專利名稱：黃背木耳發酵物、含該發酵物的口服制劑及制法和應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及采用中藥材與黃背木耳發酵制備而得的發酵產物及其制備方法，并涉及該發酵物的衍生產品及在醫藥保健食品領域的應用。
背景技術：
目前對于多種藥用、食用真菌代謝產物的研究，尤其涉及多糖類的抗腫瘤研究已有許多報道。長期以來其生產研究主要集中在液體深層發酵技術方面，又以借鑒抗生素生產工藝為主要方式；液體深層發酵技術生產效率較高，產品質量較穩定，但存在成本較高、耗能大、且易受污染、不易操作等技術問題。
由于我國具有豐富的中藥資源，現研究領域新興的雙向型發酵技術即是將中藥添加到真菌發酵底物中用于混合發酵的發酵技術，利用中藥在發酵過程中抑制或促進真菌生長，或是影響代謝的作用，同時真菌又能通過微生物轉化的作用將中藥中的某些成分進行合成或修飾對中藥起到減毒增效的作用。若將適當的中藥材作為真菌發酵培養基或培養基的一部分成分，使其既提供真菌生長所需營養，同時又因真菌的分解和合成作用產生新的成分，從而使其性質發生變化；同時因不同種類真菌的生理代謝過程不同，基質中采用的中藥材品種不同，因而使得發酵產生的物質可能具有的性質變得不可預測，但是要在數以千計的中藥資源中與目前常用的藥用、食用真菌配對培養發酵，以求獲得兼具真菌和中藥材的功效、或產生新功效的藥性菌質、或兼有原有營養基質和中藥材基質的全性菌質發酵終產物的隨機性和不可預測性則大大增加。
發明內容
本發明所解決的技術問題是提供一種具有活血化瘀、抗炎鎮痛、抗脂質過氧化、清除自由基、增強免疫促進代謝作用的全新的發酵產物。
該發酵產物是以黃背木耳Auricularia Polytricha(Mont)Sacl為起始菌種，在其培養基質中加入丹參，采用固體發酵的方式所得到的包含菌絲體及培養基質成分在內的菌質混合物。
具體地，在培養基中包括提供碳源和氮源的成分，以重量百分比計為玉米芯3％～78％、麥麩8％～24％、玉米粉2％、蔗糖1％、食用級石膏粉1％，剩余部分為丹參。
通過相關藥理實驗證明，該固體發酵物具有活血化瘀、抗炎鎮痛、抗脂質過氧化、清除自由基、增強免疫促進代謝的作用。
本發明所解決的第二個技術問題則是在該固體發酵物的基礎上制備衍生產品，即是以黃背木耳固體發酵物為活性成分，加入藥學上可接受的輔料制備而得的口服制劑，如常規的膠囊劑、片劑、顆粒劑、散劑、口服液，甚至于緩釋制劑、控釋制劑等后續產品；或加入食品上可接受的添加劑制備而得的食品或保健食品。制備上述產品是為了方便公眾對該發酵產物的利用，根據實際需要生產成便利的產品。
本發明所解決的第三個技術問題是提供該固體發酵物的一種制備方法，具體地即采用固體發酵技術。其培養基質中的碳源和氮源成分以重量百分比計為玉米芯3％～78％、麥麩8％～24％、玉米粉2％、蔗糖1％、食用級石膏粉1％，剩余部分為丹參；其中所述丹參為粉末；取黃背木耳菌絲體置于培養基質中發酵，在15～25℃的溫度條件下發酵30～50天得到包含菌絲體及培養基質成分在內的菌質混合物。該制備方法簡單易行，原料成本低廉易得，還避免了采用液體發酵方式存在的成本較高、耗能大、且易受污染、不易操作等技術問題。
本發明所解決的第四個技術問題是提供該固體發酵物的用途，即是應用于制備具有活血化瘀、抗炎鎮痛、抗脂質過氧化、清除自由基、增強免疫促進代謝功效的藥品、保健食品，該固體發酵物作用廣泛，無副作用。
