含有環烯醚萜類化合物的組合物及其用途的制作方法

專利名稱：含有環烯醚萜類化合物的組合物及其用途的制作方法
技術領域：
本發明涉及含有環烯醚萜類化合物的組合物用于預防或治療神經系統疾病的新用途、含有所述組合物的藥物組合物，和用所述化合物或藥物組合物治療或預防神經系統疾病的方法。
背景技術：
髓鞘是包裹于有鞘神經纖維軸索外面由髓鞘細胞所構成的一層脂質細胞膜，其主要生理功能是對神經軸索起“絕緣”、保護作用，并有利于神經沖動的快速傳導。脫髓鞘病是一組以神經纖維的髓鞘脫失為主要病理改變的疾病，既可累及中樞神經系統，也可累及周圍神經系統。這類疾病的主要病理特點為(1)神經纖維髓鞘破壞，呈多發性小的播散性病灶，或由一個或多個病灶融合而成較大病灶；(2)脫髓鞘病損分布于腦白質、脊髓或周圍神經，沿小靜脈周圍炎性細胞的袖套狀浸潤。這類疾病包括多發性硬化、視神經脊髓炎、急性播散性腦脊髓炎、彌漫性硬化、同心圓硬化、腦白質營養不良、腦橋中央髓鞘溶解癥、急性炎癥性脫髓鞘性多發性神經病、慢性炎癥性脫髓鞘性多發性神經病等；以及由其他原因所引起的脫髓鞘病變，包括但不僅于缺血-缺氧性病引起的白質腦病、營養缺乏性疾病引起的亞急性聯合變性、病毒感染引起的亞急性硬化性全腦炎或進行性多灶性白質腦病、糖尿病性神經病(該病多以脫髓鞘改變為主)、系統性紅斑狼瘡的神經病變(該病變以脫髓鞘改變為主)等。研究有效的減輕髓鞘脫失和促進髓鞘修復的藥物，可以為防治各種原因導致的中樞和周圍神經系統脫髓鞘疾病提供重要的手段。
環烯醚萜類化合物(Iridoids)是一類特殊的單萜化合物，其母核都為環狀，具有烯鍵和醚鍵。其基本骨架如下面結構式。
1.環烯醚萜的基本骨架 環烯醚萜分子中，q-OH很活潑，易與糖結合，天然存在的環烯醚萜多為苷，且多為D_葡萄糖苷。包含但不僅有 (1)普通環烯醚萜苷①C-8環烯醚萜苷。②C-9環烯醚萜苷(第9個C接在C-4 上)。③C-9環烯醚萜苷(第9個C接在C-8上)。④C-10環烯醚萜苷。如莫諾苷、馬錢素、6’ -乙酰車葉草苷、桅子苷、梓醇、黃蟬花素、黃蟬花定、車葉草苷、桃葉珊瑚苷、梓苷、去氧番木鱉苷、京尼平、雞蛋花素、馬鞭草苷、金吉苷。
(2)裂環環烯醚萜苷如龍膽苦苷、龍膽苦酯苷，開聯番木鱉苷、獐芽菜苦素等。
(3) Valeriana型環烯醚萜，如7，10，2’ _3乙酰敗醬甙、和10-乙酰敗醬甙。
(4)Plumeria型環烯醚萜如枸桔苷A。
(5) 3，10位間形成氧橋的環烯醚萜，如3，10位間形成氧橋的環烯醚萜苷新月苷B。
(6)荊芥內酯相關類型環烯醚萜，有紫苷。
(7)變形的類環烯醚萜，例如新月苷A，B、8位有三元氧螺環結構的枸桔苷B。
(8)由幾個環烯醚萜直接經酯鍵或由萜類、酚類連接而成。如纈草醚酯、去乙酰車葉草苷酸甲酯等。
本發明的發明人通過對莫諾苷和馬錢素等環烯醚萜類化合物廣泛而深入的研究， 發現環烯醚萜類化合物具有減輕神經系統髓鞘脫失和炎性細胞侵潤、促進髓鞘形成和修復等作用，因而完成了本發明。

發明內容
本發明一方面提供了環烯醚萜類化合物例如莫諾苷和/或馬錢素在制備防治神經系統脫髓鞘疾病的藥物中的用途。本發明另一方面也提供了含有環烯醚萜類化合物的藥物組合物以及用所述化合物或組合物治療神經系統脫髓鞘疾病的方法。
