專利名稱：防風多糖在制備抗肝腫瘤藥物中的應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于醫藥技術領域，具體說是防風多糖在制備治療抗腫瘤藥物中的新用途。
背景技術：
中藥防風為傘形科植物防風Saposhnikovia divaricata (Turcz.) Schischk.的干燥根。中醫學
認為防風性辛、甘，溫。歸膀胱、肝、脾經。具有解表祛風，勝濕，止痙的功效。臨床用
于感冒頭痛，風濕痹痛，風疹瘙癢，破傷風等。
防風常常用在復方中治療上述病癥，如防風、荊芥、葛根治風邪傷衛，有汗惡風；川 芎五錢，柴胡七錢，黃連(炒)、防風(去蘆)、羌活各一兩，炙甘草一兩五錢，黃芩三兩(去皮， 銼， 一半酒制， 一半炒)，治偏正頭痛；防風、川芎、當歸、芍藥、大黃、薄荷葉、麻黃、連 翹，芒硝各半兩，石膏、黃芩、桔梗各一兩，滑石三兩，甘草二兩，荊芥、白術、梔子各5 分，治風熱拂郁，筋脈拘倦，肢體焦痿，頭目昏眩，腰脊強痛，耳鳴鼻塞，口苦舌干，咽嗌 不利，胸膈痞悶，咳嘔喘滿，涕唾稠粘，腸胃燥，熱結，便溺淋閉等癥。
現代藥學技術研究表明，防風根含3'-0-當歸酰亥茅酚(3'-0-angdoyl-hamaudo1)、 5-0-甲 基齒阿密醇(5-0-methylvisammino1、 p-谷甾醇、甘露醇以及木蠟酸(lignoceric acid)為主的長鏈 脂肪酸。尚含揮發油、前胡素(dacursin)和色原酮甙(chromone)。還含升麻素及升麻素苷等。 現代藥理學研究結果表明，防風具有如下功能l.解熱作用對人工發熱家兔，經口給予關防 風煎劑或浸劑，有明顯解熱作用，煎劑的作用較浸劑好。2.鎮痛作用小鼠灌服防風(品種未鑒 定)50%乙醇浸出液潔去乙醇)，能明顯提高痛閾(電刺激鼠尾法)，皮下注射同樣有效。3.抗菌 作用新鮮關防風搾出液在體外試驗，對綠膿桿菌及金黃色葡萄球菌有一定抗菌作用。品種 未經鑒定的防風煎劑對溶血性鏈球菌及痢疾桿菌也有一定的抗菌作用。4.防風醇浸膏給家兔 皮下注射，對血糖無影響。5.有解熱、鎮痛、鎮靜和抗驚厥、抗炎、抗病原微生物等作用。
但是目前還沒有發現有關防風多糖在治療抗腫瘤方面的用途。
發明內容
本發明的目的是提供防風多糖在制備抗肝腫瘤藥物方面的新用途。 本發明的技術方案為防風多糖在抗人肝癌細胞株HepG-2中作用。
具體實施例方式
以下結合實施例對本發明的內容作進一步說明。實施例1
1材料與方法
1. 1實驗動物和肝癌細胞株
雄性新西蘭家兔，體重2. 0 2. 5kg，人肝癌細胞株HepG陽2。 1. 2實驗藥物
防風多糖溶液。制備方法為將lkg防風在50'C烘箱中烘12小時后將其粉碎；加入6L
無水乙醇回流提取2次，每次1小時，藥渣在自然條件下晾干備用；取防風藥渣加一定量的
水，進行提取，離心棄渣，將提取液減壓濃縮至適當的體積后，加入三倍體積的95%乙醇， 靜置過夜，離心，收集沉淀用少量的蒸餾水溶解后裝入透析袋中在流水中透析3天，透析后 清液即得。
陽性對照藥物五氟尿嘧啶注射液。
1. 3主要試劑及儀器
DMEM培養基、新生牛血清均為美國GIBCO公司產品；MTT(Lot 921102)由華美生物工 程公司提供；Bax單抗、Bcl2單抗、P53單抗、即用型S—P法免疫組化試劑盒、DAB顯色 劑均由福建邁新公司提供。倒置相差顯微鏡為日本OLYMPUS公司產品；CO培養箱為美國 SHELLAB公司產品；超凈工作臺由天津市醫藥凈化設備廠生產；流式細胞儀(2000FCA)由美 國BD公司生產。