具體實施例方式 本發明黃背木耳固體發酵物，其培養基質包括碳源和氮源成分，在培養基質中加入丹參，通過丹參對黃背木耳菌絲體生長代謝過程的影響和黃背木耳真菌酶系對丹參改造在內的雙向性固體發酵后，得到的兼具丹參藥材和黃背木耳真菌功效的菌質發酵產物，在本申請文件中又稱菌質混合物。
培養基質中加入重量百分比為10～85％的丹參，便于混合，需將丹參粉碎為粉末。其余物質為碳源和氮源成分，可以采用黃背木耳常用的碳源及氮源成分。根據培養基篩選實驗顯示，當丹參在培養基質中所占重量配比為10～70％時，黃背木耳菌絲體均能正常生長，無生長抑制現象，生長速度也無差別。
發明人所采用的固體培養基質中的碳源和氮源成分以重量百分比計為玉米芯3％～78％、麥麩8％～24％、玉米粉2％、蔗糖1％、食用級石膏粉1％，其余成分為丹參(含量約為10～85％)。
而通過實驗結果顯示，培養基質中加入重量百分比為70％的丹參時，即采用玉米芯2％、麥麩24％、玉米粉2％、蔗糖1％、食用級石膏粉1％，丹參70％作為培養基質可以獲得較好和滿意的結果，并且隨培養基質中丹參藥材添加比例的增高，多糖和蛋白含量也呈現逐漸增高的趨勢。
采用添加了丹參的培養基質采用固體發酵的方式制備黃背木耳固體發酵物，其溫度條件為15～25℃，發酵時間為30～50天，較優的發酵時間為35～40天，得到的包含菌絲體及培養基質成分在內的菌質混合物即為黃背木耳固體發酵物，此時子實體還基本未長出。在培養基質中所添加的丹參既可以是藥材丹參，也可以是丹參邊角料，即全株除入藥以外的部分，以及藥材加工過程中產生的邊角料次等品、廢棄物，使用該部分即可實現所生產的固體發酵物具有藥用功效，利用這些邊角料成本也將大大降低，提高對丹參藥材的利用率。
為了便于公眾實際應用，可以將所得的黃背木耳固體發酵物作為活性成分，加入藥學上可接受的輔料，采用常規的制劑方法制備口服制劑；也可以按照保健食品或食品常用的制備方法，加入常用添加劑制備，或者與食品主料成分(如米、面、雜糧等主食性淀粉成分，或糖果、糕點、飲料等其它食品的主要原料成分)混合食用。
以下提供幾種常用口服制劑的制備方法，但并不應將此理解為本發明上述主題的范圍僅限于以下的實例。在不脫離本發明上述技術思想情況下，根據本領域普通技術知識和慣用手段做出的各種替換或變更，均應包括在本發明的范圍內。
若將本發明黃背木耳固體發酵物與常規輔料(蜂蜜、單糖漿、山梨酸、苯甲酸等)混合均勻后，分裝滅菌，即得口服液。
若將本發明黃背木耳固體發酵物與常規輔料(水溶性賦形劑、乙醇等)通過制粒、干燥、整粒、包裝等過程，即得顆粒劑。
若將本發明黃背木耳固體發酵物與淀粉、乳糖混勻，成規方法制粒后，加入硬酯酸鎂整粒，壓片，即得。具體地，稱取本發明黃背木耳固體發酵物100g、淀粉60g、乳糖30g、硬酯酸鎂10g，共制成1000片，得到每片含黃背木耳固體發酵物100mg的片劑。
以下通過對培養基質及發酵條件的篩選說明采用本發明方法制備而得的黃背木耳固體發酵物所具有的優點。并通過相關藥理實驗證明該發酵產物所在保健醫療方面所具有的意想不到的功效。
(一)培養基質的選擇 以如表1所示的不同組成形式的培養基質對黃背木耳在含有丹參的培養基質中的生長適應性進行了試驗，表1中的“其他成分”是重量比為2∶1∶1的玉米粉、蔗糖和食用級石膏粉，然后按黃背木耳的常規發酵方式操作。
