核酸分子cxsi3及其在制備抗癌藥物中的應用的制作方法

專利名稱：核酸分子cxsi3及其在制備抗癌藥物中的應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于生物醫藥領域，涉及一種核苷酸分子及其在制備抗腫瘤藥物中的應用。
背景技術：
腫瘤疾病現已上升為世界第2號〃殺手〃，其死亡人數僅次于心血管病。幾年來， 國外醫學界對于腫瘤疾病的發病機理在細胞基礎上又有了新的認識。基于對腫瘤發 病機制的進一步理解，人們利用各種途徑來研制和開發能夠特異，有效地殺傷腫瘤細 胞而對正常細胞無毒性的藥物。目前，對于癌癥的治療仍以化療及放療為首選，兩 者雖對腫瘤的治療取得了相當的療效，但由于缺乏對腫瘤細胞的特異性因而具有較大 的毒副作用以及某些腫瘤細胞對化療和放療處理的不敏感，因此在很大程度上限制了 它們在臨床中的應用。近年來，為了開發出能特異性地殺傷癌細胞而對正常細胞無 毒負作用的藥物，人們對癌癥的發病機制從細胞,分子水平上的研究予以高度重視和 巨額投資。

發明內容
本發明的目的是提供一種用于制備抗腫瘤藥物的核苷酸分子。 本發明的另一個目的是提供上述核苷酸分子的應用。
本發明提供了一種用于制備抗腫瘤藥物的核苷酸分子，它具有抑制腫瘤生長的 活性并且其序列包括5' -GCAGAUUUACCGGUUCGUU-3'或者5， - GCAGATTTACCGGTTCGTT -3，。在本發明中被稱為CXSI3。
其中，A、 T、 U、 G和C分別是腺嘌呤核苷酸、胸腺嘧啶核苷酸、尿嘧啶核苷酸、 鳥嘌呤核苷酸和胞嘧啶核苷酸。
3在本發明中，術語"核苷酸分子CXSI3 "該術語還包括 5' -GCAGAUUUACCGGUUCGUU-3'或者5， - GCAGATTTACCGGTTCGTT -3'的核苷酸序列 變異形式。這些變異形式包括若干個(通常為1-15個，較佳地1-10個，更佳地l-5 個)核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5'和/或3'端添加數個(通常為IO個以 內，較佳地為5個以內)核苷酸。例如，在5' -GCAGAUUUACCGGUUCGUU-3'后(3 '端) 加入若干dT (脫氧胸苷)后形成的序列。
本發明中，CXSI3可以是具有抑制腫瘤生長的活性并且包括 5， -GCAGAUUUACCGGUUCGUU-3， dTdT的序列。
本發明中，CXSI3可以是具有抑制腫瘤生長的活性并且是 5' -GCAGAUUUACCGGUUCGUU-3' dTdT的序列。
本發明中，CXSI3可以是具有抑制腫瘤生長的活性并且是5'-GCAGATTTACCGGTTCGTT -3， 的序列。
在本發明中，可選用本領域已知的各種載體，如市售的載體，與CXSI3連接成 為重組載體。例如，可以采用慢病毒、腺病毒或者森林腦炎病毒表達系統(Semliki Forest Virus)。慢病毒(Lentivirus)屬于逆轉錄病毒亞屬，以人類免疫缺陷病毒 (human immunod efficiency virus, HIV)為代表.慢病毒不僅具有感染分裂耙 細胞并整合其基因組中，尤其是具有感染包括神經元細胞、巨噬細胞、肝細胞、心肌 細胞和干細胞等在內的多種非分裂細胞能力，因而，慢病毒載體己作為基因轉移的有 效工具，被廣泛應用于基因功能尤其是基因治療的研究。
