠同樣的方式處理。如上所述產生了兩批MB-231膜蛋白的11BD-2E11-2免疫沉淀蛋白并將其合并。對IgQi同型(克隆107.3)對照微珠也同樣操作。將該免疫沉淀混合物的62%(對應于從620/xgMB-231膜蛋白中免疫沉淀下來的蛋白質的量)加載到4-20%梯度SDS-PAGE凝膠的單個泳道中。在相鄰的泳道中加載相同量的107.3交聯微珠產生的物質以及20/xgMB-231膜蛋白。在參考泳道中運行未染色的分子量標記(Invitrogen:BurlingtonON)或預染色的分子量標記樣品。樣品通過在IOOV下電泳10分鐘，然后在150V下電泳60分鐘來分離。將凝月交在SYPRORubyTM(BioRad,Mississauga，ON)中孵育來將蛋白染色。在平行的Western印跡中，將該免疫沉淀混合物的18%，對應于從180/igMB-231膜蛋白中免疫沉淀下來的蛋白質的量，以及同樣量的IgGi同型對照(克隆107.3)交聯微珠所生成物質，用電泳分離。通過40V下電印跡16小時將蛋白從凝膠轉移到PVDF膜(Millipore，Billerica,MA)。轉移后，膜在含5%脫脂奶粉的TBST中孵育2小時來封閉。用5jug/mL的稀釋于含5。/。脫脂奶粉的TBST中的11BD-2Ell-2探測該膜2小時。用TBST洗滌3次后，將膜與HRP交聯的山羊抗小鼠IgG(Fc)共孵育1小時。孵育后用TBST洗滌3次，然后用HRP底物TMB共孵育。圖3顯示11BD-2Ell-2免疫沉淀的蛋白得到的凝膠和Western印跡圖。在凝膠上(圖面A)，泳道1代表分子量標準，泳道2表示MB-231膜蛋白。在含有11BD-2E11-2免疫沉淀物的泳道(泳道3)中有獨特的兩條MW分別為240和280kDa的條帶，其不存在于含有107.3免疫沉淀物的泳道(泳道4)中。在相應的Western印跡中(圖面B),11BD-2E11-2與11BD-2Ell-2免疫沉淀的MW240和280kDa的蛋白強烈地反應(泳道3)。在Western印跡中11BD-2E11-2還和11BD-2Ell-2免疫沉淀的蛋白中150kDa處的另一個條帶強烈反應；這條條帶在染色的凝膠上檢測不到。11BD-2Ell-2對11BD-2Ell-2免疫沉淀的蛋白的反應性特征與MB-231全膜中》見察到的類似(泳道2)。11BD-2Ell-2對IgGi同型對照(克隆107.3，泳道4)免疫沉淀的蛋白質沒有反應性，暗示11BD-2Ell-2針對免疫沉淀的蛋白的結合是特異性的，且并非由雜蛋白的存在而引起。2.質譜用無菌的解剖刀將對應于240和280kDa蛋白的凝膠區域切下。31使用該凝膠片進行MALDI/MS和LC/MS/MS質譜來鑒定蛋白。將樣品在ProGest工作站上用胰蛋白酶進行蛋白酶解，將所得的一部分消化上清用于MALDI/MS分析。點樣用ZipTip自動進行(ProMS);從C18材料上洗脫肽，其中該基質(a-氰基4-羥基肉桂酸)在60%乙腈，0,2%TFA中制備。在VoyagerDE-STR儀(AppliedBiosystems,FosterCityCA)獲取MALDI/MS數據，觀察到的m/z值提交到ProFound(Proteometricssoftwarepackage)進行肽質量指故檢索。ProFound查詢存于本地的NCBInr數據庫拷貝。另一部分消化上清用納米LC/MS/MS分析，其在MicromassQ-Tof2進行，使用75/miCI8柱，流速為200nL/min。使用MASCOT的本地拷貝搜索MS/MS數據。MALDI/MS和LC/MS/MS鑒定的蛋白質如表1所示。表1:通過11BD-2Ell-2免疫沉淀MDA-MB-231膜鑒定的蛋白質<table>tableseeoriginaldocumentpage32</column></row><table>(MCSP)。3.驗證通過測定已知的抗-MCSP抗體能否與11BD-2Ell-2免疫沉淀的蛋白反應，及反之，來驗證該假定的抗原。免疫沉淀物按照上述的方式制備，但添加了小鼠抗-MCSP單克隆抗體9.2.27(IgG2a)(Chemicon，TemeculaCA)和抗無關分子三硝基苯酚的小鼠IgG2a抗體(克隆G155-178,來自BDBiosciences;OakvilleON)，后者作為IgGl同型陰性對照。