黃背木耳的常規發酵方式母菌種由PDA斜面培養基保存。按培養基質配方，加水拌勻，含水量為60％，裝袋后壓實，每袋裝料500g，中間打一個圓洞，用牛皮封口并扎緊，115MPa高壓滅菌，保持3小時，或常壓滅菌，煮沸后保持24小時。冷卻后，無菌操作接入黃背木耳母菌種，把接好種的瓶子放在培養室培養，培養室內溫度應保持在22-25℃。
表1固體發酵培養基
發酵結果顯示，所有組合的培養基質均適于黃背木耳菌絲體生長，無生長抑制現象，就生長速度而言組間無明顯差別。
從接種開始記錄黃背木耳菌絲體在固體發酵培養基上的平均生長速度，生長速度見表2，由表2繪制的黃背木耳菌絲體生長曲線顯示菌絲體生長可分為四個階段(1)萌芽期(0-6d)菌絲生長較慢，菌絲較纖弱；(2)旺盛期(6-8d)菌絲活力較強，代謝旺盛，生長快；(3)下降期(8-13d)菌絲生長速度急劇下降；(4)回升期(13-15d)菌絲生長速度有所回升；(5)衰退期(15-35d)菌絲活力衰退，菌絲老齡化，開始分泌黃褐色素。該實驗結果表明，菌絲生長至接種13天后，生長速度趨于平穩且不斷下降，至30天后，生長速度趨于平緩不變。
以苯酚-硫酸比色法觀察上述黃背木耳/丹參全性菌質固體發酵體系總多糖含量的動態變化 (1)取樣方法從接種日起，每隔10d分別取各組合的固體發酵樣品3袋(3個平行)，各袋分別烘干打粉(40目)作為受測樣品。
(2)供試品溶液的制備①提取上清液精密稱取樣品細粉5g(約相當于多糖0.22g)，置燒瓶中，加水100ml置電爐上加熱回流提取1.5h，放冷至室溫，3000～4000rpm離心10min后收集上清液，少量水分次洗滌燒瓶及離心管，同樣離心收集上清液。②提取多糖沉淀合并全部上清液置蒸發皿中，置電爐上小心加熱(避免焦化)濃縮到約15ml，放冷至室溫，加乙醇100ml，攪勻，放置使其沉淀15分鐘。轉移此溶液連同沉淀于離心管中，繼續用少量80％乙醇以玻棒充分刮洗蒸發皿，洗液和沉淀同樣轉移至離心管中，以3000～4000rpm速度離心15min，棄去上清液，在離心管中加入少量80％乙醇，輕輕洗滌，同樣離心棄去上清液(保留沉淀物)。然后將離心管(連同沉淀物)于50℃烘箱揮干乙醇，然后加熱水溶解沉淀，轉移至250ml量瓶中，繼續用熱水以玻棒充分刮洗離心管，洗液同樣轉移至250ml量瓶中，放冷至室溫，用水定容至刻度，搖勻，精密量取5ml置100ml量瓶中，用水定容至刻度，搖勻即得供試品溶液。
(3)標準曲線的制作精密稱取105℃干燥至恒重的無水葡萄糖適量，加水配制成0.85mg/ml的貯備液。精密吸取1.0，2.0，3.0，4.0，5.0ml分別置于50ml量瓶中加水定容至刻度，搖勻得葡萄糖稀釋液。再分別精密量取上述各稀釋液2ml置具塞試管中，同時精密量取水2.0ml置另一具塞試管中，各管分別加5％苯酚溶液(新制)1ml，搖勻，然后迅速加入濃硫酸5.0ml，立即搖勻，于40℃水浴中保溫30min，取出，置冰水浴中5min。以上述2.0ml水所制得的空白溶液做參比，于490nm波長處測定各溶液吸收度，以葡萄糖稀釋液的濃度(μg/ml)為橫坐標，吸收度為縱坐標，繪制標準曲線。
(4)樣品測定取供試品溶液2.0ml置具塞試管中，按“標準曲線的制作”項下同法加苯酚溶液和濃硫酸，測定吸收度。根據樣品吸收度從標準曲線上讀取葡萄糖濃度，再計算出樣品中總多糖的含量(以葡萄糖計)。實驗結果見表3所示。