另一方面，本發明還提供了上述的核苷酸分子CXSI3的制備方法，即按CXSI3 的序列，將各核糖核酸分子依次脫水縮合。
本發明的核苷酸分子CXSI3可以采用各種常規的制備方法制備。本發明的核苷 酸分子CXSI3序列通常可以用酶解法或人工合成的方法獲得。
本發明還提供了上述的核苷酸分子CXSI3在制備抗腫瘤藥物中的應用。 實驗表明，將本發明的CXSI3轉入H1299細胞，結果表明，H1299細胞呈現出明 顯的G1期阻滯。本發明的CXSI3還可抑制腫瘤細胞增殖。將CXSI3或者含有CXSI3的細胞施用 于裸鼠，與相同培養條件下未施用CXSI3的裸鼠相比，前者瘤體的增長明顯受到抑制， 而且這種現象隨著時間的推移日益明顯。
本發明的核苷酸分子CXSI3及其類似物，當在治療上進行施用(給藥)時，可提 供不同的效果。通常，可將這些物質配制于無毒的、惰性的和藥學上可接受的水性載 體介質中，其中pH通常約為5-8，較佳地pH約為6-8，盡管pH值可隨被配制物質 的性質以及待治療的病癥而有所變化。配制好的藥物組合物可以通過常規途徑進行給 藥，其中包括(但并不限于)肌內、腹膜內、皮下、皮內、或局部給藥。
以本發明的核苷酸分子CXSI3為例，可以將其與合適的藥學上可接受的載體聯 用。這類藥物組合物含有治療有效量的化合物和藥學上可接受的載體或賦形劑。這類 載體包括(但并不限于)鹽水、緩沖液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其組合。藥物
制劑應與給藥方式相匹配。本發明的核苷酸分子CXSI3可以被制成針劑形式，例如用 生理鹽水或含有葡萄糖和其他輔劑的水溶液通過常規方法進行制備。諸如片劑和膠囊 之類的藥物組合物，可通過常規方法進行制備。藥物組合物如針劑、溶液、片劑和膠 囊宜在無菌條件下制造。活性成分的給藥量是治療有效量，例如每天約1微克/千克 體重-約10毫克/千克體重。此外，本發明的CXSI3還可與其他治療劑一起使用。
當本發明的核苷酸分子CXSI3被用作藥物時，可將治療有效劑量的該多肽施用于 哺乳動物，其中該治療有效劑量通常至少約10微克/千克體重，而且在大多數情況下 不超過約8毫克/千克體重，較佳地該劑量是約10微克/千克體重-約l毫克/千克體重。 當然，具體劑量還應考慮給藥途徑、病人健康狀況等因素，這些都是熟練醫師技能范 圍之內的。
本發明中，所述的抗腫瘤藥物是由含有效治療量的核苷酸分子CXSI3和藥學上 的載體或者賦形劑組成的藥物組合物。所述藥物組合物可以是針劑或者片劑。其有效 治療量可以為每天1微克/千克至10毫克/千克體重。所述藥物可以是針劑、粉劑或 者片劑。
本發明的核苷酸分子CXSI3加入H1299，結果細胞呈現出明顯的G1期阻滯；施 用于裸鼠時，與相同培養條件下的對照裸鼠相比，瘤體的增長明顯受到抑制，而且這 種現象隨著時間的推移日益明顯。本發明為腫瘤的治療和緩解提供了一種新的途徑和手段。
具體實施例方式
實施例一 CXSI3對細胞周期的影響
采用上海吉凱基因技術有限公司的GeneChem Easy-siRNA合成的CXSI3。 用Lipofectamine 2000轉染siRNA的實驗操作步驟
(1) 細胞于轉染前一天接種于24孔板，所加培養基體積為500ul。轉染時細胞 融合率應為40%-50%.