在六份重復的10%凝月交上分離11BD-2E11-2免疫沉淀物、IgGl同型對照(克隆107.3)免疫沉淀物、抗-MCSP(克隆9.2.27)免疫沉淀物、IgG2a同型對照(克隆G155-228)免疫^:淀物和MB-231膜。電泳和Western印跡如上所述進行。膜與稀釋在含有3%脫脂奶粉的TBST中的5jiig/mL的11BD-2Ell-2、IgGl同型對照(克隆107.3)、抗-MCSP(克隆9.2.27)、IgG2a同型對照(克隆G155-228)、家兔多克隆抗-大鼠NG2抗體(MCSP是大鼠NG2的人源類似物；Chemicon，TemeculaCA)及正常家兔IgG(Sigma,SaintLouisMO)共孵育2.5小時。圖4顯示上述Western印跡的結果。圖4(圖面A)顯示11BD-2E11-2結合11BD-2E11-2免疫沉淀物(泳道1)、IgGl同型對照(克隆107.3)免疫沉淀物(泳道2)、抗-MCSP(克隆9.2.27)免疫沉淀物(泳道3)、IgG2a同型對照(克隆G155-228)免疫沉淀物(泳道4)、MB-231膜(泳道5)和單獨的樣品緩沖液(陰性對照)(泳道6)。11BD-2E11-2在MB-231膜和11BD-2E11-2免疫沉淀物中識別同樣的約1S0,M0和M0kDa的三條帶。在抗-MCSP(克隆9丄27)免疫沉淀物泳道中只有上部的280kDa帶^t識別。任一同型對照免疫沉淀物泳道中都沒有反應，暗示11BD-2Ell-2針對免疫沉淀物的反應性是由于同時被11BD-2E11-2和9.2.27特異性結合并免疫沉淀的蛋白質造成的。在使用IgGl同型對照探測的(克隆107.3)平行印跡中(圖面B)，任何一條泳道中都沒有觀察到反應性，暗示在用11BD-2Ell-2探測的印跡中觀察到的反應性是特異性的。圖面C顯示家兔多克隆抗-大鼠NG2抗體結合平行印跡。抗-NG2結合到11BD-2E11-2免疫沉淀物(泳道l)中兩條大約為150和240kDa的條帶，但其并不結合任何其他泳道中相同分子量范圍的蛋白。在一個平行的印跡中(圖面D)，正常家兔IgG針對IgG2a免疫沉淀物(泳道4)和MB-231膜(泳道5)中的蛋白質顯示微弱的非特異性反應性。因此，圖面C上的這些泳道中(用家兔抗-NG2探測)的相同反應性應該看作是非特異性的。在一個平行的印跡中(圖面E)，抗-MCSP(克隆9.2.27)只顯示與抗-MCSP(克隆9.2.27)免疫沉淀物泳道中的一條帶的非常微弱的結合(泳道3,如尖頭所示)；這條帶在MB-231膜(泳道5)中沒有觀察到，這暗示9.2.27可能對這種抗原具有低的親和性，只有在其以濃縮的形式存在，例如在免疫沉淀的樣品中時才顯示反應性。在最后一個用IgG2a同型對照(克隆G155-228)探測的平行的印跡中(圖面F)，任何泳道中都沒有觀察到反應性，暗示在用抗-MCSP(克隆9.2.27)探測的印跡中觀察到的反應性是特異性的。這些結果顯示，被11BD-2Ell-2免疫沉淀物的蛋白為MCSP的大鼠源類似物所識別，而被抗-MCSP免疫沉淀的蛋白被11BD-2E11-2所識別。質譜鑒定結合使用已知商業化抗體驗證的結果顯示，11BD-2E11-2的抗原是MCSP。這也和實施例2的去糖基化實驗是一致的，因為MCSP的核心蛋白是糖蛋白。實施例4如S.N.10/743,451所提出的，雜交瘤細胞系11BD-2E11-2根據布達佩斯條約于2003年11月11日被保藏于AmericanTypeCultureCollection(美國典型培養物保藏中心)，10801UniversityBlvd.,Manassas,VA20110-2209,保藏號(AccessionNumber)為PTA誦5643。根據聯邦條例法典(CFR)1.808，保藏人保證，所有對于該保藏材料的公眾可用性施加的限制將會在專利授權時不可撤回地消除。抗體生產通過在CL-1000培養瓶(BDBiosciences,Oakville，ON)中培養雜交瘤來生產11BD-2E11-2單克隆抗體，每周進行兩次收集和重接種(reseeding)。抗體用ProteinGSepharose4FastFlow(AmershamBiosciences,Baied'Urfe,QC)根據標準抗體純化程序來純化。