由表3繪制的圖表顯示，隨著發酵時間的增長，各組合粗多糖含量基本呈逐漸下降趨勢，從接種后10天到30天，變化較為劇烈；接種后30天到50天，變化趨勢變緩，至50天取樣時粗多糖含量與40天時相比已基本不變。
以考馬斯亮藍法觀察該全性菌質固體發酵體系粗蛋白含量動態變化 (1)取樣方法從接種日起，每隔10d取各組的固體發酵樣品2-4袋，按組分別混合后烘干打粉(40目)作為樣品。
(2)供試品溶液的制備①提取上清液精密稱取樣品細粉5g(約相當于多糖0.22g)，置燒瓶中，加水100ml置電爐上加熱回流提取1.5h，放冷至室溫，3000～4000rpm離心10min，收集上清液，用少量水分次洗滌燒瓶及離心管，同樣離心收集上清液。合并全部上清液置蒸發皿中，置電爐上小心加熱(避免焦化)濃縮到約20ml，放冷至室溫。
(3)標準曲線的制作準確稱取100mg牛血清白蛋白，溶于100ml蒸餾水中，即為1000μg/ml的牛血清白蛋白標準溶液。精密吸取牛血清白蛋白標準溶液0.02ml、0.04ml、0.06ml、0.08ml、0.10ml、0.20ml、0.40ml、0.60ml、0.80ml、1.00ml分別置于具塞試管中加水定容至1ml，搖勻得牛血清白蛋白稀釋液，各管分別加考馬斯亮藍工作液(新制)5ml，搖勻，以1.0ml水所制得的空白溶液做參比，于590nm波長處測定各溶液吸收度，以牛血清白蛋白稀釋液的濃度(μg/ml)為橫坐標，吸收度為縱坐標，繪制標準曲線。
(4)樣品測定取供試品溶液1.0ml置具塞試管中，按“標準曲線的制作”項下同法加考馬斯亮藍工作液，測定吸收度。根據樣品吸收度從標準曲線上讀取蛋白質濃度，再計算出樣品中蛋白質的含量。實驗結果見表4。
由表4繪制的圖表顯示，隨著發酵時間的增長，各組合的粗蛋白含量基本呈逐漸下降趨勢，從接種后10天到30天，變化較為劇烈；接種后30天到50天，變化趨勢變緩，至50天取樣時粗蛋白含量與40天時相比已基本不變。
上述試驗結果顯示，以營養性成分的重量比例為玉米芯2％～78％、麥麩8％～24％、玉米粉2％、蔗糖1％、食用級石膏粉1％，其余為藥用原料丹參為培養基質，特別是以玉米芯2％、麥麩24％、玉米粉2％、蔗糖1％、食用級石膏粉1％，丹參70％可以獲得較好和滿意的結果，并且隨培養基質中丹參藥材添加比例的增高，多糖和蛋白含量也呈現逐漸增高的趨勢。黃背木耳在上述的培養基質中按常規方式進行的固體發酵時，常溫下(約15～25℃)，發酵30～50天，更好的是在固體發酵35～40天，收集包含菌絲體及培養基質成分在內的菌質混合物，可以獲得理想的效果。
表2黃背木耳菌絲體在固體發酵培養基上的平均生長速度(cm/d)
表3黃背木耳菌絲體在固體發酵過程中的粗多糖含量(mg/g) 表4黃背木耳菌絲體在固體發酵過程中的粗蛋白含量(μg/g)
(二)藥理實驗 通過下述顯示，本發明黃背木耳-丹參固體發酵物(簡稱黃丹菌質)可以具有明顯優于單一的黃背木耳或丹參藥材，以及按常規方式相互組合的黃背木耳、丹參混合藥物的生物學功能。
樣品制備 (1)黃丹菌質組在下述藥理實驗中均采用的是編號為12的培養基質發酵所得的黃丹菌質，發酵條件為常溫下(約15～25℃)，發酵35～40天。收獲黃丹菌質，烘干后用10倍體積蒸餾水100℃提取30分鐘，提取3次，濃縮后為黃丹菌質樣品。
