專利名稱：：阿昔洛韋-殼聚糖-硬脂酸嫁接物及合成方法與應用的制作方法
技術領域：
：本發明涉及一種抗病毒阿昔洛韋前體藥物及其合成方法與應用，具體為阿昔洛韋-殼聚糖-硬脂酸嫁接物及其合成方法、阿昔洛韋-殼聚糖-硬脂酸嫁接物在制備抗乙肝病毒藥物中的應用。
背景技術：
：病毒性疾病作為傳染性疾病已經成為人類健康的主要威脅之一。慢性乙型肝炎是危害嚴重的病毒性傳染病，是引起肝纖維化、肝硬化和肝癌的最主要原因。全球每年有超過50萬人死于原發性肝癌，而其中多達80%的原發性肝癌是由慢性乙肝引起的。由于現有的抗病毒藥物不能完全抑制、清除病毒，存在著給藥劑量大、療效低、毒副作用和易產生耐藥的問題，因此，對于病毒性疾病的治療，尤其是病毒慢性感染的治療仍然是醫學上的難題。現有的抗病毒化療藥物，具有一般化療藥物的體內非特異性分布特點，同時受到體內生物膜吸收與轉運屏障，酶代謝的影響，藥物無法大量進入其分子靶標，從而導致療效低、劑量大、毒副作用以及耐藥性的產生。通過靶向制劑技術，改變以藥物自身性質為主導的藥物體內分布模式，將外源性的藥物輸送到藥物作用的分子靶標，可最大限度地提高藥物作用的療效，降低藥物在正常臟器的分布和毒副作用。抗HBV化療藥物的分子作用位點，除HBV吸附抑制劑外，均作用于宿主細胞內的亞細胞器，因此理想的抗HBV靶向制劑應具有高效的肝臟、肝細胞和肝細胞內的亞細胞器靶向功能。國內外的科學家，通過對藥物載體大小、表面理化性質的調控、以及在此基礎上的配體或抗體修飾技術，目前已經實現了藥物向肝臟細胞的靶向輸送，亞細胞器靶向載體技術已成為當前實現藥物分子靶向治療的核心環節。殼聚糖硬脂酸嫁接物膠束是一種新型膠體給藥系統。通過硬脂酸的羧基與殼寡糖(低分子量殼聚糖)上活性氨基的化學嫁接，所合成的"糖脂結構"兩親性陽離子嫁接物，能夠在水性介質中自聚集形成膠束，并具有負載親、疏水性化療藥物和生物大分子藥物的能力。該嫁接物膠束能快速被細胞快速攝取，同時具有泰性低、生物相容性好的優點。采用嫁接物載體材料，已經分別實現了高效的抗腫瘤治療與基因轉染。但是，嫁接物膠束也存在一些潛在的局限性，如有限的載藥能力、難于包載親水性藥物等問題。本發明通過將阿昔洛韋與丁二酸酐反應生成阿昔洛韋-丁二酸中間體，利用中間體的羧基與殼聚糖硬脂酸嫁接物的活性氨基化學嫁接，合成阿昔洛韋_殼聚糖_硬脂酸嫁接物。利用殼聚糖硬脂酸嫁接物膠束具有快速的細胞攝取功能，化學嫁接阿昔洛韋等抗病毒藥物，以提高藥物分子靶標部位的藥物濃度，從而達到提高該類藥物的抗乙肝病毒療效的目的。
發明內容本發明的一個目的是提供親水性抗病毒藥物阿昔洛韋_殼聚糖_硬脂酸嫁接物，其具有代表性的化學結構通式為式中R為脂肪酸；x表示殼寡糖中未被硬脂酸和阿昔洛韋化學實施的氨基葡萄糖單元和乙酰化氨基葡萄糖單元數；y表示殼寡糖中被阿昔洛韋_丁二酸中間體化學實施的酰化葡萄糖單元數；n表示硬脂酸的化學修飾比例；y與n的積表示阿昔洛韋的化學修飾比例。本發明的另一個目的是提供阿昔洛韋_殼聚糖_硬脂酸嫁接物的合成方法，具體通過以下途徑實現(1)阿昔洛韋-丁二酸中間體的合成將562.5mg(2.5mmo1)阿昔洛韋、500.0mg(5.Ommol)丁二酸酐和0.355mL三乙胺溶于37.5mL干燥的N，N-二甲基甲酰胺中，6(TC水浴反應21h。