如S.N.10/348,231中所描述的,在細胞毒性測試中，將11BD-2E11-2與多種陽性對照(抗國Fas(EOS9.1,IgM，k，20jUg/mL,eBioscience,SanDiego,CA)、抗-Her2/neu(IgGl,/c，10Mg/mL，InterMedico,Markham，ON)、抗-EGFR(C225,IgGl,k,5gg/mL,Cedarlane,Hornby,ON)、》文線菌酮(lOO]tiM),Sigma,Oakville,ON)和NaN3(0.1%,Sigma,Oakville,ON))和陰性對照(107.3(抗陽TNP,IgGl,k，20/xg/mL，BDBiosciences,Oakville,ON)、G155-178(抗-TNP,IgG2a，k，20/ig/mL,BDBiosciences,Oakville,ON)、MPC-11(抗原特異性未知，IgG2b,k，20/xg/mL)、J606(抗-果聚糖，IgG3，zc，20jng/mL)及IgG緩沖液(2%))作比較(表2)。測試了乳腺癌(MDA-MB-231(MB-231),MDA-MB-468(MB-468),MCF-7)、結腸癌(HT-29,SW1116，SW620)、肺癌(NCIH460)、卵巢癌(0VCAR-3(OVCAR))、前列腺癌(PC-3)及非癌(CCD27sk，Hs888Lu)細胞系(都來自ATCC,Manassas,VA)。活/死細月包毒性測定系統得自MolecularProbes(Eugene,OR)。測定按照制造商的指示進行，同時作如下的變化。在測定之前將細胞以確定的合適密度鋪板。2天后，將純化的抗體或對照用培養基稀釋，轉移1000微升到細胞板中并在5。/。C02培養箱中溫育5天。翻轉培養板將其倒空并吸干。用多通道壓擠瓶將室溫的含MgCh和CaCl2的DPBS分施到各個孔中，抽吸(tapped)3次，翻轉倒空，然后吸干。向每個孔中加入50微升稀釋于含MgCl2和CaCl2的DPBS50的熒光鈣黃綠素染料，在37。C的5。/。C02培養箱中溫育30分鐘。用Perkin-Elmer10HTS7000熒光酶標儀讀板，用MicrosoftExcel分析數據，結果列表于表l。該數據代表4個一式三份的實驗的平均，并以下面的形式定性地表示4/4的實驗高于閾值的細胞毒性(+++),3/4的實驗高于閾值的細胞毒性(++)，2/4的實驗高于閾值的細胞毒性(+)。表1中未標記的細胞表示矛盾或低于高于閾值的細胞毒性的作用。11BD-2E11-2在乳腺癌和卵巢癌細胞中是特異性細胞毒性，且不影響正常細胞。化學細胞毒劑導致了預期的細胞毒性，而引入作為比較的其他數種抗體在20個生物細胞測定的限定條件下也如預期的作用。總之，顯示11BD-2E11-2抗體具有針對兩種癌細胞的細胞毒活性。該抗體的這種活性是選擇性的，因為不是所有種類的細胞都對其敏感。另外，該抗體還顯示功能上的特異性，因為其對非癌類細胞不產生細胞毒性，這在治療中是重要的因素。表2乳腺結腸肺卵巢前列腺正常MB-231MB-468MCF-7HT-29SW116SW620NCIH460OVCARPC-3CCD27skHs888Lu11BD-2E11-2一-+-_—-+-一一<table>tableseeoriginaldocumentpage36</column></row><table>用流式細胞術(FACS)評估11BD-2E11-2對上面這組癌細胞和正常細胞系以及下面的卵巢癌細胞系(A2780-cp，A2780-S，C-14,OV2008，Hey,OCC-I，OVCA-429andES-2+SEAP)的結合。首先通過用DPBS(不含Ca—和Mg++)洗滌來制備FACS的細胞。然后使用細胞解離緩沖液(INVITROGEN,Burlington,ON)在37°C下使細胞脫離其培養板。離心收集以后，將細胞重懸于含有MgCl2、CaCl2和2或25%胎牛血清(FBS)的4°CDulbecco's磷酸鹽緩沖鹽水(洗滌培養基)，并計數，分裝到合適的細胞密度，離心沉降細胞，并在冰上將細胞重懸于20/il含有11BD-2E11-2或對照抗體(同型對照或抗-EGFR)的染色培養基(含有MgCl2和CaCl2+/-2Q/。FBS的DPBS)30分鐘。在加入AlexaFluor488交聯的第二抗體之前，用洗滌培養基洗滌細胞一次。