專利名稱：丹參酮類化合物作為cyp1家族特異性抑制劑的用途的制作方法
技術領域：
本發明涉及天然藥物領域，具體涉及丹參提取物中二帖類化合物(丹參酮)在逆轉B[a]p誘導的CYP1酶的表達，以及直接抑制CYP1酶的活力的應用。
背景技術：
隨著經濟的發展、環境污染的加重，惡性腫瘤的發病率逐年上升，目前己被臨床界定為常見病、多發病，嚴重威脅了人類的健康。細胞色素P450(CYP)是一個由結構和功能相關的基因超家族(superfamily)編碼的同工酶所組成的超家族酶系，參與許多內源性和外源性物質的生物轉化，在調節機體與外界環境的相互作用以及保持機體內環境的穩態中起著十分重要的作用。在已知的人類P450超家族中，主要有CYP1， CYP2和CYP3三個基因家族。CYP1家族包含三大成員CYP1A1 、 CYP1A2和CYP1B1。主要參與一系列芳烴類化合物的氧化和內源性甾體激素的代謝。它廣泛存在于肝外組織，如肺、乳腺、子宮、中樞神經等，其中只有CYP1A2存在于肝臟中。現在流行病學研究發現CYP1家族的表達和癌癥的發生和易感性高度相關
(Carcinogenesis. 2003; 24: 1533-1539; American Journal of Epidemiology. 2005; 161:卯1-915;molecular cancer research 2006; 4: 135-150; BMC Cancer 2007, 7:123-129)。多環芳烴(PHAs)，雜環芳香胺(HAAs)等化學前致癌物可以被CYPl家族代謝從而生成活性中間產物(致癌物)。CYP1家族也容易被此類前致癌物質誘導，在靶器官中高度表達，產生惡性循環。因此在靶器官中致癌物對CYP1家族的誘導一般認為是致癌易感性的重要決定性因素。有意思的是CYPlBl在惡性腫瘤中特異性高度表達(Mutation Research. 2003: 173—182)。研究發現CYPIBI參與雌二醇的代謝，產生有致癌性的4-羥化產物，從而在乳腺癌的形成發病過程中起著重要作用(Carcinogenesis. 2002; 23: 1625-1630)。而且，CYP1A1、 IBI參于了大量抗癌藥物的代謝，會導致藥物治療的失敗，被認為是產生癌癥治療多藥耐藥的重要因素之一 (BiochemicalPharmacology. 2001; 62: 207—212; The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics.2001;296:537-541)。
因此對CYP1家族酶(尤其是1B1)的抑制劑一方面可以抑制前致癌物的活化，另一方面可以逆轉多藥耐藥，從而起到防癌治癌的作用。最近的研究發現大量的植物提取物和天然產物(及其衍生物)具有直接抑制CYP1家族酶活力和抑制其蛋白表達的能力。其中包括黃酮類，大黃蒽醌，異硫氰酸酯類，兒茶素，多酚類，芪類及其衍生物等等。這些天然產物對CYPl家族酶活力和表達的調節能力，往往被認為是很多草藥和保健食物發揮抗癌效用的重要原因。 因此以細胞色素P450 (特別是CYP1B1)為靶點的抗腫瘤藥物研究正在成為研究熱點，所以 從天然產物中尋取CYP1的特異性抑制劑，逐漸成為抗癌防癌藥物開發的一個新的重要途徑 丹參為唇形科植物丹參(mA^ m'Wo廳/^a)的干燥根及根莖，在中國使用已有兒百年歷 史，廣泛地用于心血管疾病的治療。自20世紀30年代以來，國內外學者對丹參的活性成分和 藥理作用進行了大量研究，并得到了許多化學成分，其藥理學研究表明，丹參對心腦血管系 統、消化系統、呼吸系統、中樞神經系統、免疫系統等均有保護作用fThe Journal of Clinical Pharmacology 2005;45:1345-1359; International Journal of Cardiology. 2007; 121: 9- 22)。丹參酮 (tanshinone)是丹參的乙醚或乙醇提取物，均含有鄰醌或對醌的結構，總稱丹參酮類化合物， 被認為是丹參中主要活性成分之一。其中主要有丹參酮I (tanshinone I )，丹參酮II A( tanshinone 11A )，隱丹參酮(cryptotanshinone) ， 二氫月'參酮I (dihydrotanshinone I)，表 現出抗腫瘤、抗炎、心肌保護等多種生物活性。但對其選擇性地抑制CYPIBI亞型酶活力以及 逆轉B[a]p (benzo[a]pyrene)誘導的CYP1酶表達尚無研究報道。其結構式如下