待反應液冷卻后，減壓蒸去大部分揮發性組分，加入25mL冰水，2N鹽酸調至pH2。過濾收集白色沉淀，用冰水充分洗滌，4(TC下烘干。將白色沉淀放入圓底燒瓶中，加入少量甲醇，7(TC水浴攪拌，用冷凝管回流，緩慢滴加甲醇至固體全部溶解，室溫靜置過夜，抽濾得白色晶體，4(TC下烘干得阿昔洛韋-丁二酸中間體。(2)制備殼聚糖硬脂酸嫁接物(該嫁接物已為國家發明專利ZL200610051601.0所保護)稱取2.0g分子量為5kDa的殼聚糖，加入50mL去離子水攪拌溶解；另稱取硬脂酸1.6g和碳二亞胺11.0g溶解在40mL乙醇中。殼聚糖溶液加熱至8(TC，在攪拌條件下逐滴加入硬脂酸溶液。維持反應溫度為80°C，在400rpm磁力攪拌條件下反應5h。將終反應液置于透析袋(3.5kDa)，去離子水透析24h，除去殘留的碳二亞胺及反應副產物異脲。透析液冷凍干燥，得殼聚糖硬脂酸嫁接物。(3)l-50mg阿昔洛韋-丁二酸中間體、6-300mg碳二亞胺和3.5-175mgN-羥基琥珀酰亞胺溶于l-10mL無水N，N-二甲基甲酰胺，6(TC攪拌lh;20mg殼聚糖硬脂酸嫁接物溶于40mL水，用0.2M氫氧化鈉溶液調節至p朋.5，將中間體溶液緩慢滴入嫁接物溶液水中，室溫攪拌24h，將反應液置分子量3.5kDa的透析袋中，蒸餾水透析24h，冷凍干燥，得到阿昔洛韋-殼聚糖-硬脂酸嫁接物。合成路線<formula>formulaseeoriginaldocumentpage6</formula>式中R、x、y、n的定義同通式，y與n的積同通式。本發明的有益之處是通過阿昔洛韋-丁二酸中間體的合成，有利于靶向載體材料通過化學嫁接對藥物的負載，在此基礎上采用具有高效細胞攝取和低毒性的殼聚糖硬脂酸嫁接物膠束對分子靶標位于細胞內的抗病毒藥物的負載，可大大增加病毒細胞對藥物的攝取，以及藥物分子靶標部位的藥物濃度。增加病毒細胞對藥物的攝取，有利于減小藥物在正常組織或細胞的分布，降低藥物的毒副作用；而藥物分子靶標部位的藥物濃度的增加，有利于提高抗病毒藥物的療效。圖1為阿昔洛韋(A)、阿昔洛韋_丁二酸中間體(B)、殼聚糖硬脂酸嫁接物(C)和阿昔洛韋_殼聚糖_硬脂酸嫁接物(D)的核磁共振氫譜。圖2為相同藥物濃度(0.044MmL—0的阿昔洛韋_殼聚糖_硬脂酸嫁接物膠束及阿昔洛韋溶液與H印G2.2.15細胞共孵育后，對HBsAg、HBsAg及HBVDNA的抑制率變化。具體實施例方式本發明結合附圖和實施例作進一步的說明。實施例1:阿昔洛韋_殼聚糖_硬脂酸嫁接物的合成(1)阿昔洛韋-丁二酸中間體的合成將562.5mg(2.5mmo1)阿昔洛韋、500.0mg(5.Ommol)丁二酸酐和0.355mL三乙胺溶于37.5mL干燥的N，N-二甲基甲酰胺中，6(TC水浴反應21h。待反應液冷卻后，減壓蒸去大部分揮發性組分，加入25mL冰水，2N鹽酸調至pH2。過濾收集白色沉淀，用冰水充分洗滌，4(TC下烘干。將白色沉淀放入圓底燒瓶中，加入少量甲醇，7(TC水浴攪拌，用冷凝管回流，緩慢滴加甲醇至固體全部溶解，室溫靜置過夜，抽濾得白色晶體，4(TC下烘干得阿昔洛韋-丁二酸中間體。