然后用20到30分鐘加入溶于染色培養基的AlexaFluor488。然后最后一次洗滌細胞，并將細胞重懸于含有1/ig/mL碘化丙錠或1.5%多聚曱醛的染色培養基。通過在FACScan上運行樣表3<table>tableseeoriginaldocumentpage36</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage37</column></row><table>品，使用CellQuest軟件(BDBiosciences,Oakville，ON)評估流式細胞的捕獲。細胞的前向角散射(FSC)和側向角散射(SSC)通過調節FSC和SSC檢測器的電壓和振幅增益來設定。三個熒光通道(FL1、FL2和FL3)的檢測器通過如下調節運行用同型對照抗體染色的細胞，然后是AlexaFluor488交聯的第二抗體，以使得細胞具有均一的峰，其中值熒光強度為大約1-5單位。通過對FSC設門(gating)和碘化丙錠排除(當其使用時)來捕獲活細胞。對于每個樣品，大約捕獲10,000個活細胞用于分析，結果如表3和4所示。表3和4列出平均熒光強度相對同型對照增加的倍數，如下定性地表示低于5(-);5到50(+);50到100(++)并在括號中，被染色的細胞的百分比(表3和表4列出了平均熒光強度超過同型體的增加倍數<5(-);5-50(+);50-100(++);〉100(+++)，細胞染色細胞的百分比)。代表性的11BD-2E11-2直方圖編為圖5。11BD-2E11-2顯示對乳腺肺瘤細胞系MDA-MB-231(表3)和數種卵巢腫瘤細胞系包括ES-2+SEAP(表4)的特異性肺瘤結合。11BD-2Ell-2也有對非癌細胞的結合，但該結合并未產生細胞毒性。進一步有證據顯示結合并不一定預示著抗體和其同源抗原交連(ligation)的結果，這是一個非顯而易見的發現。該發現暗示在不同的細胞中抗體交連的背景不僅僅對抗體結合，而且對于細胞毒性是決定性的。實施例5正常人類組織染色進行免疫組化研究以鑒定人體中11BD-2E11-2抗原的分布。之前先進行免疫組化的優化研究以確定進一步實驗的條件。如上所述生產和純化11BD-2Ell-2單克隆抗體。使用冷凍的人類正常器官組織陣列(Clinomics，Watervliet,NY)，用抗體結合20種正常人類組織。在冷(-20。C)丙酮中將玻片后固定10分鐘，再使其恢復室溫。將玻片在4。C冷磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)中漂洗3次，每次2分鐘，然后在3%過氧化氬中洗滌IO分鐘以封閉內源的過氧化物酶活性。然后將玻片在PBS中洗3次，經過5分鐘，然后在Universal封閉溶液(Dako,Toronto,Ontario)中室溫下孵育5分鐘。在抗體稀釋緩沖液中(Dako，Toronto,Ontario)將11BD-2Ell-2、抗人肌肉肌動蛋白(克隆HHF35，Dako,Toronto,Ontario)或同型對照抗體(針對黑曲霉(^y/^^7/wm'gw)葡萄糖氧化酶，該酶在哺乳動物組織中既不存在也不能被誘導。)稀釋到工作濃度(對每種抗體為5Mg/mL,但對抗-肌動蛋白為2/ig/mL)并在室溫下孵育過夜1小時。用提供的HRP交聯的第二抗體(DakoEnvisionSystem,Toronto,Ontario)在室溫下經過30分鐘4企測/顯現第一抗體的反應性。這一步后，用PBS將玻片洗滌3次每次2分鐘，然后加入DAB(3，3-二氨基聯苯胺四鹽酸鹽，Dako,Toronto,Ontario)發色團底物溶液產生顏色反應來進行免疫過氧化物酶染色，染色在室溫下進行10分鐘。在自來水中洗滌玻片以終止生色反應。用Meyer'sHematoxylin(SigmaDiagnostics,Oakville,ON)復染后,用梯度濃度的乙醇(95-100%)將玻片脫水，并用二曱苯透明。使用封固劑對玻片進行蓋片。用Axiovert200(ZeissCanada,Toronto,ON)對玻片進行顯微觀察，用NorthernEclipseImaging軟件(Mississauga,ON)采集和保存數字圖象。所得結果由病理學研究人員來閱讀，評分和解析。