(2)黃背木耳菌質組用無丹參的培養基，常溫下(約15～25℃)，發酵35～40天。收獲菌質，烘干后用10倍體積蒸餾水100℃提取30分鐘，提取3次，濃縮后為黃背木耳菌質樣品。
(3)黃背木耳/丹參混合藥物組用無丹參的培養基礎，常溫下(約15～25℃)，發酵35～40天，烘干后添加與編號為12的培養基質中相同比例的中藥丹參，后用10倍體積蒸餾水100℃提取30分鐘，提取3次，濃縮后為黃背木耳/丹參混合藥物樣品。
(4)丹參藥材組用10倍體積蒸餾水100℃提取丹參中藥30分鐘，提取3次，濃縮至與黃丹菌質中丹參濃度相同，為丹參藥材樣品 一、黃丹菌質對小鼠凝血時間(CT)的影響 實驗動物KM種小鼠50只，體重20±2g。
實驗方法將小鼠分為黃丹菌質組(0.15g/10g，即每10g體重小鼠灌胃黃丹菌質中丹參含量為0.15g，折算成黃丹菌質為0.15÷丹參在黃丹菌質中的比例，以下同)、正常組(蒸餾水0.2ml/10g)、黃背木耳/丹參混合藥物組(用無丹參單獨發酵的黃背木耳菌質代替除與黃丹菌質等比例的丹參藥材外的其余部分，以下同)、黃背木耳空白對照組(無丹參單獨發酵的黃背木耳菌質，灌胃劑量同黃丹菌質組即0.15÷丹參在黃丹菌質中的比例，組合12為0.15÷0.7≈0.2ml/10g，以下同)和丹參藥材組(與黃丹菌質同批次藥材，0.15g丹參生藥/10g，即每10g體重小鼠灌胃0.15g丹參水提取液，以下同)，每組各10只，雌雄各半，每日灌胃給藥，正常組每日給予等量水灌胃，連續7d。末次給藥后1h用內徑1mm玻璃毛細管插入小鼠內眥球后靜脈叢取血，自血液流人管中開始計時，血液注滿后取出毛細管平放于桌上，每隔30s折斷兩端毛細管，并緩慢向左右拉開，觀察折斷處是否有血凝絲，至血凝絲出現時停止計時，所得時間即為CT。結果以X±S表示，組間行t檢驗。
實驗結果經單因素方差分析表明，黃背木耳/丹參混合藥物組、黃丹菌質組、丹參藥材組的凝血時間與正常組相比有顯著延長(P＜0.05)，黃丹菌質組略好于黃背木耳/丹參混合藥物組和丹參藥材組，提示其具備抑制小鼠的凝血功能。結果如表5所示。
表5黃丹菌質對小鼠凝血時間(CT)的影響
注與正常對照組相比＊＊P＜0.01，＊P＜0.05。
二、黃丹菌質對小鼠尾出血時間的影響 實驗動物KM種小鼠50只，體重20±2g。
實驗方法將小鼠分為黃丹菌質組、正常組、黃背木耳/丹參混合藥物組、黃背木耳、空白對照組和丹參藥材組，每組各10只，雌雄各半，每日灌胃給藥，模型組每日給予等量水灌胃，連續7d。末次給藥后1h取小鼠置于固定器中，使其尾部垂直，距尾尖1.5mm處剪斷，用濾紙吸血直至吸不出血為止，記錄斷尾尖至吸不出血的時間即為尾出血時間。
實驗結果黃丹菌質組、丹參藥材組的尾出血時間明顯長于正常組(P＜0.05)，說明黃丹菌質組具有能夠抑制小鼠血凝系統的功能。結果如表6所示。
表6黃丹菌質對小鼠尾出血時間的影響
注與正常對照組相比＊＊P＜0.01，＊P＜0.05。
三、黃丹菌質對小鼠尾部血栓形成的影響 實驗動物KM種小鼠50只，體重20±2g。
實驗方法將小鼠分為黃丹菌質組、正常組、黃背木耳/丹參混合藥物組、黃背木耳空白對照組和丹參藥材組，每組各10只，雌雄各半，每日灌胃給藥，模型組和正常組每日給予等量水灌胃，連續7d。給藥第4天注射1.5％角叉菜膠于小鼠左右后肢腳掌皮下，每只腳掌0.03ml(0.06ml/只)，注射完畢后于18℃培養，繼續給藥3天，并于注射后24h，48h，72h測量小鼠全尾長度和尾部血栓長度，計算血栓率。