Tanshinone 1 dihydrotanshi醒e I
發明內容
本發明公開四種丹參酮(丹參酮I (tansh inone I )，月.參酮II A( tanshinone IIA )，隱丹參酮 (cryptotanshinone) ， 二氫丹參酮I (dihydrotanshinone I )新的藥理用途，即其既可直接抑制 CYPl家族各種亞型酶的活力又可以逆轉在Hep-G2細胞中B[a]p (benzo[a]pyrene)誘導的CYPl功能的上調。具有開發成癌癥治療輔助藥物(多藥耐藥逆轉劑)和保健產品(防癌)的前途。試驗表明，該四種丹參酮均可在重組酶各亞型中有效地直接抑制EROD (7-ethoxyresorufin'O-deethylation)反應的進行，對各個亞型的代謝功能都有較強的抑制效果，其IC50均為nM級。其中在各亞型中，丹參酮各單體對CYP1B1和1A1的抑制效果最強，對CYP1B1和1A1有選擇特異性。且其抑制能力高于大部分文獻己見報道的抑制劑。另外在對于各個單體來說，丹參酮I對于各個亞型的抑制效果明顯強于別的單體。在Hep-G2細胞試驗中，丹參酮各組分均可以逆轉B[a]p誘導的CYPl功能的上調，而且在有效濃度內，丹參酮對細胞無明顯毒性。由此可見丹參酮中這四個單體可以作為CYP1家族酶的特異性抑制劑，具有防癌和抗腫瘤藥增敏的使用開發前途。
圖1丹參酮各組分對CYP1A1介導的EROD反應能力的影響
圖2丹參酮各組分對CYP1A2介導的EROD反應能力的影響
圖3丹參酮各組分對CYP1A1介導的EROD反應能力的影響
圖4四種丹參酮成分對CYP1A1抑制的酶動力學(Dixon圖)
圖5四種丹參酮成分對CYP1A2抑制的酶動力學(Dixon圖)
圖6四種丹參酮成分對CYP1B1抑制的酶動力學(Dixon圖)
圖7四種丹參酮成分在Hep-G2細胞中對B[a]p誘導的CYP1表達的逆轉作用
表1四種丹參酮成分在重組酶中對CYP1家族蛋白催化活力的影響。
具體實施例方式
實施例1
重組酶實驗考察丹參酮各組分對CYP1A1代謝能力的影響(IC50值的求算)。實驗材料和儀器
cDNA表達的人重組酶CYPlAl購自gentest公司，ETRF (7-ethoxyresorufin ) 、 NADP、6-磷酸葡萄糖、6-磷酸葡萄糖脫氫酶均購自Sigma公司，丹參酮I (tanshinone I)，丹參酮IIA(tanshinonellA)，隱丹參酮(cryptotanshinone) ， 二氫丹參酮I (dihydrotanshinone I )標準品均購自中國藥品生物制品檢定所，儀器采用Tecan SafireZ高通量測讀儀。
實驗方法實驗方法
1. 在0.2ml溫孵體系中，含有0.25 pmol CYP1A1， 1.3mMNADP、 3.3 mM 6-磷酸葡萄糖、
0. 4./ml 6-磷酸葡萄糖脫氫酶、3.3 mM氯化鎂和0.05|aM ETRF。反應體系混勻于100 mM PBS 中。
2. 反應體系中加入不同濃度的丹參酮(0 10000 nM),反應通過加入還原體系(1.3 mM NADP、 3.3mM6-磷酸葡萄糖、0.4 U/ml 6-磷酸葡萄糖脫氫酶、3.3mM氯化鎂)來啟動反應， 反應在37 。C恒溫中進行，采用Tecan Safire2高通量測讀儀測量代謝物的熒光強度，激發波長 530nm，發射波長590nm。每1分鐘測讀一次，測讀10分鐘。