表5顯示了11BD-2Ell-2對正常人組織針對染色的結果總結。從該表看，組織染色主要有兩類。有一組組織完全是陰性。這些組織包括正常曱狀腺、支氣管和左心室的心肌(圖6)。第二組組織包括這樣的組織，其在組織切片中染色是陽性，單僅限于血管的平滑肌纖維和/或上皮(圖7)。這些結果提示，11BD-2E11-2的抗原在正常組織中不是廣泛表達的，且該抗體只會結合人體中數目有限的正常組織。正常人組織的11BD-2Ell-2染色與先前報道的一種抗-MCSP抗體B538相似。B5先前^皮i正明結合皮膚角質形成細胞，肺泡上皮和毛細血管內皮。表5.對冷凍人正常組織的11BD-2Ell-2免疫組化(IHC)數據表IHC評分序列號組織年齡性別11BD-2E11-2肌動蛋白IgG陰'性對照1支氣管61男-(PD)+++SMF和粘液性腺泡的肌上皮CD2膈61男+++血管SMF+A骨骼肌纖維+++骨骼肌纖維和血管SMF3胸肌(骨骼肌)61男+++血管SMF+++骨骼肌纖維和血管SMF4肺61男+++肺泡上皮和血管SMFCD-(F)主動脈61男十+SMF(F)CD-6左心室(心肌)61男+++血管SMF-+心"/1纖維7食道61男+++SMF(PD)CD-(F)8氣管61男-(PD)+++SMF和粘液性腙_泡的肌上皮9腎61男+++血管SMF+++血管SMF-10腎上腺61男+++血管SMF+++血管SMF-11胰腺61男+++血管的SMF+肺泡上皮+++血管SMF-12脾61男+++血管的SMF和多形核白細刀包(polymorphs)(F)+++血管SMF，網狀纖維和多形核白細胞(F)Bg(多形核白細月包)13肝61男+++血管SMF-(PD)-14皮膚61男+++血管SMF十A角質形成細胞+++血管SMFBg(間質)39<table>tableseeoriginaldocumentpage40</column></row><table>縮寫SMF:平滑肌纖維，Bg:背景染色，PD:部分脫離，F:折疊，CD:完全脫離。實施例6人乳腺肺瘤染色進行免疫組化來確定11BD-2Ell-2抗原和人乳腺癌的結合。與肌動蛋白(陽性對照)和抗黑曲霉葡萄糖氧化酶抗體(陰性對照)作比較，黑曲霉葡萄糖氧化酶是一種在哺乳動物細胞中既不存在也不可被誘導的酶。使用了來自15個乳腺癌患者的乳腺癌組織陣列和5個來自乳腺癌患者的非癌性乳腺組織的樣本(Clinomics,Watervliet，NY)。提供了每個患者的下列信息年齡，性別和診斷結果。依照實施例5的免疫組化程序。表6提供了11BD-2E11-2抗體對乳腺癌組織陣列染色的結合情況的總結。每個陣列含有來自15名單獨患者的腫瘤樣本。總的說來，8個被測試的病人(7個腫瘤樣本或是完全脫離，或者無代表性)中有62%呈11BD-2E11-2抗原陽性。同樣對于11BD-2Ell-2，3個來自乳腺癌患者的正常乳腺組織樣本(同樣有兩個組織樣本完全脫離)中0個為陽性(圖8)。11BD-2E11-2抗原看起來不存在肺瘤階段越高陽性表達越高的傾向。但是由于樣本量小，該結果是受限制的。11BD-2E11-2染色對癌細胞是特異性的(圖8)。11BD-2Ell-2所得的染色模式顯示，在患者的樣本中，該抗體針對惡性細胞是高度特異性的，這就使其成為一種有吸引力的藥用目標。11BD-2E11-2的乳腺腫瘤染色與先前才艮道的抗-MCSP抗體B5的染色相似。B5此先被證明與60%的乳腺癌肺瘤組織結合。表6:對冷凍人正常組織和乳腺腫瘤組織的11BD-2Ell-2免疫組化<table>tableseeoriginaldocumentpage41</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage42</column></row><table>縮寫SMF:平滑肌纖維，PD:部分檢測到，F:折疊，CD:完全脫離。實施例7體內MDA-MB-468成瘤實驗關于圖9:6到8周齡雌性SCID小鼠用溶于100微升鹽水中2百萬個MDA-MB-468人乳腺癌細胞頸背皮下注射才直入。每周用卡尺測量腫瘤生長。當群組中的大多數達到100mn^的肺瘤體積時，隨才幾分配5-6只小鼠到兩個處理組中的每一組。將11BD-2E11-2或緩沖液對照從濃貝i液用含2.7mMKC1，1mMKH2P04,137mMNaCl和20mMNa2HP04的稀釋劑稀釋后，以10mg/kg/劑量通過腹膜下注射施用300微升。