實驗結果表明，黃丹菌質組與模型組比較，血栓長度明顯縮短，差異極顯著(P＜0.01)，丹參藥材組也表現出一定趨勢，說明丹參的確具有一定的活血化瘀功能，而黃丹菌質在此方面的藥效更勝于丹參藥材。結果如表7所示。
表7黃丹菌質對小鼠尾部血栓形成的影響
注與正常對照組相比＊＊P＜0.01，＊P＜0.05。
四、黃丹菌質對小鼠耳廓微循環的影響 實驗動物KM種小鼠50只，體重20±2g。
實驗方法將小鼠分為黃丹菌質組、正常組、黃背木耳/丹參混合藥物組、黃背木耳空白對照組和丹參藥材組，每組各10只，雌雄各半，每日灌胃給藥，模型組每日給予等量水灌胃，連續7d。末次給藥前，各小鼠ip12.5％戊巴比妥鈉0.4mg/kg麻醉，將小鼠右耳廓部用脫毛劑脫毛，耳廓平展于耳托上，64倍物鏡觀察，觀察部位的確定距耳廓邊緣約1.5～2mm處，在平行于耳廓邊緣方向，自中間細動脈開始右行約1mm范圍內為觀察部位。將測微尺(0-1000μm)置于此處。凡與該測微尺相交之血管均視為有效，對其進行BI.2000圖像系統分析。選擇流速穩定區域微動脈(A)、微靜脈(V)各一條并標記，記錄血管管徑及血液流速。而后給藥3d。在末次給藥后0.5h，同法麻醉并測定標記血管管徑及血液流速。分析給藥前后管徑及血液流速變化情況。以給藥前后兩次結果差值(ΔV，ΔA)及血流速度之差作為微循環改善情況的指標。實驗數據進行t值檢驗和方差分析。
實驗結果顯示，各給藥組對管徑增加值與正常對照組進行比較，經統計學檢驗，均達到極顯著性差異(P＜0.01)，小鼠微動脈、微靜脈血液也明顯加快。各給藥組組對血液流速增加值與正常對照組進行比較，經統計學檢驗，均達到極顯著性差異(P＜0.01)。結果如表8所示。
表8黃丹菌質對小鼠耳廓微循環的影響
注與正常對照組相比＊＊P＜0.01，＊P＜0.05。
五、黃丹菌質對急性腦缺血缺氧小鼠的保護作用 實驗動物KM種小鼠60只，體重20±2g。
實驗方法將小鼠分為黃丹菌質組、正常組、黃背木耳/丹參混合藥物組、黃背木耳空白對照組和丹參藥材組，每組各10只，雌雄各半，每日灌胃給藥，模型組每日給予等量水灌胃，連續7d。末次給藥后30min，200g/L烏拉坦1.0g/kg靜脈注射麻醉，分離雙側頸總動脈及迷走神經，用手術線同時結扎，觀察小鼠的存活時間(每分鐘呼吸少于或等于5次為死亡)。
實驗結果顯示，黃丹菌質可顯著延長小鼠結扎雙側頸總動脈及迷走神經后的存活時間，與正常組比較差異顯著(P＜0.05)，說明其可能是通過改善缺血腦組織的血氧供應，起到對缺血腦組織損傷起到保護作用的。結果如表9所示。
表9黃丹菌質對急性腦缺血缺氧小鼠的保護作用
注與正常對照組相比＊＊P＜0.01，＊P＜0.05。
六、黃丹菌質對斷頭小鼠喘息時間的影響 實驗動物KM種小鼠20只，體重20±2g。
實驗方法將小鼠分為黃丹菌質組、正常組、黃背木耳/丹參混合藥物組、黃背木耳空白對照組和丹參藥材組，每組各10只，雌雄各半，每日灌胃給藥，模型組每日給予等量自來水灌胃，連續7d。末次給藥1h后，自小鼠耳后根部快速斷頭，記錄小鼠斷頭后喘息的時間(s)。
實驗結果顯示，黃丹菌質組相比正常組，斷頭后喘氣時間明顯延長，增幅約達到13.4％，提示其具有一定的抗腦缺血缺氧作用。結果如表10所示。