1. 4方法
1. 4. 1細胞培養人肝癌細胞株HepG — 2接種于含10新生牛血清和抗生素(IOO U / ml青霉素和100 / ,g / ml鏈霉素)的DMEM培養基中，培養環境為5 CO 、 37°C、飽和濕度。 細胞培養3 5天后以0. 25胰蛋白酶消化傳代。
1. 4. 2含藥血清的制備將9只雄性家兔分為防風多糖溶液組、陽性藥物對照組和空 白對照組，每組3只。防風多糖溶液組以防風多糖0.05g/kg/天灌胃，陽性藥物組以41.67mg /kg/天灌胃，空白對照組以l. 5 g/kg/天生理鹽水灌胃，各組連續3天，于最后一次灌 胃后2h無菌取頸動脈血，2 500 r / min離心20 min、收集血清，采用0. 2m微孔濾膜抽濾 滅菌，經56。 C、 30min滅活以去除血清中補體，為含藥血清，按組混合后置-20。C保存，臨 用時用DMEM培養基稀釋成不同濃度。
1. 4. 3各組H印G — 2凋亡細胞的檢測分組培養。
空白對照組僅加入培養基培養；陽性藥物組加入含五氟尿嘧啶藥物血清(IO )的培養基培 養；防風多糖溶液組加入含博癌丸藥物血清(5 、 10 、 15)的培養基培養。48h后收集各組細 胞，2 000r/min離心
10min，去上清，用PBS洗2遍后在震蕩狀態下緩緩滴入一 20 C預冷的75乙醇固定。4 h后用PI染液(含RNA酶)染色30 min。利用流式細胞儀定量檢測DNA降解、線粒體膜電 位、通透性變化等鑒定和計數100個培養細胞中凋亡細胞數，并計算各組細胞凋亡率。 1. 4. 4凋亡調控基因Bcl — 2、 Bax、 P53表達的檢測
空白對照組，10陽性藥物組，5 、 10 、 15防風多糖藥物血清組細胞培養48h后，爬 片并用PBS漂洗兩遍，經4多聚甲醛固定30min， PBS洗滌后自然風干，一20C保存，檢 測方法按免疫組化(S—P法)試劑盒說明書進行。
1. 5統計學處理
計量資料以均數士標準差(土s)表示，組間比較采用t檢驗；凋亡率用百分率()表示，率 的比較采用卡方檢驗。PO. 05為差異有顯著性統計學意義。 2結果
2. 1HepG — 2細胞凋亡率
防風多糖藥物血清作用HepG — 2細胞48 h后，細胞凋亡率分別為18. 31% 、 25. 34 % ，均顯著高于空白對照組(3. 49% )， P<0. 05。
2. 2防風多糖對HepG — 2細胞凋亡調控基因的影響
Bax、 Bcl-2、 P53蛋白主要定位于細胞漿，也可見于細胞膜，染色陽性部位呈棕褐色。本 實驗每組平行3孔，每孔分別計數300個細胞。各藥物組Bcl-2表達與空白對照組比較，差 異無顯著性意義(PX). 05); Bax、 P53表達與空白對照組比較，呈強陽性，且陽性細胞數明 顯增多，PO. 05 0. 01;防風多糖藥物血清組Bax、 P53表達與陽性藥物組相比無顯著性 差異，P>0. 05。
權利要求
1.防風多糖在制備抗肝腫瘤藥物中的應用。
2. 防風多糖在制備抗人肝癌細胞株H印G-2中應用。
全文摘要
本發明屬于醫藥技術領域，具體說是防風多糖在制備治療抗腫瘤藥物中的新用途。
文檔編號A61K31/715GK101601704SQ20081004347
公開日2009年12月16日 申請日期2008年6月11日 優先權日2008年6月11日
發明者勇 王 申請人:上海玉森新藥開發有限公司