更具體地說，按照本發明的一種實施方式，本發明提供了 1.含有環烯醚萜類化合物的組合物在制備減輕或修復神經系統髓鞘病損相關疾病的藥物中的用途。
2.按照本發明另一種實施方式，其中所述環烯醚萜類化合物為莫諾苷或其同系物或類似物，和/或馬錢素或其同系物或類似物。
3.按照本發明另一種實施方式，其中所述莫諾苷占組合物的25-50% w/w，馬錢素占組合物的25-40% w/w。
4.按照本發明另一種實施方式，其中所述組合物為山茱萸提取物，其中莫諾苷占所述提取物總重量的25-50wt%，馬錢素占所述提取物總重量的25-40wt%。
5.按照本發明另一種實施方式，其中所述減輕神經系統髓鞘病損用于治療各種原因導致的出現髓鞘病損的疾病，或用于治療神經系統脫髓鞘疾病。
6.按照本發明另一種實施方式，其中所述疾病為多發性硬化、視神經脊髓炎、急性播散性腦脊髓炎、彌漫性硬化、同心圓硬化、腦白質營養不良、腦橋中央髓鞘溶解癥、急性炎癥性脫髓鞘性多發性神經病或慢性炎癥性脫髓鞘性多發性神經病，或者所述疾病為缺血-缺氧性病引起的白質腦病、營養缺乏性疾病引起的亞急性聯合變性、病毒感染引起的亞急性硬化性全腦炎或進行性多灶性白質腦病。
7.按照本發明另一種實施方式，其中所述疾病為糖尿病性神經病或系統性紅斑狼瘡。
按照本發明另一種實施方式，本發明也提供了 8. 一種治療或預防神經系統脫髓鞘疾病的藥物組合物，其特征在于其含有實施方式1-4任一項中所述的組合物和任選的可藥用載體。
按照本發明另一種實施方式，本發明還提供了 9. 一種治療或預防神經系統脫髓鞘疾病的方法，包括向需要的患者施用治療有效量的實施方式1-4任一項中所述的組合物，或含有所述組合物的藥物組合物。
10.按照實施方式8所述的藥物組合物或按照實施方式9所述的方法，其中所述疾病為實施方式5-7任一項中所述的任一疾病。
本發明所述莫諾苷、馬錢素，均具有環烯醚萜的基本骨架，可以從山茱萸按照已知方法提取，或從市售中得到。

例如，本發明采用下述的提取方法所得到的山茱萸提取物，經分析，以提取物總重量計，含莫諾苷25-50wt%、馬錢素25-40wt%，二者總含量占總提取物的50_90wt%。
本發明的山茱萸提取物的制備方法包括以下步驟 (A)水提或水提醇沉； (B)大孔吸附樹脂分離；和 (C)精制。
所述水提優選包括山茱萸藥材用水煎煮2-4遍，加水量3-14倍，時間1_4小時，合并煎煮液，過濾后減壓濃縮。
所述水提醇沉優選包括山茱萸藥材用水煎煮2-4遍，加水量3-14倍，時間1_4小時，合并煎煮液，過濾后減壓濃縮，加乙醇調至醇濃度為50 %~90%,冷藏12-48小時，過濾， 濾液減壓回收乙醇。
所述大孔吸附樹脂分離優選包括以下步驟取濃縮的山茱萸水提取或水提醇沉提取液，上大孔吸附樹脂柱，使藥液流過全柱，依次用去離子水、5%-95%乙醇進行梯度洗脫， 減壓濃縮成流浸膏。
所述精制優選包括將大孔吸附樹脂分離的流浸膏上A1203層析柱，用乙醇洗脫，凍干獲得固體產物。
有效成分的測定方法對上述提取物制品應用薄層層析進行定性分析。并且對上述提取物制品應用高效液相色譜儀進行定量分析，色譜條件Lichr0Spher-C18色譜柱，流動相甲醇-水(30 70)，檢測波長240nm，流速1.0ml/分鐘。檢測分析結果莫諾苷含量占25-50%、馬錢素含量占25-40%，二者總含量占50-90 %。
本發明的化合物也可按照本領域技術人員已知的方法加以合成。