(2) 配制工作母液2. 5nmo1 (1. 0 0D)的雙鏈siRNA中加入125ul 1 XUniversal Buffer,得到濃度為20uM的siRNA母液。
(3) 以下稀釋步驟(4和5)中可以用不含血清的Opti-MEM(Invitrogen)，也可 以用其他不含血清的培養基。
(4) 對于24孔板的每個孔，用O. 84ug siRNA雙鏈。把3ul20uM的siRNA雙鏈 與50ul0pti-MEM混合。
(5) 將Lipofectamine 2000試劑盒輕柔搖勻，取lul Lipofectamine 2000試 劑在另一管中與50ul Opti-MEM混合，室溫下孵育5分鐘。
(6) 把稀釋后的siRNA與稀釋后的Lipofectamine 2000進行混合，輕輕混勻。 室溫下溫育20分鐘。
(7) 把siRNA與Lipofectamine 2000的混合液加入培養細胞，輕輕混勻然后將 細胞放入培養箱。
(8) 在檢測RNAi效果之前一般無需換液。但如果轉染試劑有明顯細胞毒性，可 在轉染滿3小時時換液。
結果，細胞呈現出明顯的G1期阻滯。
實施例二抑制裸鼠腫瘤生長
2.1裸鼠(上海斯萊克實驗動物有限公司)成瘤大量培養檢測SK-H印l細胞， 胰酶消化，離心收獲所培養的細胞，用PBS洗滌后計數，重懸于PBS，并將細胞用一 次性注射器對裸鼠進行皮下注射，每組注射》5只，(雌性，30-40天)，每只裸鼠的 細胞注射量為200 [4，細胞數約為106， 一周后腫瘤長出。
62.2病毒注射當腫瘤體積長至10-30隱3體積時，將20 W含有3 X 107 TU 滴度病毒的PBS用注射器直接注射進入腫瘤內。實驗組注射LV-CXSI3病毒，對照組 注射LV-non-silencing病毒。兩天后，再用同樣的方法和劑量注射一次病毒。
2. 3腫瘤監測和瘤塊切取每天檢測小鼠的狀態，每三天測量一次腫瘤的體積。 實驗組和對照組小鼠各五只進行測量，從感染第29天起，實驗組腫瘤和對照組腫瘤 體積出現顯著差異。32天后，處死小鼠，并從皮下取出瘤塊進行稱量。
結果顯示，與對照組相比，注射了含有CXSI3的裸鼠瘤體生長明顯減慢。這說 明，本發明的CXSI3可以明顯抑制腫瘤生長。
權利要求
1. 一種核苷酸分子，其特征在于，它具有抑制腫瘤生長的活性并且其序列包括5’-GCAGAUUUACCGGUUCGUU-3’或者5’-GCAGATTTACCGGTTCGTT-3’。
2. 如權利要求1所述的一種核苷酸分子，其特征在于，它具有抑制腫瘤生長 的活性并且其序列包括5， -GCAGAUUUACCGGUUCGUU-3' dTdT。
3. 如權利要求1所述的一種核苷酸分子，其特征在于，它具有抑制腫瘤生長 的活性并且其序列是5' -GCAGAUUUACCGGUUCGUU-3， dTdT。
4. 如權利要求1所述的一種核苷酸分子，其特征在于，它具有抑制腫瘤生長 的活性并且其序列是5' - GCAGATTTACCGGTTCGTT -3'。
5. —種如權利要求1-4中任一種核苷酸分子的制備方法，其特征在于，按權 利要求1-4中任一種核苷酸分子的序列，將各核糖核酸基團或者脫氧核糖核酸基團 依次脫水縮合。
6. 如權利要求卜4中任一種核苷酸分子在制備抗腫瘤藥物中的應用。
全文摘要
本發明屬于生物醫藥領域，涉及一種核苷酸分子及其在制備抗腫瘤藥物中的應用。本發明提供了一種用于制備抗腫瘤藥物的核苷酸分子，它具有抑制腫瘤生長的活性并且其序列包括5’-GCAGAUUUACCGGUUCGUU-3’或者5’GCAGATTTACCGGTTCGTT-3’。在本發明中被稱為CXSI3。本發明的核苷酸分子CXSI3可以細胞停止于G1期；施用于裸鼠時，與相同培養條件下的對照裸鼠相比，瘤體的增長明顯受到抑制。
文檔編號A61P35/00GK101503450SQ200810033579
公開日2009年8月12日 申請日期2008年2月5日 優先權日2008年2月5日
發明者龍 余, 翔 王 申請人:復旦大學