然后以相同的方式將該抗體每周施用3次共10次劑量直到植入后的第66天。大約每隔6天用卡尺測量腫瘤生長，測量在本研究的整個期間內都進行，或者直到個體小鼠達到CCAC終點標準為止。在本研究的整個期間內記錄小鼠的體重。研究結束時，根據CCAC指南將所有小鼠無痛苦處死。隨才幾分配時，每個組中的平均腫瘤體積和標準偏差是相似的。統計學上兩組之間沒有體重差異。這說明產生了真正的隨機。如圖9所示，在3周的處理階段結束時，與緩沖液對照相比，抗體11BD-2E11-2抑制了25%的腫瘤生長^=0.52)。雖然這并不是顯著的差別，但是在整個研究過程中都觀察到了相對于緩沖液對照腫瘤體積減小的傾向。因此，11BD-2E11-2在確立的乳腺癌模型中顯示了效力。實施例8體內MDA-MB-468成瘤實驗關于圖10和11:6到8周齡的雌性無胸腺棵小鼠腹膜內植入1千萬個穩定轉染以表達人胎盤分泌的堿性磷酸酶的ES-2+SEAP人卵巢癌細胞(SEAP)。所述1千萬個卵巢癌細胞重懸于500微升無血清的a-MEM中。第7天犧牲3只小鼠確證腫瘤生長。第7天確認腫瘤生長之后，將8只小鼠隨機分配到2個處理中的每一組中。將11BD-2E11-2或緩沖液對照從濃貯液用含2.7mMKC1，1mMKH2P04，137mMNaCl和20mMNa2HP04的稀釋劑稀釋后，以10mg/kg/劑量通過腹膜下注射施用250微升。然后將抗體每天一次施用5個劑量，然后每兩天一次施用5個劑量，總共10個劑量。然后通過測量循環的SEAP的水平來推斷并根據尸體解剖來觀測腫瘤負荷，該推斷或觀測在整個研究期間都進行，或到單個小鼠達到CCAC的終點指標為止。在本研究的整個期間內記錄小鼠的體重。研究結束時，根據CCAC指南將所有小鼠無痛苦處死。隨機分配時分析循環血漿SEAP水平(指示腫瘤負荷)。11BD-2Ell-2和緩沖液對照之間平均SEAP水平沒有顯著差異。但是，在組內有變化的成瘤率(tumortakerate)。如圖10所示，抗體11BD-2Ell-2在處理組的群中顯示了提高生存的趨勢。如圖ll所示，一只接受11BD-2Ell-2處理的小鼠的循環SEAP的量降到幾乎可忽略的水平。該低循環SEAP水平一直持續到植入后第60天。總之，這些11BD-2E11-2在多種人癌癥模型中產生了效益(相對于對照處理提高的生存和降低的腫瘤負荷)的結果提示了這種抗體用于哺乳動物包括人的的癌癥治療的藥理學和藥學效益。43大多數證據顯示11BD-2Ell-2通過與MCSP上存在的表位連接而介導抗癌作用。對本發明而言，該表位被定義為"MCSP抗原性部分"(MCSPantigenicmoiety),其特征在于可結合雜交瘤細胞林11BD-2E11-2所編碼的單克隆抗體或其抗原結合片段或其抗體交聯物。實施例3中已經顯示了11BD-2E11-2可以用從表達細胞，例如MDA-MB-231細胞免疫沉淀其同源抗原。進一步還可以證明，11BD-2E11-2抗體可用于通過例如但不限于流式細胞術、細胞ELISA或免疫組化分析等手段檢測表達與其特異性結合的MSCP抗原性部分的細胞和/或組織。由此，利用流式細胞術、細胞ELISA或免疫組化分析可以證明，被免疫沉淀的11BD-2Ell-2抗原可抑制11BD-2Ell-2結合這樣的細胞或組織。另夕卜，和11BD-2E11-2抗體一樣，其他抗-MCSP抗體可以用來免疫沉淀并分離其他形式的MCSP抗原，而且，^使用同種分析，該抗原也可用來抑制上述抗體結合表達該抗原的細力包或組織。本發明書中提及的所有專利和出版物都指示本發明相關
技術領域：
的現有技術水平。所有專利和出版物都通過引用并入本發明，其程度相當于單獨地和具體地指明將每一出版物通過引用并入。應當理解，盡管本發明的一種特定形式被闡明了，但本發明并不限于這種特定形式或本文中描述和顯示的部分的排列。對本領域的技術人員而言顯而易見的是，可以在不脫離本發明的范圍的同時作出多種變化，且本發明不應凈皮認為限于本說明書所顯示和描述的。本領域的技術人員很容易理解，本發明很好地適于實現本文提到和內在包含的目標，并獲得本文提到和內在包含的結果和收益。本文中描述的任何寡核苷酸、肽、多肽、生物學上相關的化合物、方法、程序和技術在此都代表所述優選的實施方式，其是作為示例，而不是作為對范圍的限制。