(2)殼聚糖_硬脂酸嫁接物的合成(該嫁接物已為國家發明專利ZL200610051601.0所保護)稱取2.0g分子量為5kDa的殼聚糖，加入50mL去離子水攪拌溶解；另稱取硬脂酸1.6g和碳二亞胺11.0g溶解在40mL乙醇中。殼聚糖溶液加熱至80°C，在攪拌條件下逐滴加入硬脂酸溶液。維持反應溫度為80°C，在400rpm磁力攪拌條件下反應5h。將終反應液置于透析袋(3.5kDa)，去離子水透析24h，除去殘留的碳二亞胺及反應副產物異脲。透析液冷凍干燥，得殼聚糖硬脂酸嫁接物。(3)阿昔洛韋_殼聚糖_硬脂酸嫁接物的合成1.Omg阿昔洛韋_丁二酸中間體、6.Omg碳二亞胺和3.5mgN-羥基琥珀酰亞胺溶于lmL無水N，N-二甲基甲酰胺，6(TC攪拌lh;20mg殼聚糖硬脂酸嫁接物溶于40mL水，用0.2M氫氧化鈉溶液調節至p朋.5，將中間體溶液緩慢滴入嫁接物溶液水中，室溫攪拌24h，將反應液置分子量3500的透析袋中，蒸餾水透析24h，冷凍干燥，得到阿昔洛韋-殼聚糖-硬脂酸嫁接物。圖l為阿昔洛韋(A)、阿昔洛韋_丁二酸中間體(B)、殼聚糖硬脂酸嫁接物(C)和阿昔洛韋-殼聚糖-硬脂酸嫁接物(D)的核磁氫譜，由圖可確定阿昔洛韋-殼聚糖-硬脂酸嫁接物的合成。制備得到的阿昔洛韋_殼聚糖_硬脂酸嫁接物，載藥量為0.5%。阿昔洛韋-殼聚糖-硬脂酸嫁接物的合成路線實施例2:阿昔洛韋_殼聚糖_硬脂酸嫁接物的合成(1)阿昔洛韋-丁二酸中間體的合成將562.5mg(2.5mmo1)阿昔洛韋、500.0mg(5.Ommol)丁二酸酐和0.355mL三乙胺溶于37.5mL干燥的N，N-二甲基甲酰胺中，6(TC水浴反應21h。待反應液冷卻后，減壓蒸去大部分揮發性組分，加入25mL冰水，2N鹽酸調至pH2。過濾收集白色沉淀，用冰水充分洗滌，4(TC下烘干。將白色沉淀放入圓底燒瓶CH20H中，加入少量甲醇，7(TC水浴攪拌，用冷凝管回流，緩慢滴加甲醇至固體全部溶解，室溫靜置過夜，抽濾得白色晶體，4(TC下烘干得阿昔洛韋-丁二酸中間體。(2)殼聚糖_硬脂酸嫁接物的合成(該嫁接物已為國家發明專利ZL200610051601.0所保護)稱取2.0g分子量為5kDa的殼聚糖，加入50mL去離子水攪拌溶解；另稱取硬脂酸1.6g和碳二亞胺11.0g溶解在40mL乙醇中。殼聚糖溶液加熱至80°C，在攪拌條件下逐滴加入硬脂酸溶液。維持反應溫度為80°C，在400rpm磁力攪拌條件下反應5h。將終反應液置于透析袋(3.5kDa)，去離子水透析24h，除去殘留的碳二亞胺及反應副產物異脲。透析液冷凍干燥，得殼聚糖硬脂酸嫁接物。(3)阿昔洛韋_殼聚糖_硬脂酸嫁接物的合成10mg阿昔洛韋_丁二酸中間體、60mg碳二亞胺和35mgN-羥基琥珀酰亞胺溶于5mL無水N，N-二甲基甲酰胺，6(TC攪拌lh;20mg殼聚糖硬脂酸嫁接物溶于40mL水，用0.2M氫氧化鈉溶液調節至p朋.5，將中間體溶液緩慢滴入嫁接物溶液水中，室溫攪拌24h，將反應液置分子量3500的透析袋中，蒸餾水透析24h，冷凍干燥，得到阿昔洛韋_殼聚糖_硬脂酸嫁接物。表1為所制備得到的阿昔洛韋_殼聚糖_硬脂酸嫁接物膠束的粒徑、表面電位和藥物載藥量等理化性質。