實驗結果見圖l。結果顯示，四種丹參酮單體可以有效地抑制CYP1A1酶的活力。
實施例2
重組酶實驗考察丹參酮各組分對CYP1A2代謝能力的影響(IC50值的求算)。 實驗材料和儀器
cDNA表達的人重組酶CYPlA2購自gentest公司，ETRF (7-ethoxyresorufin ) 、 NADP、 6-磷酸葡萄糖、6-磷酸葡萄糖脫氫酶均購自Sigma公司，丹參酮I (tanshinone I),丹參酮II A(tanshinonellA)，隱丹參酮(cryptotanshinone) ， 二氫丹參酮I (dihydrotanshinone I )標準 品均購自中國藥品生物制品檢定所，儀器采用TeeanSafn^高通量測讀儀。
實驗方法
1. 在0.2ml溫孵體系中，含有2pmolCYPlA2， 1.3mMNADP、 3.3mM6-磷酸葡萄糖、0.4U/ml 6-磷酸葡萄糖脫氫酶、3.3mM氯化鎂和0.2nMETRF。反應體系混勻于100mM PBS中。
2. 反應體系中加入不同濃度的丹參酮(0 10000 nM)，反應通過加入還原體系(1.3 mM NADP、 3.3mM6-磷酸葡萄糖、0.4 U/ml 6-磷酸葡萄糖脫氫酶、3.3mM氯化鎂)來啟動反應， 反應在37 。C恒溫中進行，采用Tecan Safire2高通量測讀儀測量代謝物的熒光強度，激發波長 530 nm，發射波長590nm。每1分鐘測讀一次，測讀10分鐘。
實驗結果見圖2。結果顯示，四種丹參酮單體可以有效地抑制CYP1A2酶的活力。
實施例3
重組酶實驗考察丹參酮各組分對CYP1B1代謝能力的影響(IC50值的求算)。 實驗材料和儀器
cDNA表達的人重組酶CYPlBl購自gentest公司，ETRF (7-ethoxyresorufm )、 NADP、 6隱磷
6A(tanshinonellA)'隱月-參酮(cryptotanshinone) ， 二氫月.參酮I (dihydrotanshinone I )豐示準品均購自中國藥品生物制品檢定所，儀器采用Tecan Safir^高通量測讀儀。
實驗方法
1. 在0.2ml溫孵體系中，含有1 pmolCYPlBl， 1.3mMNADP、 3.3mM 6-磷酸葡萄糖、0.4U/ml6-磷酸葡萄糖脫氫酶、3.3mM氯化鎂和0.05nMETRF。反應體系混勻于lOOmM PBS中。
2. 反應體系中加入不同濃度的丹參酮(0 10000 nM)，反應通過加入NADPH生成體系(1.3mMNADP、 3.3 mM 6-磷酸葡萄糖、0.4U/ml 6-磷酸葡萄糖脫氫酶、3.3mM氯化鎂)來啟動反應，反應在37 。C恒溫中進行，采用Tecan Safire2高通量測讀儀測量代謝物的熒光強度，激發波長530 nm，發射波長590 nm。每1分鐘測讀-次，測讀10分鐘。
實驗結果見圖3。結果顯示，四種丹參酮單體可以有效地抑制CYP1B1酶的活力。
實施例4
考察四種丹參酮成分對CYP1A1抑制的酶動力學(求算Ki值)實驗材料和儀器
cDNA表達的人重組酶CYPlAl購自gentest公司，ETRF (7-ethoxyresorufin )、 NADP、 6-磷酸葡萄糖、6-磷酸葡萄糖脫氫酶均購自Sigma公司，丹參酮I (tanshinonel)，丹參酮IIA(tanshinoneII A),隱月-參酮(cryptotanshinone) ， 二氫月-參酮1 (dihydrotanshinone I )標準品均購自中國藥品生物制品檢定所，儀器采用Tecan Safi？高通量測讀儀。
實驗方法
1. 在0.2ml溫孵體系中，含有0.25pmolCYPlAl，1.3mMNADP、3.3mM6-磷酸葡萄糖、0.4U/ml6-磷酸葡萄糖脫氫酶、3.3mM氯化鎂和ETRF。反應體系混勻于100mM PBS中。