本領域的技術人員可以想到其中的變化和其他用途，這些都被涵蓋在本發明的精神之中并由所附權利要求的范圍所限定。盡管本發明已經結合特定的優選實施方式得到描述，應當理解的是本發明，如已申明的，不應被過分地限制于這些具體的實施方式。毫無疑問，對于所描述的本發明的實施模式所作的、對本領域的技術人員而言顯而易見的各種修改，都被認為包含在下面的權利要求的范圍之內。權利要求1.抗癌抗體或其片段在制備治療患者癌性疾病的藥物中的用途，所述抗癌抗體或其片段的特征在于，其對于癌性組織的細胞是細胞毒性的，且對于非癌性細胞是基本上良性的；其中所述抗體或其片段與藥學上可接受的佐劑能夠制成混合物；所述抗體為分離的單克隆抗體或其抗原結合片段，其結合所述癌性組織表達的抗原性部分，所述抗原性部分的特征在于其被這樣的抗體所識別該抗體具有在ATCC保藏為PTA-5643的克隆所編碼的單克隆抗體的鑒定性特征。2.根據權利要求1所述的用途，其中所述分離的單克隆抗體或其抗原結合片段是人源化的或嵌合的。3.根據權利要求1所述的用途，其中所述抗體或其抗原結合片段與選自毒素、酶、放射性化合物和血源性細胞的成員交聯而形成抗體交聯物；以及其中所述抗體交聯物或交聯片段與藥學上可接受的佐劑能夠制成混合物。4.根據權利要求3所述的用途，其中所述抗體或其片段是人源化的或嵌合的。5.根據權利要求1所述的用途，其中通過抗體依賴性細胞毒性來介導所述抗體或其片段的細胞毒性。6.根據權利要求1所述的用途，其中通過補體依賴性細胞毒性來介導所述抗體或其片段的細胞毒性。7.根據權利要求1所述的用途，其中通過催化細胞化學鍵的水解來介導所述抗體或其片段的細胞毒性。8.根據權利要求1所述的用途，其中通過產生針對位于腫瘤細胞上的推測的腫瘤抗原的免疫反應來介導所述抗體或其片段的細胞毒性。9.根據權利要求1所述的用途，其中通過靶向細胞膜蛋白以干擾其功能來介導所述抗體或其片段的細胞毒性。10.根據權利要求1所述的用途，其中通過產生可有效地產生引發細胞殺傷的信號的細胞蛋白質中的構象變化來介導所述抗體或其片段的細胞毒性。11.抗癌抗體或其片段在制備用于治療患者癌性疾病的藥物中的用途，其中所述抗癌抗體或其片段的特征在于其對于癌性組織的細胞是細胞毒性的，且對于非癌性細胞是基本上良性的；其中所述抗體是由在ATCC保藏為PTA-5643的克隆所編碼的分離的單克隆抗體或其抗原結合片段，且能夠與藥學上可接受的佐劑混合。12.根據權利要求11所述的用途，其中所述抗體或其片段是人源化的或嵌合的。13.根據權利要求11所述的用途，其中所述抗體或其抗原結合片段與選自毒素、酶、放射性化合物和血源性細胞的成員交聯而形成抗體交聯物；以及其中所述交聯的抗體能夠與藥學上可接受的佐劑混合。14.根據權利要求13所述的用途，其中所述抗體或其片段是人源化的或嵌合的。15.根據權利要求11所述的用途，其中通過抗體依賴性細胞毒性來介導所述抗體或其片段的細胞毒性。16.根據權利要求11所述的用途，其中通過補體依賴性細胞毒性來介導所述抗體或其片段的細胞毒性。17.根據權利要求11所述的用途，其中通過催化細胞化學鍵的水解來介導所述抗體或其片段的細胞毒性。18.根據權利要求11所述的用途，其中通過產生針對位于胂瘤細胞上的推測的肺瘤抗原的免疫反應來介導所述抗體或其片段的細胞毒性。19.根據權利要求11所述的用途，其中通過靶向細胞膜蛋白以干擾其功能來介導所述抗體或其片段的細胞毒性。20.根據權利要求11所述的用途，其中通過產生可有效地產生引發細胞殺傷的信號的細胞蛋白質中的構象變化來介導所述抗體或其片段的細胞毒性。21.分離的單克隆抗體或其抗原結合片段在制備介導在細胞表面表達MCSP抗原性部分的人腫瘤細胞的細胞毒性的藥物中的用途，所述抗體或其抗原結合片段能夠與所述的表達的抗原性部分的分離的單克隆抗體或其抗原結合片段相結合，所述抗原性部分的特征在于其被這樣的抗體所結合該抗體具有在ATCC保藏為PTA-5643的克隆所編碼的單克隆抗體的鑒定性特征，所述結合從而導致細胞毒性發生。22.根據權利要求21所述的用途，其中所述分離的抗體或其抗原結合片段是人源化的或嵌合的。23.根據權利要求21所述的用途，其中所述分離的抗體或其抗原結合片段能夠與選自毒素、酶、放射性化合物和血源性細胞的成員交聯，從而形成抗體交聯物。24.