表10黃丹菌質對斷頭小鼠喘息時間的影響
注與正常對照組相比＊＊P＜0.01，＊P＜0.05。
七、黃丹菌質對腦缺血小鼠腦毛細血管通透性的影響 實驗動物KM種小鼠20只，體重20±2g。
實驗方法將小鼠分為黃丹菌質組、模型組、假手術組，每組各10只，雌雄各半，每日灌胃給藥，模型組每日給予等量水灌胃，連續7d。①伊文思藍標準曲線的制備將伊文思藍配制成系列濃度(0.39，0.78，1.56，3.12，6.24，12.48，24.96g/m1)，分光光度計620nm處測定吸光度(A)值，以濃度為橫坐標，以吸光度(A)值為縱坐標，得回歸直線方程。②小鼠腦缺血后腦中伊文思藍含量的測定末次給藥后1h，假手術組尾靜脈注射伊文思藍50mg/kg，分離兩側頸總動脈但不結扎，其余各組在結扎兩側頸總動脈前5min，尾靜脈注射伊文思藍50mg/kg。結扎3h后斷頭，小心剝取兩側大腦半球，稱重，加入0.5％NaSO43ml與丙酮7ml，勻漿，密封放置1h，3000rpm離心10min，取上清液，以丙酮-硫酸(3比7)混合液調零，620nm處測定吸光度。根椐標準曲線計算出腦內伊文思藍的含量(g/g腦濕重)。
實驗結果表明，與假手術組比較，模型組小鼠腦缺血后腦中伊文思藍含量明顯降低；與模型組比較，黃丹菌質能顯著降低小鼠腦缺血后腦中伊文思藍含量(P＜0.05)。結果如表11所示。
表11黃丹菌質腦缺血小鼠腦毛細血管通透性的影響
與假手術組比較，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；與模型組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01。
八、黃丹菌質對腦缺血小鼠腦組織MDA含量、SOD活性的影響 實驗動物KM種小鼠20只，體重20±2g。
實驗方法將小鼠分為黃丹菌質組、模型組、假手術組，每組各10只，雌雄各半，每日灌胃給藥，模型組每日給予等量水灌胃，連續7d。①小鼠腦缺血后腦組織勻漿液的制備末次給藥后1h，假手術組分離兩側頸總動脈但不結扎，其余各組在結扎兩側頸總動脈3h后斷頭，小心剝取兩側大腦半球，稱重，按重量∶體積＝1∶9的比例加入預冷的生理鹽水(4℃)，用組織勻漿器充分勻漿，將勻漿液以1500g，4℃離心12min，取上清液，用考馬斯亮藍法測定總蛋白含量，-70℃凍存備用。②腦組織SOD活性、MDA含量的測定i.取1％大腦組織勻漿液，采用黃嘌呤氧化酶法(SOD檢測試劑盒)，于波長550nm處分別測定各組小鼠大腦組織勻漿液的吸光度值。ii.取1％大腦組織勻漿液，采用TBA比色法(MDA檢測試劑盒)，于波長532nm處分別測定各組小鼠大腦組織勻漿液的吸光度值。
實驗結果顯示，與假手術組比較，模型組小鼠腦缺血后腦中MDA含量明顯增高，SOD活性明顯降低；與模型組比較，黃丹菌質能顯著降低小鼠腦缺血后腦中MDA含量，顯著提高腦組織SOD活性(P＜0.05)。試驗結果如表12所示。
表12黃丹菌質對腦缺血小鼠腦組織MDA含量、SOD活性的影響
與假手術組比較，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；與模型組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01。