表1:阿昔洛韋-殼聚糖-硬脂酸嫁接物膠束的粒徑、表面電位和藥物載藥量<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>(4)阿昔洛韋-殼聚糖-硬脂酸嫁接物膠束的體外抗乙肝病毒療效取IfepG22.2.15細胞，在含有約10X胎牛血清的DMEM培養液中培養(5%0)2，37°〇孵箱)。當細胞達對數生長期時，即可進行接種。取對數生長期細胞，PBS潤洗后，加入胰酶消化并用培養液稀釋，按每孔1X105個細胞的密度接種于24孔培養板內，孵箱內培養24小時。24孔培養板內細胞貼壁生長后，棄去舊培養液，使用PH7.4的磷酸鹽緩沖溶液潤洗2遍后分別加入含相同藥物濃度(0.044MmL—0的阿昔洛韋_殼聚糖_硬脂酸嫁接物膠束和阿昔洛韋溶液，繼續培養5-9天后，收集培養液，酶免疫測定試劑盒測定細胞培養液中的表面抗原(HBsAg)和e抗原(HBeAg)含量，即時PCR定量法測定乙肝病毒DNA(HBVDNA)含量。相同藥物濃度的阿昔洛韋-殼聚糖-硬脂酸嫁接物膠束和阿昔洛韋溶液與IfepG22.2.15細胞共孵育后，對HBsAg，HBeAg和HBV-DNA表達的抑制率變化結果見圖3。結果顯示阿昔洛韋經丁二酸酐化學嫁接至殼聚糖硬脂酸形成阿昔洛韋_殼聚糖_硬脂酸嫁接物膠束后，與阿昔洛韋溶液相比，對HBsAg，HBeAg和HBV-DNA表達的抑制率顯著增加，揭示阿昔洛韋_殼聚糖_硬脂酸嫁接物膠束的顯著抗病毒效果。實施例3:阿昔洛韋_殼聚糖_硬脂酸嫁接物的合成(1)阿昔洛韋-丁二酸中間體的合成將562.5mg(2.5mmo1)阿昔洛韋、500.0mg(5.Ommol)丁二酸酐和0.355mL三乙胺溶于37.5mL干燥的N，N-二甲基甲酰胺中，6(TC水浴反應21h。待反應液冷卻后，減壓蒸去大部分揮發性組分，加入25mL冰水，2N鹽酸調至pH2。過濾收集白色沉淀，用冰水充分洗滌，4(TC下烘干。將白色沉淀放入圓底燒瓶中，加入少量甲醇，7(TC水浴攪拌，用冷凝管回流，緩慢滴加甲醇至固體全部溶解，室溫靜置過夜，抽濾得白色晶體，4(TC下烘干得阿昔洛韋_丁二酸中間體。(2)殼聚糖_硬脂酸嫁接物的合成(該嫁接物已為國家發明專利ZL200610051601.0所保護)稱取2.0g分子量為5kDa的殼聚糖，加入50mL去離子水攪拌溶解；另稱取硬脂酸1.6g和碳二亞胺11.0g溶解在40mL乙醇中。殼聚糖溶液加熱至80°C，在攪拌條件下逐滴加入硬脂酸溶液。維持反應溫度為80°C，在400rpm磁力攪拌條件下反應5h。將終反應液置于透析袋(3.5kDa)，去離子水透析24h，除去殘留的碳二亞胺及反應副產物異脲。透析液冷凍干燥，得殼聚糖硬脂酸嫁接物。(3)阿昔洛韋_殼聚糖_硬脂酸嫁接物的合成50mg阿昔洛韋_丁二酸中間體、300mg碳二亞胺和175mgN-羥基琥珀酰亞胺溶于10mL無水N，N-二甲基甲酰胺，6(TC攪拌lh;20mg殼聚糖硬脂酸嫁接物溶于40mL水，用0.2M氫氧化鈉溶液調節至p朋.5，將中間體溶液緩慢滴入嫁接物溶液水中，室溫攪拌24h，將反應液置分子量3500的透析袋中，蒸餾水透析24h，冷凍干燥，得到阿昔洛韋-殼聚糖-硬脂酸嫁接物。合成路線同實施例l。