根據權利要求23所述的用途，其中所述分離的抗體或其抗原結合片段是人源化的或嵌合的。25.根據權利要求21所述的用途，其中所述分離的抗體或其抗原結合片段是鼠源的。26.根據權利要求21所述的用途，其中所述人腫瘤選自乳腺腫瘤。27.確定細胞存在的結合測定方法，所述細胞表達MCSP抗原性部分，所述抗原性部分與分離的多克隆抗體或其抗原結合片段特異性地結合，所述分離的多克隆抗體由在ATCC保藏為PTA-5643的克隆所編碼；所述結合測定方法包括提供細胞樣品;提供分離的多克隆抗體或其抗原結合片段，所述抗體或其抗原結合片段是結合所述表達的MCSP抗原性部分的分離的單克隆抗體及其片段，所述抗原性部分的特征在于其被這樣的抗體所結合該抗體具有在ATCC保藏為PTA-5643的克隆所編碼的單克隆抗體的鑒定性特征；使所述分離的單克隆抗體或其抗原結合片段與所述細胞樣品接觸；并確定所述分離的單克隆抗體或其抗原結合片段與所述細胞樣品的結合；藉此，可以確定表達MCSP抗原性部分的細胞的存在，其中所述MCSP抗原性部分特異性地結合所述分離的單克隆抗體或其抗原。28.根據權利要求27所述的結合測定方法，其中所述細胞樣品是從選自乳腺組織的組織中發生的腫瘤獲得的。29.分離的多克隆抗體或其抗原結合片段在制備用于確定細胞存在的結合測定的試劑中的用途，所述細胞表達MCSP抗原性部分，所述抗原性部分與分離的多克隆抗體或其抗原結合片段特異性地結合，所述分離的多克隆抗體由在ATCC保藏為PTA-5643的克隆所編碼。30.根據權利要求29所述的用途，其中所述細胞來自乳腺腫瘤。31.從樣品中分離或篩選細胞的方法，其中所述細胞表達MCSP抗原性部分，所述抗原性部分與分離的單克隆抗體或其抗原結合片段特異性地結合，所述抗原性部分的特征在于其被這樣的抗體所結合該抗體具有在ATCC保藏為PTA-5643的克隆所編碼的單克隆抗體的鑒定性特征；該分離或篩選細胞的程序包括提供細胞樣品；提供分離的單克隆抗體或其抗原結合片段，所述抗體或其抗原結合片段是結合所述表達的MCSP抗原性部分的分離的單克隆抗體及其片段，所述抗原性部分的特征在于其被這樣的抗體所結合該抗體具有在ATCC保藏為PTA-5643的克隆所編碼的單克隆抗體的鑒定性特征；使所述分離的單克隆抗體或其抗原結合片段與所述細胞樣品接觸；并確定所述分離的單克隆抗體或其抗原結合片段與所述細胞樣品的結合；藉此，通過所述結合分離了所述細胞并確證了這些細胞在所述細胞樣品中的存在，其中所述細胞表達MCSP抗原性部分，所述抗原性部分與分離的單克隆抗體或其抗原結合片段特異性地結合，所述單克隆抗體由在ATCC保藏為PTA-5643的克隆所編碼。32.根據權利要求31所述的方法，其中所述細胞樣品是在乳腺組織中發生的腫瘤。33.單克隆抗體或其抗原結合片段在制備通過在哺乳動物中治療人類肺瘤來延長生存和/或延遲疾病進展的藥物中的用途，其中所述腫瘤表達抗原，所述抗原與所述單克隆抗體或其抗原結合片段特異地結合，所述單克隆抗體具有在ATCC保藏為登錄號PTA-5643的克隆所編碼的單克隆抗體的鑒定性特征。34.根據權利要求33所述的用途，其中所迷抗體與細胞毒性部分交聯。35.根據權利要求33所述的用途，其中所述細胞毒性部分是放射性同位素。36.根據權利要求33所述的用途，其中所述抗體激活補體。37.根據權利要求33所述的用途，其中所述抗體介導抗體依賴性細月包毒性。38.根據權利要求33所述的用途，其中所述抗體是鼠源抗體。39.根據權利要求33所述的用途，其中所述抗體是人源化抗體。40.根據權利要求33所述的用途，其中所述抗體是嵌合抗體。全文摘要癌性疾病調節抗體(CDMAB)11BD-2E11-2用于治療人類腫瘤的用途和分離及鑒定癌性細胞的方法，所述癌性細胞表達黑色素瘤相關硫酸軟骨素蛋白聚糖(MCSP)抗原性部分。單克隆抗體11BD-2E11-2(ATCC登錄號PTA-5643)與MCSP抗原性部分結合，其對于表達該抗原部分的癌細胞是細胞毒性的。單克隆抗體11BD-2E11-2可用于延遲人類腫瘤的疾病進展。文檔編號A61K51/10GK101254303SQ200710308359公開日2008年9月3日申請日期2005年3月23日優先權日2004年3月26日發明者大衛·S·F·楊,海倫·P·芬德利,艾莉森·L·費里,蘇姍·E·哈恩申請人:阿里烏斯研究公司