九、黃丹菌質的毒性試驗 1、給小鼠灌食最大給藥濃度和劑量都不致死，不能測出黃丹菌質的半數致死量。
2、用黃丹菌質進行了大鼠致畸胎試驗、Ames試驗、小鼠骨髓微核試驗和染色體畸變試驗，證明該藥無致畸和致突作用。
毒性時間結果證明本發明黃背木耳固體發酵物安全無毒。
上述各項試驗結果充分表明，本發明黃背木耳固體發酵物不僅無明顯毒副作用，而且在活血化瘀、抗炎鎮痛、抗脂質過氧化和清除自由基、增強免疫促進代謝等方面，可具有明顯優于單一的黃背木耳、丹參藥物原料、也優于其常規方式混合(復方)藥物的生物學功能，且原料來源豐富，提取和制備方法并無特殊要求和限制。
權利要求
1、黃背木耳固體發酵物，為培養基質上接種黃背木耳發酵而得，其培養基質包括碳源和氮源成分，其特征在于在培養基質中加入了丹參。
2、根據權利要求1所述的黃背木耳固體發酵物，其特征在于培養基質中加入重量百分比為10～85％的丹參。
3、根據權利要求2所述的黃背木耳固體發酵物，其特征在于培養基質中加入重量百分比為70％的丹參。
4、根據權利要求1所述的黃背木耳固體發酵物，其特征在于所述固體培養基質中的碳源和氮源成分以重量百分比計為玉米芯3％～78％、麥麩8％～24％、玉米粉2％、蔗糖1％、食用級石膏粉1％，剩余部分為丹參。
5、根據權利要求4所述的黃背木耳固體發酵物，其特征在于所述固體培養基質中的碳源和氮源成分以重量百分比計為玉米芯2％、麥麩24％、玉米粉2％、蔗糖1％、食用級石膏粉1％，剩余部分為丹參。
6、根據權利要求1～5任一項所述的黃背木耳固體發酵物，其特征在于其固體發酵的溫度條件為15～25℃，發酵時間為30～50天。
7、以權利要求1所述的黃背木耳固體發酵物為活性成分制備而得的口服藥物制劑或食品。
8、權利要求1所述的黃背木耳固體發酵物的制備方法，其特征在于它包括如下步驟
A、制備固體培養基質培養基質中的碳源和氮源成分以重量百分比計為玉米芯3％～78％、麥麩8％～24％、玉米粉2％、蔗糖1％、食用級石膏粉1％，剩余部分為丹參；
B、接黃背木耳于培養基質中發酵，得到包含菌絲體及培養基質成分在內的混合物。
9、根據權利要求8所述的黃背木耳固體發酵物的制備方法，其特征在于步驟B所述的發酵條件為在15～25℃的溫度條件下發酵30～50天。
10、權利要求1所述的黃背木耳固體發酵物在制備具有活血化瘀、抗炎鎮痛、抗脂質過氧化、清除自由基、增強免疫促進代謝功效的藥品、保健食品中的應用。
全文摘要
本發明涉及采用中藥材與黃背木耳發酵制備而得的發酵產物及其制備方法，并涉及該發酵物的衍生產品及在醫藥保健食品領域的應用，本發明所解決的技術問題是提供一種具有活血化瘀、抗炎鎮痛、抗脂質過氧化、清除自由基、增強免疫促進代謝作用的全新的發酵產物，它是以黃背木耳Auricularia Polytricha(Mont)Sacl為起始菌體，在其培養基質中加入丹參，采用固體發酵的方式所得到的包含菌絲體及培養基質成分在內的菌質混合物。通過相關藥理實驗證明，該固體發酵物在活血化瘀、抗炎鎮痛、抗脂質過氧化、清除自由基、增強免疫促進代謝作用方面與丹參相比，具有相當于丹參或高于丹參藥效的效果。
文檔編號A61K36/06GK101524374SQ20081004487
公開日2009年9月9日 申請日期2008年3月4日 優先權日2008年3月4日
發明者霞 羅, 鄭林用, 巍 魏, 許曉燕, 葉利明, 費小凡 申請人:德陽市食用菌專家大院