本發明除了上列化合物以外，還打算涵蓋這類化合物的同系物和類似物。在這種 馬錢素(loganin)情況下，同系物是具有上述化合物的實質性結構相似性的分子，類似物是具有與結構相似性無關的實質性生物相似性的分子。
本發明還涵蓋藥物組合物，所述組合物包括環烯醚萜類化合物與有機和無機酸的藥學上可接受的鹽。
本發明化合物及其衍生物(氧化和/或脫羧、開環和/或氧化環合)、類似物、同系物、藥學上可接受的鹽或水合物可以與藥學上可接受的載體或賦形劑一起制成適合于口服給藥的藥物組合物。這類組合物通常包含治療有效量的任意上述化合物和藥學上可接受的載體。優選地，有效量是有效地促進神經細胞增殖和/或分化的量并且小于導致患者毒性的量。
在本發明制劑中可以使用任意普遍用作載體或稀釋劑的惰性賦形劑，例如樹膠、 淀粉、糖、纖維素材料、丙烯酸酯或其混合物。優選的稀釋劑是微晶纖維素。組合物可以進一步包含崩解劑(例如交聯羧甲基纖維素鈉)和潤滑劑(例如硬脂酸鎂)，另外可以包含一種或多種添加劑，選自粘合劑、緩沖劑、蛋白酶抑制劑、表面活性劑、增溶劑、增塑劑、乳化劑、穩定劑、粘度增加劑、甜味劑、成膜劑或其任意組合。此外，本發明組合物可以是控釋制劑或即時釋放制劑的形式。
在一種實施方式中，藥物組合物是口服給藥的，因而被配制成適合于口服給藥的形式，也就是固體或液體制劑。適合的固體口服制劑包括片劑、膠囊劑、丸劑、顆粒劑、小丸等。適合的液體口服制劑包括溶液、懸液、分散體、乳劑、油劑等。
本文所用的“藥學上可接受的載體”打算包括任意和所有的溶劑、分散介質、包衣、 等滲劑和吸收延遲劑等，它們與藥學給藥是可相容的，例如無菌無熱原的水。
固體載體/稀釋劑包括但不限于樹膠、淀粉(例如玉米淀粉、預膠凝淀粉)、糖(例如乳糖、甘露糖醇、蔗糖、葡萄糖)、纖維素材料(例如微晶纖維素)、丙烯酸酯(例如聚甲基丙烯酸酯)、碳酸鈣、氧化鎂、滑石或其混合物。
就液體制劑而言，藥學上可接受的載體可以是水性或非水性溶液、懸液、乳劑或油。非水性溶劑的實例有丙二醇、聚乙二醇和可注射的有機酯，例如油酸乙酯。水性載體包括水、醇/水溶液、乳液或懸液，包括鹽水和經過緩沖的介質。油的實例有石油、動物、植物或合成來源的那些，例如花生油、大豆油、礦物油、橄欖油、葵花油和魚肝油。溶液或懸液還可以包括下列組分無菌稀釋劑，例如注射用水、鹽水溶液、固定油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其他合成溶劑；抗菌劑，例如苯甲醇或對羥基苯甲酸甲酯；抗氧化劑，例如抗壞血酸或亞硫酸氫鈉；螯合劑，例如乙二胺四乙酸(EDTA)；緩沖劑，例如乙酸鹽、檸檬酸鹽或磷酸鹽；和調節張性的試劑，例如氯化鈉或葡萄糖。PH可以用酸或堿來調節，例如鹽酸或氫氧化鈉。
另外，組合物可以進一步包含粘合劑(例如阿拉伯膠、玉米淀粉、明膠、卡波姆、乙基纖維素、瓜爾膠、羥丙基纖維素、羥丙基甲基纖維素、聚維酮)、崩解劑(例如玉米淀粉、 馬鈴薯淀粉、藻酸、二氧化硅、交聯羧甲基纖維素鈉、交聯聚維酮、瓜爾膠、淀粉羥乙酸鈉、 Primogel)、不同pH和離子強度的緩沖劑(例如Tris_HCl、乙酸鹽、磷酸鹽)、防止表面吸收的添加劑(例如白蛋白或明膠)、洗滌劑(例如吐溫20、吐溫80、Pluronic