2. 反應體系中加在固定不同濃度的丹參酮(隱丹參酮0、 10、 20、 50、 100 nM ;丹參酮IIA:0、 5、 10、 20、 50nM;丹參酮I :0、 2、 5、 10、 20 nM; 二氫丹參酮I :0、 1、 2、 5、 10nM)的同時加入不同濃度的ETRF (0.01、 0.025、 0.05、 O.lpM)，反應通過加入NADPH生成體系
(1.3mMNADP、 3.3mM 6-磷酸葡萄糖、0.4U/ml 6-磷酸葡萄糖脫氫酶、3.3mM氯化鎂)來啟動反應，反應在37 。C恒溫中進行，采用Tecan Saf畔2高通量測讀儀測量代謝物的熒光強度，激發波長530 nm，發射波長590 nm。每1分鐘測讀一次，測讀10分鐘。測定在不同底物濃度和不同丹參酮濃度下的代謝速率
實驗結果見圖4。結果顯示，各丹參酮單體均有很強的對CYP1A1酶活力的抑制效果。
實施例5考察四種丹參酮成分對CYP1A2抑制的酶動力學(求算Ki值)實驗材料和儀器-
cDNA表達的人重組酶CYPlA2購自gentest公司，ETRF (7-ethoxyresomfin )、 NADP、 6墨磷酸葡萄糖、6-磷酸葡萄糖脫氫酶均購自Sigma公司，丹參酮I (tanshinone I )，丹參酮IIA(tanshinoneII A)，隱月'參酉間(cryptotanshinone) , 二氫丹參酮I (dihydrotanshinone I )標7隹品均購自中國藥品生物制品檢定所，儀器采用Tecan SafireS高通量測讀儀。
實驗方法
1. 在0.2ml溫孵體系中，含有2pmolCYPlA2， 1.3mM NADP、 3.3 mM 6-磷酸葡萄糖、0.4U/ml6-磷酸葡萄糖脫氫酶、3.3mM氯化鎂和ETRF。反應體系混勻于100mMPBS中。
2. 反應體系中加在固定不同濃度的丹參酮(隱丹參酮0、 100、 200、 500 nM ;丹參酮IIA:0、100、 200、 400 nM;丹參酮I :0、 20、 50、 100、 200 nM; 二氫丹參酮I :0、 50、 100、 200、500 nM)的同時加入不同濃度的ETRF (0.、0.25、 0.5、 lfiM)，反應通過加入NADPH生成體系(1.3mMNADP、 3.3mM 6-磷酸葡萄糖、0.4U/ml 6-磷酸葡萄糖脫氫酶、3.3mM氯化鎂)來啟動反應，反應在37 。C恒溫中進行，采用Tecan Safire2高通量測讀儀測量代謝物的熒光強度，激發波長530 mn，發射波長590 nm。每1分鐘測讀一次，測讀10分鐘。測定在不同底物濃度和不同丹參酮濃度下的代謝速率。
實驗結果見圖5。結果顯示，各丹參酮單體均有很強的對CYP1A2酶活力的抑制效果。
實施例6
考察四種丹參酮成分對CYP1B1抑制的酶動力學(求算Ki值)實驗材料和儀器
cDNA表達的人重組酶CYPlBl購自gentest公司，ETRF (7-ethoxyresorufm )、 NADP、 6-磷酸葡萄糖、6-磷酸葡萄糖脫氫酶均購自Sigma公司，丹參酮T (tansh inone I)，丹參酮llA( tanshinone IIA)，隱丹參酮(cryptotanshinone) ， 二氫丹參酮I (dihydrotanshinone I )標準品均購自中國藥品生物制品檢定所，儀器采用Tecan Safu^高通量測讀儀。
實驗方法
1. 在0.2ml溫孵體系中，含有1 pmolCYPlBl， 1.3 mMNADP、3.3mM6-磷酸葡萄糖、0.4U/ml6-磷酸葡萄糖脫氫酶、3.3 mM氯化鎂和ETRF。反應體系混勻于100 mM PBS中。
2. 反應體系中加在固定不同濃度的丹參酮(隱丹參酮0、 10、 20、 50 nM;丹參酮IIA:O、 2、2.反應體系中加在固定不同濃度的丹參酮(隱丹參酮0、 10、 20、 50nM;丹參酮IIA:0、 2、5、 10、 20nM;丹參酮I:0、 0.5、 1、 2、 5 nM; 二氫丹參酮I :0、 2、 5、 lOnM)的同時加入不同濃度的ETRF (0.01、 0.025、 0.05、 O.lpM)，反應通過加入還原體系(1.3 mM NADP、3.3mM6-磷酸葡萄糖、0.4U/ml6-磷酸葡萄糖脫氫酶、3.3mM氯化鎂)來啟動反應，反應在37 。C恒溫中進行，采用Tecan SafireZ高通量測讀儀測量代謝物的熒光強度,激發波長:530 nm，發射波長590nm。每1鐘測讀一次，測讀10分鐘。測定在不同底物濃度和不同丹參酮濃度下的代謝速率。