圖l為阿昔洛韋(A)、阿昔洛韋-丁二酸中間體(B)、殼聚糖硬脂酸嫁接物(C)和阿昔洛韋-殼聚糖_硬脂酸嫁接物(D)的核磁氫譜，由圖可確定阿昔洛韋_殼聚糖_硬脂酸嫁接物的合成。制備得到的阿昔洛韋_殼聚糖_硬脂酸嫁接物，載藥量為50.0%。權利要求阿昔洛韋-殼聚糖-硬脂酸嫁接物，其具有代表性的結構通式為式中R為脂肪酸；x表示殼寡糖中未被硬脂酸和阿昔洛韋化學實施的氨基葡萄糖單元和乙酰化氨基葡萄糖單元數；y表示殼寡糖中被阿昔洛韋-丁二酸中間體化學實施的酰化葡萄糖單元數；n表示硬脂酸的化學修飾比例；y與n的積表示阿昔洛韋的化學修飾比例。FSA00000081983300011.tif2.根據權利要求1所述的阿昔洛韋-殼聚糖-硬脂酸嫁接物的合成方法，其特征在于通過以下步驟實現(1)阿昔洛韋-丁二酸中間體的合成將562.5mg阿昔洛韋、500.0mg丁二酸酐和0.355mL三乙胺溶于37.5mL干燥的N，N_二甲基甲酰胺中，6(TC水浴反應21h，待反應液冷卻后，減壓蒸去大部分揮發性組分，加入25mL冰水，2N鹽酸調至pH2，過濾收集白色沉淀，用冰水充分洗滌，4(TC下烘干，將白色沉淀放入圓底燒瓶中，加入少量甲醇，7(TC水浴攪拌，用冷凝管回流，緩慢滴加甲醇至固體全部溶解，室溫靜置過夜，抽濾得白色晶體，4(TC下烘干得阿昔洛韋_丁二酸中間體；(2)殼聚糖-硬脂酸嫁接物的合成稱取2.Og分子量為5kDa的殼聚糖，加入50mL去離子水攪拌溶解；另稱取硬脂酸1.6g和碳二亞胺11.Og溶解在40mL乙醇中，殼聚糖溶液加熱至80°C，在攪拌條件下逐滴加入硬脂酸溶液，維持反應溫度為80°C，在400rpm磁力攪拌條件下反應5小時，將終反應液置于透析袋，去離子水透析24小時，除去殘留的碳二亞胺及反應副產物異脲，透析液冷凍干燥，得殼聚糖硬脂酸嫁接物；(3)阿昔洛韋_殼聚糖_硬脂酸嫁接物的合成10mg阿昔洛韋-丁二酸中間體、60mg碳二亞胺和35mgN-羥基琥珀酰亞胺溶于5mL無水N，N-二甲基甲酰胺，6(TC攪拌1小時，20mg殼聚糖硬脂酸嫁接物溶于40mL水，用0.2M氫氧化鈉溶液調節至p朋.5，將中間體溶液緩慢滴入嫁接物溶液水中，室溫攪拌24小時，將反應液置分子量3500的透析袋中，蒸餾水透析24小時，冷凍干燥，得到阿昔洛韋_殼聚糖_硬脂酸嫁接物；合成路線<formula>formulaseeoriginaldocumentpage3</formula>式中R、X、Y、N的定義痛權利要求1，Y與N的積同權利要求1。全文摘要本發明提供親水性抗病毒藥物阿昔洛韋-殼聚糖-硬脂酸嫁接物，通過阿昔洛韋-丁二酸中間體的合成，有利于靶向載體材料通過化學嫁接對藥物的負載，在此基礎上采用具有高效細胞攝取和低毒性的殼聚糖硬脂酸嫁接物膠束對分子靶標位于細胞內的抗病毒藥物的負載，可大大增加病毒細胞對藥物的攝取，以及藥物分子靶標部位的藥物濃度。增加病毒細胞對藥物的攝取，有利于減小藥物在正常組織或細胞的分布，降低藥物的毒副作用；而藥物分子靶標部位的藥物濃度的增加，有利于提高抗病毒藥物的療效。本發明的化學結構通式為。文檔編號A61P1/16GK101791412SQ20101014372公開日2010年8月4日申請日期2010年4月9日優先權日2010年4月9日發明者杜永忠,胡富強,袁弘申請人:浙江大學