F68、膽汁酸鹽)、蛋白酶抑制劑、表面活性劑(例如月桂基硫酸鈉)、滲透增強劑、增溶劑(例如甘油、聚乙烯甘油)、助流劑(例如膠體二氧化硅)、抗氧化劑(例如抗壞血酸、偏亞硫酸氫鈉、丁基化羥基茴香醚)、穩定劑(例如羥丙基纖維素、羥丙基甲基纖維素)、增粘劑(例如卡波姆、膠體二氧化硅、乙基纖維素、瓜爾膠)、甜味劑(例如蔗糖、阿斯巴甜、檸檬酸)、矯味劑(例如薄荷、水楊酸甲酯或橙味調料)、防腐劑(例如硫汞撒、苯甲醇、對羥基苯甲酸酯)、潤滑劑 (例如硬脂酸、硬脂酸鎂、聚乙二醇、月桂基硫酸鈉)、流動助劑(例如膠體二氧化硅)、增塑劑(例如鄰苯二甲酸二乙酯、檸檬酸三乙酯)、乳化劑(例如卡波姆、羥丙基纖維素、月桂基硫酸鈉)、聚合物包衣(例如泊洛沙姆或poloxamine)、包衣與成膜劑(例如乙基纖維素、丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸酯)和/或助劑。
本發明化合物或組合物可以連續地重復每日給藥達數天至數年。口服治療可以持續一周至患者壽命。優選地，給藥達連續五天，然后可以評價患者以確定是否需要進一步的給藥。給藥可以是連續的或間歇的，也就是連續幾天治療繼之以休息期。
含有活性成分的藥物組合物的制備是本領域熟知的，例如混合、造粒或壓片過程。 經常將活性治療成分與藥學上可接受的并且可與活性成分相容的賦形劑混合。就口服給藥而言，將活性試劑與慣用于此目的的添加劑混合，例如載體、穩定劑或惰性稀釋劑，再借助慣用方法轉化為適合于給藥的劑型，例如片劑、包衣片、硬或軟明膠膠囊劑、水、醇或油溶液等，如上所述。
一種實施方式是口服給藥用藥物組合物，包含環烯醚萜類化合物或其藥學上可接受的鹽或水合物、微晶纖維素、交聯羧甲基纖維素鈉和硬脂酸鎂。另一種實施方式包含 50-70重量％的環烯醚萜類化合物或其藥學上可接受的鹽或水合物、20-40重量％的微晶纖維素、5-15重量％的交聯羧甲基纖維素鈉和0. 1-5重量％的硬脂酸鎂。另一種實施方式組合物包含約50-200mg的環烯醚萜類化合物。
在當前優選的本發明實施方式中，藥物組合物包含普通環烯醚萜苷；微晶纖維素作為載體或稀釋劑；交聯羧甲基纖維素鈉作為崩解劑；和硬脂酸鎂作為潤滑劑。在特別優選的實施方式中，環烯醚萜類化合物是莫諾苷和/或馬錢素。
本發明所述的組合物可以按藥劑學方法，加入輔料制備成多種臨床藥物劑型，包括口服制劑或非腸道給藥的劑型。所說的口服制劑選自于片劑、膠囊劑、丸劑、顆粒劑、混懸劑、滴丸、口服液體制劑中的任何一種；所說的非腸道給劑型選自于注射劑、氣霧劑、栓劑或皮下給藥劑型當中的一種。
所述輔料是指藥劑學上可接受的賦形劑，如溶劑、崩解劑、矯味劑、防腐劑、著色劑、粘合劑等。
本發明環烯醚萜類化合物例如莫諾苷和/或馬錢素可用于減輕神經系統髓鞘脫失和炎性細胞浸潤的病理變化，促進髓鞘的形成和修復，減少炎性細胞因子含量，減輕神經功能損傷等；特別用于治療各種原因導致的中樞和周圍神經系統脫髓鞘疾病，包含但不僅于多發性硬化、視神經脊髓炎、急性播散性腦脊髓炎、彌漫性硬化、同心圓硬化、腦白質營養不良、腦橋中央髓鞘溶解癥、急性炎癥性脫髓鞘性多發性神經病、慢性炎癥性脫髓鞘性多發性神經病、缺血-缺氧性病引起的白質腦病、營養缺乏性疾病引起的亞急性聯合變性、病毒感染引起的亞急性硬化性全腦炎或進行性多灶性白質腦病、糖尿病性神經病、系統性紅斑狼瘡的神經病變等。本發明也可用于預防上述疾病。