實驗結果見圖6。結果顯示，各丹參酮單體均有很強的對CYP1B1酶活力的抑制效果。
實施例7
考察四種丹參酮成分對在Hep-G2細胞上B[a]p誘導的CYP1表達的逆轉作用。實驗材料和儀器
Hep-G2細胞購自中國科學院上海生命科學研究院生物化學與細胞生物學研究所，培養于37。C， 5。/。C02的培養箱，培養基為含10%胎牛血清(Gibco)的DMEM (Gibco)。 ETRF(7-ethoxyresorufin )、水楊酰胺、benzo[a]pyrene (B[a]p)均購自Sigma公司，丹參酮I (tanshinonel)，丹參酮IlA(tanshinonellA)，隱丹參酮(cryptotanshinone) , 二氫丹參酮I(dihydrotanshinone I )標準品均購自中國藥品生物制品檢定所，儀器采用Tecan Safn^高通量測讀儀。實驗方法
1. 分化良好的Caco-2細胞經胰酶消化，懸浮于常規培養基中，孔接種于costar 96孔透明底黑色細胞培養板中，于培養箱中培養，隔天換液，至第8天細胞融合達80%左右時進行實驗。
2. 進行實驗時，去掉培養基，在細胞上加入200^1含2%血清的含藥培養基，其中B[a]p組含有lnMB[a]p， B[a]p+丹參酮組含有lpM B[a]p和不同濃度的丹參酮單體(0.1、 0.25、 0.5、 1、2.5、 5pM)，空白組含有與給藥組等量的DMSO。
3. 給藥12h后，去掉培養基，將細胞用PBS洗三次，然后加入200^1含ETRF(2mM)和水楊酰胺(1.5 mM)的培養基啟動反應，反應在37 。C恒溫中進行，采用Tecan Safire2高通量測讀儀測量生成的代謝物的熒光強度，激發波長530nm，發射波長590nm。每10分鐘測讀一次，測讀40分鐘。
實驗結果見圖7。結果顯示，四種丹參酮單體均可以有效地逆轉B[a]p誘導的CYP1家族的酶活力。
9表1四種丹參酮成分在重組酶中對CYP1家族酶催化活力的影響。
IC50(nM)Ki (nM)
隱丹參酮1A1204
1A2l卯200
1B12017
丹參酮2A1A1103
1A210070
1B13.58.5
丹參酮I1A12.52.9
1A25040
1B10.50.7
二氫丹參酮I1A163.4
1A25045
1B132.權利要求
1. 丹參酮系列化合物用于制備癌癥化學保護藥物，包括預防、抑制和逆轉由于CYP1家族激活前致癌物導致的癌癥。
2. 根據權利要求1所述方法，其特征是丹參酮系列化合物用于制備逆轉由于CYP1高表達導致的抗癌藥物多藥耐藥的抗癌增敏劑。
全文摘要
本發明涉及天然藥物領域，具體涉及丹參提取物中二帖類化合物，主要是丹參酮系列化合物在逆轉benzo[a]pyrene誘導的CYP1酶的表達，以及直接抑制CYP1酶的活力的應用。本發明公開四種丹參酮丹參酮I，tanshinone I；丹參酮II A，tanshinone II A；隱丹參酮，cryptotanshinone；二氫丹參酮I，dihydrotanshinone I新的藥理用途，即其既可直接抑制CYP1家族各種亞型酶的活力又可以逆轉在Hep-G2細胞中benzo[a]pyrene誘導的CYP1功能的上調。具有開發成癌癥治療輔助藥物作為多藥耐藥逆轉劑和防癌保健產品的開發使用前途。
文檔編號A61P35/00GK101518538SQ20091002806
公開日2009年9月2日 申請日期2009年1月14日 優先權日2009年1月14日
發明者吳曉蘭, 芳 周, 孫建國, 尚麗麗, 榮 張, 英 彭, 王廣基, 華 艾 申請人:中國藥科大學