以下實施例和實驗例進一步說明本發明，但并不構成對本發明所要求保護范圍的限定。
實施例1山茱萸提取物的制備 山茱萸藥材用水煎煮3遍，加水量6倍，時間2小時。合并3次煎煮液，過濾后減壓濃縮，過濾后冷藏備用；取濃縮的山茱萸水提取，上HP20大孔吸附樹脂柱，使藥液流過全柱，依次用離子水、30%、50%乙醇進行梯度洗脫，收集50%乙醇的洗脫液，減壓濃縮成浸膏；將大孔吸附樹脂分離的產物浸膏用乙醇萃取，脫除有機溶劑，濃縮，干燥，獲得固體產物。得率2.5%。
實施例2山茱萸提取物的制備 山茱萸藥材用水煎煮3遍，加水量6倍，時間2小時。合并3次煎煮液，過濾后減壓濃縮，加乙醇調至醇濃度為70%，冷藏24小時，過濾，濾液減壓回收乙醇后，冷藏備用。
取上述山茱萸水提醇沉提取液，上HP20大孔吸附樹脂柱，使藥液流過全柱，依次用去離子水、30%、50%乙醇進行梯度洗脫，收集50%乙醇的洗脫液，減壓濃縮成浸膏。
將大孔吸附樹脂分離的流浸膏上A1203層析柱，用乙醇洗脫進行精制，凍干獲得固體產物，得率2.3%。
經高效液相色譜儀分析，所述產物中莫諾苷含量占25-50 %、馬錢素含量占 25-40 %，二者總含量占50-90 %。
實施例3膠囊劑 本發明山茱萸提取物300g藥用淀粉1000g，混合均勻，裝入1號膠囊，每粒0. 35g， 每次口服1-2粒，每日兩次。
實施例4片劑 本發明山茱萸提取物300g，羧甲基纖維素40g，乳糖50g，硬脂酸鎂4g。將上述組分粉碎，混合，壓片，制成片劑，每片0. 4g，每次3片，每日3次。
實施例5膠囊劑 莫諾苷140g，馬錢素120g，藥用淀粉1000g，混合均勻，裝入1號膠囊，每粒0. 35g， 每次口服1-2粒，每日兩次。
實施例6片劑 莫諾苷140g，馬錢素120g，羧甲基纖維素40g，微晶纖維素50g，硬脂酸鎂4g。將上述組分粉碎，混合，壓片，制成片劑，每片0. 4g，每次3片，每日3次。
實施例7膠囊劑 莫諾苷300g，馬錢素200g，藥用淀粉800g，混合均勻，裝入1號膠囊，每粒0. 20g, 每次口服1-2粒，每日兩次。
實施例8膠囊劑 莫諾苷400g，馬錢素200g，藥用淀粉800g，混合均勻，裝入1號膠囊。
實施例9膠囊劑 莫諾苷300g，馬錢素500g，藥用淀粉800g，混合均勻，裝入1號膠囊。
采用上述實施例6中所述的片劑組合物進行如下實驗。
實驗例1、莫諾苷與馬錢素組合物對實驗性自身免疫性腦脊髓炎(EAE)小鼠模型神經功能評分的影響 小鼠模型制備及給藥實驗性自身免疫性腦脊髓炎(EAE)模型是研究人類多種神經系統脫髓鞘疾病的重要工具。本實驗中EAE小鼠模型的制備是應用髓鞘少突膠質細胞表面糖蛋白M0G35_55免疫雌性C57BL/6J小鼠。即小鼠脊柱背側部皮下注射0. 2mL的M0G35_55抗原配劑，分別于免疫注射的即刻和48小時后腹腔注射0. 2mL百日咳桿菌液。莫諾苷與馬錢素組合物于最后一次注射百日咳桿菌后開始灌胃給藥，連續3周。
神經功能檢測方法每日采用盲法由兩名實驗人員觀察小鼠行為學變化。評分標準0分，無癥狀；1分，尾部張力降低，可見輕度步態笨拙；2分，尾部張力消失，中度步態異常，姿態維持缺乏；3分，肢體力弱；4分，肢體麻痹；5分，瀕死狀態或死亡。
實驗結果EAE模型小鼠于免疫后第8天開始出現運動功能障礙，于第15天左右達到高峰。莫諾苷與馬錢素組合物具有顯著降低模型動物神經功能損傷評分的作用(表 1)，表明環烯醚萜類有利于改善疾病所致肢體麻木、平衡失調、癱瘓等臨床癥狀。
表1、莫諾苷與馬錢素組合物對EAE小鼠模型發病高峰期神經功能損傷的影響
Mean士SD ；##P < 0. 01，模型組與正常對照組相比；*P < 0. 05，**P < 0. 01，用藥組與模型組相比。
實驗例2、莫諾苷與馬錢素組合物對EAE小鼠模型體重降低的影響 實驗目的體重降低反映機體免疫平衡狀態被打破。本實驗研究環烯醚萜類對 EAE小鼠模型體重降低的影響。
實驗方法造模和給藥方法同實驗例1。每日記錄小鼠體重變化。
實驗結果EAE模型小鼠于免疫后第10天左右開始出現體重下降，于第15天左右達到高峰。莫諾苷與馬錢素組合物具有對抗模型動物體重降低的作用(表2)，表明環烯醚萜類可調節機體免疫狀態，對抗因免疫反應所致的體重下降。
表4、莫諾苷與馬錢素組合物對EAE小鼠模型發病高峰期體重降低的影響
Mean士SD ；##P < 0. 01，模型組與正常對照組相比；*P < 0. 05，**P < 0. 01，用藥組與模型組相比。
實驗例3、莫諾苷與馬錢素組合物對EAE小鼠模型神經系統髓鞘脫失的影響 實驗目的本實驗通過Luxol Fast Blue (LFB)染色觀察EAE模型小鼠脊髓髓鞘結構的病理變化，并研究環烯醚萜類對這種病理改變的干預作用。
實驗方法小鼠于實驗第29天經10%水合氯醛麻醉，4%多聚甲醛灌注固定，取脊髓組織行石蠟切片，片厚5 μ m。LFB染色，鏡下觀察，根據如下標準進行評分0分，無髓鞘脫失；1分，一個小范圍髓鞘脫失；2分，2或3個小范圍髓鞘脫失；3分，1到2個大范圍髓鞘脫失；4分，大范圍髓鞘脫失累及20%以上白質區域。
實驗結果EAE模型小鼠脊髓髓鞘脫失現象明顯，而莫諾苷與馬錢素組合物組髓鞘脫失顯著減輕(表3)，表明環烯醚萜類可明顯減輕髓鞘病損，有利于防治各種原因導致的神經系統脫髓鞘病變。
表3、莫諾苷與馬錢素組合物對EAE小鼠模型脊髓髓鞘脫失的影響
Mean士SD ；flflP < 0. 01，模型組與正常對照組相比；< 0. 01，用藥組與模型組相比。
實驗例4、莫諾苷與馬錢素組合物對EAE小鼠模型神經系統炎性細胞浸潤的影響 實驗目的本實驗通過蘇木精-伊紅(HE)染色觀察EAE模型小鼠脊髓組織的病理變化，尤其炎性細胞浸潤情況，并研究環烯醚萜類對該病理改變的干預作用。
實驗方法小鼠于實驗第29天經10 %水合氯醛麻醉，4%多聚甲醛灌注固定，取脊髓組織行石蠟切片，片厚5 μ m。HE染色，鏡下觀察，根據如下標準進行評分0分，無細胞浸潤；1分，脊膜細胞浸潤；2分，1到4個血管周圍小范圍細胞浸潤；3分，5個以上血管周圍小范圍細胞浸潤，或1個以上累及實質的大范圍細胞浸潤；4分，大量細胞浸潤累及20%以上白質區域。
實驗結果EAE模型小鼠脊髓組織出現明顯的炎性細胞浸潤，而給予莫諾苷與馬錢素組合物的模型小鼠炎性細胞浸潤明顯減輕(表4)，表明環烯醚萜類可減輕神經炎性損傷，可用于防治神經系統炎性脫髓鞘疾病。
表4、莫諾苷與馬錢素組合物對EAE小鼠模型脊髓組織炎性細胞浸潤的影響
Mean士SD ；flflP < 0. 01，模型組與正常對照組相比；< 0. 01，用藥組與模型組相比。
實驗例5、莫諾苷與馬錢素組合物對EAE小鼠模型炎性細胞因子含量的影響 實驗目的白細胞介素I(IL-I)和IL-6是重要的炎性細胞因子，對炎癥反應有促進作用。本實驗應用酶聯免疫法(ELISA)檢測EAE小鼠模型血清中IL-I和IL-6含量，并觀察環烯醚萜類對其含量的影響。
實驗方法小鼠戊巴比妥鈉麻醉，腹主動脈取血，室溫靜置2小時，3000轉/分鐘離心20分鐘，取上清，-80°C保存備用。操作方法嚴格按照ELISA試劑盒說明書中步驟。酶標儀450nm測其吸光度。根據測得的OD值在標準曲線上計算出相應IL-I和IL-6含量。
實驗結果EAE模型組小鼠血清IL-I和IL_6含量明顯高于正常對照組；而莫諾苷與馬錢素組合物能減少模型小鼠血清中IL-I和IL-6含量(表5)，表明環烯醚萜苷類可抑制炎癥反應。
表5、莫諾苷與馬錢素組合物對EAE小鼠模型血清中IL-I和IL_6含量的影響
Mean士SD;#P < 0.05，##P < 0. 01，模型組與正常對照組相比；*P < 0.05，**P <0.01，用藥組與模型組相比。
實驗例6、莫諾苷與馬錢素組合物對EAE小鼠模型神經系統少突膠質細胞含量的影響 實驗目的髓鞘是由少突膠質細胞的突起形成。CNPase (環核苷酸-3'磷酸水解酶)是成熟少突膠質細胞的標志蛋白。本實驗通過Western blot法檢測EAE模型小鼠脊髓中CNPase含量，并研究環烯醚萜類對其表達的影響。
實驗方法小鼠麻醉后處死，冰上取新鮮脊髓，冰上裂解提取總蛋白，制備Western blot樣品，加CNPase—抗孵育，加相應二抗，ECL顯色，Kodak膠片曝光。用Image J軟件對圖片進行分析并經肌動蛋白標化。
實驗結果與正常對照組相比，EAE模型小鼠脊髓CNPase條帶明顯變細，整合灰度明顯降低，提示少突膠質細胞數量減少；而莫諾苷與馬錢素組合物用藥組小鼠CNPase條帶變粗，整合灰度明顯增加(表6)。表明環烯醚萜類可明顯增加成熟少突膠質細胞數量，有利于髓鞘的形成。
表6、莫諾苷與馬錢素組合物對EAE小鼠模型脊髓少突膠質細胞的影響
Mean士SD ;#P < 0. 05，模型組與正常對照組相比；*P < 0. 05，用藥組與模型組相比。
實驗例7、莫諾苷與馬錢素組合物對實驗性自身免疫性腦脊髓炎(EAE)大鼠模型神經功能損傷的影響 大鼠模型制備及給藥本實驗中EAE大鼠模型的制備是使用豚鼠脊髓和大腦灰質勻漿液與完全弗氏佐劑乳化后于尾根部皮下多點免疫雌性Lewis大鼠。莫諾苷與馬錢素組合物灌胃給藥3周。
神經功能檢測方法每日采用盲法由兩名實驗人員觀察大鼠行為學變化。評分標準0分，無癥狀；1分，尾部張力消失，可見輕度步態笨拙；2分，雙后肢無力，步行困難；3 分，雙后肢癱瘓；4分，雙后肢癱瘓及前肢無力；5分，四肢癱瘓；6分，瀕死狀態或死亡。
實驗結果EAE模型大鼠于免疫后第8天開始出現運動功能障礙，于第12天達到高峰。莫諾苷與馬錢素組合物具有顯著降低模型動物神經功能損傷評分的作用(表7)，表明環烯醚萜類有利于改善疾病所致肢體麻木、平衡失調、癱瘓等臨床癥狀。
表7、莫諾苷與馬錢素組合物對EAE大鼠模型發病高峰期神經功能損傷的影響 組別動物數神經功能損傷評分
Mean士SD ；flflP < 0. 01，模型組與正常對照組相比；*P < 0. 05，**P < 0. 01，用藥組與模型組相比。
實驗例8、莫諾苷與馬錢素組合物對EAE大鼠模型體重降低的影響 實驗目的體重降低反映機體免疫平衡狀態被打破。本實驗應用大鼠EAE模型研究環烯醚萜類對模型動物體重降低的影響。
實驗方法造模和給藥方法同實驗例7。每日觀察大鼠體重的變化。
實驗結果EAE模型大鼠于免疫后一周左右開始出現體重下降，于第12天達到高峰。莫諾苷與馬錢素組合物具有顯著對抗模型動物體重降低的作用(表8)，表明環烯醚萜類有利于對抗模型動物因免疫反應所致的體重降低。
表8、莫諾苷與馬錢素組合物對EAE大鼠模型發病高峰期體重降低的影響
Mean士SD ；flflP < 0. 01，模型組與正常對照組相比；< 0. 01，用藥組與模型組相比。
綜上所述，環烯醚萜類化合物例如莫諾苷和/或馬錢素在多種實驗性自身免疫性腦脊髓炎(EAE)動物模型上表現出明顯的減輕神經系統髓鞘脫失和炎性細胞浸潤的病理變化，增高少突膠質細胞數量從而促進髓鞘的形成和修復，減少炎性細胞因子含量，降低神經功能損傷評分，抑制因免疫反應所致的體重降低等作用，表明環烯醚萜類化合物具有防治各種原因導致的神經系統脫髓鞘疾病的用途。
權利要求
1.含有環烯醚萜類化合物的組合物在制備減輕或修復神經系統髓鞘病損相關疾病的 藥物中的用途。
2.按照權利要求1的用途，其中所述環烯醚萜類化合物為莫諾苷或其同系物或類似 物，和/或馬錢素或其同系物或類似物。
3.按照權利要求2的用途，其中所述莫諾苷占組合物的25-50%w/w，馬錢素占組合物 的 25-40% w/w。
4.按照權利要求1的用途，其中所述組合物為山茱萸提取物，其中莫諾苷占所述提取 物總重量的25-50wt%，馬錢素占所述提取物總重量的25-40wt%。
5.按照權利要求1-4任一項的用途，其中所述減輕神經系統髓鞘病損用于治療各種原 因導致的出現髓鞘病損的疾病，或用于治療神經系統脫髓鞘疾病。
6.按照權利要求5的用途，其中所述疾病為多發性硬化、視神經脊髓炎、急性播散性腦 脊髓炎、彌漫性硬化、同心圓硬化、腦白質營養不良、腦橋中央髓鞘溶解癥、急性炎癥性脫髓 鞘性多發性神經病或慢性炎癥性脫髓鞘性多發性神經病，或者所述疾病為缺血_缺氧性病 引起的白質腦病、營養缺乏性疾病引起的亞急性聯合變性、病毒感染引起的亞急性硬化性 全腦炎或進行性多灶性白質腦病。
7.按照權利要求5或6的用途，其中所述疾病為糖尿病性神經病或系統性紅斑狼瘡。
8.一種治療或預防神經系統脫髓鞘疾病的藥物組合物，其特征在于其含有權利要求 1-4任一項中所述的組合物和任選的可藥用載體。
9.一種治療或預防神經系統脫髓鞘疾病的方法，包括向需要的患者施用治療有效量的 權利要求1-4任一項中所述的組合物，或含有所述組合物的藥物組合物。
10.按照權利要求8所述的藥物組合物或按照權利要求9所述的方法，其中所述疾病為 權利要求5-7任一項中所述的任一疾病。
全文摘要
本發明公開了含有環烯醚萜類化合物例如莫諾苷和馬錢素的組合物，其用于制備防治神經系統脫髓鞘疾病的藥物的用途，以及用其治療與神經系統髓鞘病損相關疾病的方法。
文檔編號A61P19/04GK101843630SQ20101019816
公開日2010年9月29日 申請日期2010年6月11日 優先權日2010年6月11日
發明者李林, 尹琳琳, 張蘭, 王文, 張如意 申請人:首都醫科大學宣武醫院